Summary
Hittil er utviklingen av identifikasjonsmetoder for parathyroidkjertel (PG) begrenset av mangel på dyremodeller i preklinisk forskning. Her etablerer vi en enkel og effektiv rottemodell for intraoperativ PG-avbildning og evaluerer effektiviteten ved å bruke jernoksid nanopartikler som et nytt PG-kontrastmiddel.
Abstract
Parathyroid kjertel (PG) identifikasjon er et kritisk udekket behov i thyroidectomy. Identifiseringen av PG er utfordrende i skjoldbrusk kirurgi som det er lik i fargen til skjoldbruskkjertelen. Mangelen på effektive dyremodeller i preklinisk forskning er en alvorlig begrensning for utviklingen av PG-identifikasjonsteknikker. Denne protokollen tillater etablering av en enkel og effektiv rottemodell for PG-identifikasjon. I denne modellen injiseres svarte jernoksid nanopartikler (IONP) lokalt i skjoldbruskkjertelen og diffunderer raskt i skjoldbruskkjertelen, men ikke PG. En negativt farget PG og en positivt farget skjoldbruskkjertel kan lett identifiseres med det blotte øye uten å kreve eksterne mikroskoper. Posisjonen til PG kan identifiseres ved å øke fargekontrasten mellom skjoldbruskkjertelen og PG, basert på fargen på de svarte IONP-ene. Denne rottemodellen er billig og praktisk for PG-identifikasjon, og IONP-ene er et nytt PG-kontrastmiddel.
Introduction
Biskjoldbruskkjertelen (PG) er små, ovalformede endokrine kjertler som ligger i nakken hos mennesker og andre vertebrater, som produserer og utskiller parathyroidhormoner for å regulere og balansere kalsium- og fosfornivåer i blodet og i bein1. Mennesker har vanligvis to par PG plassert bak skjoldbruskkjertelen lobes i variable steder; Størrelsen på menneskelig PG måler vanligvis 6 mm x 4 mm x 2 mm, med en vekt på ca. 35-40 mg2. Fjerning eller skade på PG forårsaker hypoparathyroidism (HP), en endokrin lidelse preget av hypokalsemi og lave eller uoppdagelige nivåer av parathyroidhormoner, noe som forårsaker et bredt spekter av symptomer fra kramper-lignende spasmer til misdannede tenner til kroniske nyresykdommer. Noen av disse komplikasjonene er dødelige (f.eks. hjertesvikt og anfall)3,4,5; Dermed er PG viktig for å regulere kroppens metabolisme og opprettholde livet.
HP er en av de vanligste komplikasjonene etter fremre nakkekirurgi, spesielt i skjoldbruskektomi, en veletablert kurativ behandling for skjoldbruskkjertelkreft, som er den vanligste endokrine kreften over hele verden 6,7. Post-thyroidectomy HP er hovedsakelig forårsaket av direkte traumer, iskemi eller fjerning av PG i kirurgi på grunn av en alvorlig mangel på evne til pålitelig å diskriminere PG fra skjoldbruskkjertelen lobes og andre omkringliggende vev (f.eks lymfeknuter og perifere fettpartikler) i sanntid i operasjonsrommet. I 2021 rapporterte Barrios et al. en gjennomsnittlig PG-feilseksjonsrate på 22.4% innen 1,114 thyroidectomy tilfeller, og til og med erfarne kirurger som hadde en minimum feilrate på 7.7%8. Slike høye PG-feilseksjonsrater er i samsvar med andre lignende rapporter 9,10,11. Dermed er feil paratyreoidektomi en uavhengig risikofaktor for forbigående og permanent postoperativ HP.
Utvikling av effektive intraoperative PG-identifikasjonsmetoder holder nøkkelen til å takle dette kritiske udekkede medisinske behovet; Det har imidlertid blitt sterkt begrenset av mangelen på dyremodeller i preklinisk forskning. Til dags dato har de fleste intraoperative PG-identifikasjonsundersøkelser blitt utført på menneskelige pasienter og store dyr (f.eks. hunder)12, som er dyre og vanskelige å motta etisk godkjenning, utvider fagnumre og gjentar tester. I mellomtiden har musen, den mest brukte virveldyrmodellen i biologisk forskning, ekstremt liten PG, med en størrelse på mindre enn 1 mm13. På grunn av denne begrensningen har mus PG-modeller sjelden blitt brukt i intraoperativ PG-identifikasjonsforskning.
Dette papiret rapporterer etableringen av en enkel, grei og effektiv rottemodell for intraoperative PG-identifikasjonsstudier. Vi undersøkte bruken av innfødte Sprague-Dawley (SD) rotter uten kirurgiske modifikasjoner eller genteknologi som en pålitelig dyremodell for testing av et PG-bildekontrastmiddel, IONP, i en skjoldbruskektomioperasjon. Denne rottemodellen demonstrerer en svært lik fysiologisk struktur av PG og det omkringliggende mikromiljøet til mennesker, og størrelsen på rotte PG er stor nok til å bli visuelt oppdaget i forhold til musene. De fleste rotter har en PG på hver side av skjoldbruskkjertelen. Enkelheten og effektiviteten til denne rottemodellen har blitt demonstrert ved å utføre intraoperativ IONP-forbedret PG-avbildning i skjoldbruskektomikirurgi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Institute of Basic Medicine and Cancer, Chinese Academy of Sciences. Dette er en ikke-overlevelse kirurgi.
1. Dyr
- Bruk en 6-8 uker gammel kvinnelig SD-rotte, som veier 250 g, for intraoperativ PG-avbildning.
2. Anestesi
- Slå på anestesimaskinen.
- Før du begynner, må du sørge for at isoflurannivået er fullt i anestesifordamperen. Slå deretter på oksygenet og sett strømningshastigheten til 0,4-0,8 l / min. Indusere anestesi med 3-5% isofluran og opprettholde på 2% isofluran (strømningshastighet: 0,4-0,8 l/min).
- Sett SD-rotten inn i esken til anestesimaskinen og velg kanalmodellen for å starte dyrebedøvelse.
- Vær oppmerksom på rotteaktiviteten i esken. Når rotta faller inn i koma, flytt den til nesekeglen for å opprettholde anestesi (ubevisst liggende stilling uten smerterefleks og hornhinnerefleks).
- Bruk anestesimasken til å dekke nesen til rotta og sett anestesimaskinen i maskemodus for å holde dyret under anestesi under operasjonen.
3. Holdning og fiksering
- Overfør den bedøvede rotten til et kirurgisk drap på et operasjonsbord. Plasser en forvarmet varmepute under dyret for å opprettholde dyrets kroppstemperatur under operasjonen.
- Bruk gummibånd for å feste rottens lemmer til operasjonsbordet. Legg en sylindrisk pute laget av drap under rottens skulder for å lene hodet tilbake, helt utsette nakkeområdet.
- Påfør kunstig tårsalve på begge rottens øyne for å forhindre tørrhet under anestesi.
4. Hårfjerning
- Påfør hårfjerningskrem på nakkeområdet: opp til det submandibulære rommet, ned til xiphoidprosessen, og på begge sider til utsiden av sternocleidomastoid-muskelen.
- Etter 3 minutter, tørk forsiktig håret og hårfjerningskrem med et vev.
5. Sterilisering
- Bruk en Iodophor bomullsdott for å desinfisere operasjonsområdet 3 ganger fra midten av nakken til det omkringliggende området. Desinfiser bare området der håret ble fjernet.
6. Kirurgisk draplegging
- Bruk en kirurgisk drapering for å dekke operasjonsområdet på rottens nakke. Hold hullet på det kirurgiske drapet på linje med desinfeksjonsområdet til dyret.
7. Snitt
- Bekreft anestesiens operasjonsplan via mangel på tåklemmerefleksen før du gjør snittet. Deretter passer bladet inn i skalpellen og bruker skalpellen til å lage et langsgående snitt i den fremre midtlinjen av rottens nakke. Sørg for at snittlengden er ca. 5 cm og bare i dermis.
8. Disseksjon av subkutant vev fra fremre cervikale muskel
- Løft huden langs begge sider av snittet.
- Bruk en saks til å klippe i lengderetningen langs linea alba cervicalis.
- Bruk tang for å skille sternohyoid muskel og sternothyroid muskel.
9. Fest de fremre nakkemusklene til begge sider
- Bruk vaskulær tang for å klemme den separerte sternohyoidmuskelen og sternothyroidmuskelen foran nakken og trekk det klemte vevet utenfor.
- Bruk en retractor eller nålen til å passere suturen (3-0 #) gjennom det klemmede vevet, lage en knute og fest suturen til operasjonsbordet.
10. Lokalisering av skjoldbruskkjertelen
- Finn skjoldbrusk og cricoid brusk som øvre grense i operasjonsområdet. Identifiser skjoldbrusk basert på skjoldformen og cricoid brusk basert på ringformen.
- Finn luftrøret som nedre grense i operasjonsområdet. Se etter luftrøret foran og midt i nakken, basert på den rørformede bruskringformen.
- Finn skjoldbruskkjertelen mellom øvre og nedre grenser - en rød kjertel i form av en sommerfugl på motsatt side av luftrøret.
11. Visuell identifikasjon av PG
- Finn PG på øvre og ytre sider av skjoldbruskkjertelen. Se etter to PG i en fusiform form på ca. 1,2-2 mm i lengde og 1,0-1,5 mm i bredde som er rødlige, men lettere enn den omkringliggende skjoldbruskkjertelen med en viss grense.
- Ta et frontalfotografi av PG med luftrøret, skjoldbruskkjertelen og strupehodet for å kvantitativt sammenligne effekten av IONP før og etter injeksjon.
- Dissekere baksiden av spiserøret, og bruk deretter retractoren til å eksponere høyre side av PG. Ta et bilde av PG på høyre side med skjoldbruskkjertelen og luftrøret.
- Bytt retractor for å eksponere motsatt side av PG og ta et venstre bilde av dem med skjoldbruskkjertelen og luftrøret.
12. Skjoldbrusk injeksjon av IONP
- Bruk en insulinsprøyte til å injisere 10 μL IONPs suspensjon lokalt (20 mg/ml i fosfatbufret saltvann) inn i midten av skjoldbruskkjertelen. Trykk forsiktig på injeksjonsstedet med gasbind i 5 s.
13. Identifisering av PG etter injeksjon av IONP
- Etter injeksjon, observer den raske diffusjonen av IONP i skjoldbruskkjertelen, men ikke PG, da det negativt flekker PG og skiller dem fra den omkringliggende skjoldbruskkjertelen.
- Ta et frontbilde av den negativt fargede PG sammen med luftrøret, skjoldbruskkjertelen og strupehode.
- Ta bilder på venstre og høyre side av den negativt fargede PG ved å bruke de samme prosedyrene som nevnt ovenfor.
14. Reseksjon av hals og luftrør med skjoldbruskkjertelen og PG
- Når rottene har inhalert overflødig isofluran (5 % isofluran i mer enn 5 minutter) og er under dyp anestesi, avlives de med intrakardial injeksjon av 0,5 ml mettet kaliumkloridoppløsning.
- Postmortem, fjern halsen, luftrøret, skjoldbruskkjertelen og PG.
- Under en avtrekkshette, plasser de fjernede hals-, luftrør-, skjoldbruskkjertel- og PG-prøvene i 4% paraformaldehydoppløsning i 24 timer.
15. Histopatologiske studier
- Dehydrer vevet og legg dem inn i parafin. Skjær i 5 μm tykke seksjoner. Stek seksjonene ved 37 °C i ovn over natten og ved 65 °C i 1 time.
- Beis seksjonene med hematoksylin og eosin (H&E) etter vask 3 x 5 min med 75%, 95%, 100% gradientalkohol og vannvask ved romtemperatur.
- Få patologer til å undersøke H&E-fargede seksjoner under et lysmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne dyremodellen snittet vi kirurgisk halsen til en SD-rotte for å eksponere luftrøret, strupehodet og det omkringliggende vevet. Deretter var skjoldbruskkjertelen visuelt plassert på begge sider av luftrøret; Den er sommerfuglformet og ca. 3 mm x 5 mm i størrelse. Et par PG er vanligvis plassert i den øvre delen av skjoldbruskkjertelen, og fargen deres er svært lik den for skjoldbruskkjertelen, noe som gjør det ekstremt vanskelig å skille dem med det blotte øye (figur 1).
Etter injeksjon diffunderer kontrastmiddelet (figur 1 og figur 2), IONP, lett i skjoldbruskkjertelen og flekker den svart, men kan ikke infiltrere PG på grunn av deres høye vevstetthet. Den ubalanserte fordelingen av IONP mellom PG og skjoldbruskkjertelen gir en slående kontrast, som lett kan visualiseres med det blotte øye uten å kreve eksterne instrumenter. Figur 2 viser representative bilder av PG negativt farget av IONP i venstre skjoldbruskkjertel hos rotter, hvor kontrasten mellom PG og skjoldbruskkjertelen var bemerkelsesverdig, og størrelsen på rotte PG ble bestemt til å være ca. 2 mm x 1 mm.
Postmortem ble strupehodet hos rotter og tilstøtende luftrør, spiserør, thyreoidea og PG resektert for histopatologisk farging. Serielle seksjoner av vevet som inneholdt PG ble oppnådd for å utføre H&E-farging. Disse H&E-fargede bildene (figur 3) viste at PG er beriket med tett justerte sjefceller, mens skjoldbruskkjertelen har mange løse lumen som indikerer mye lavere vevstetthet.
Figur 1: Den fysiologiske strukturen til PG og deres mikromiljø. Skjematisk illustrasjon av human PG og skjoldbruskkjertel ved injeksjon før (A) og etter IONP (B). Representative biopsibilder av fremre cervikale vev fra rotter, inkludert PG, skjoldbruskkjertel, luftrør og strupehode ved injeksjon før (C) og etter IONP (D). Ytterligere bilder er publisert i vår tidligere studie15. Forkortelser: PG = biskjoldkjertler; IONP = jernoksid nanopartikler; IONP10 = IONP på 10 nm diameter; Skalaen er i centimeter (cm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Intraoperativ IONP-forbedret PG-identifikasjon. Representative bilder av ubehandlet (A) og IONP-injisert (B) skjoldbruskkjertelen hos rotter ved injeksjon før og etter IONP. Effekten av IONPs-forsterket PG-identifikasjon er konsistent i reproduserbar ved injeksjon før (C) og etter IONP (D). Forkortelser: PG = biskjoldbruskkjertelen; IONP = jernoksid nanopartikler; IONP10 = IONP på 10 nm diameter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Histologisk analyse av en IONP-injisert skjoldbruskkjertel og dens mikromiljø. (A) Representative ex vivo fotografier av fremre cervikale vev fra rotter ved injeksjon etter IONP. (B) Representative H&E-fargede bilder av rotte PG. Skala bar = 50 μm. (C) Zoomet inn bilde av den stiplede røde boksen i panel B. Skala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerer en IONPs-guidet negativ bildebehandlingsteknikk av rotte PG ved bruk av svarte IONP, som ble injisert lokalt i midten av skjoldbruskkjertelen og diffust i skjoldbruskkjertelen, men ikke PG. Det muliggjør tydelig identifisering av PG med blotte øyne uten hjelp av mikroskop. Selv om transgene mus med grønt fluorescerende protein selektivt uttrykt i PG har blitt rapportert13, er modellen beskrevet i denne artikkelen enklere å utføre. Det tar bare ~ 1 min per rotte etter injeksjon, og en klar forskjell mellom skjoldbruskkjertelen og PG kan observeres med blotte øyne.
I tillegg er en annen fordel med denne modellen at kostnadene og driftsvanskelighetene er betydelig lavere for denne rottemodellen enn for store dyremodeller (f.eks. hunder12) som for tiden brukes i prekliniske studier for å evaluere nye PG-identifikasjonsmetoder. Den gjennomsnittlige kostnaden for en SD-rotte er nær den for en BALB / C-mus, som er over 30 ganger billigere enn en hund. Denne rimelige fordelen med rottemodellen gjør det mulig å utvide fagtall og gjenta tester i preklinisk forskning, noe som er vanskelig med store dyremodeller. I mellomtiden er den typiske kroppsvekten til en SD-rotte 300-350 g, som også er over 66 ganger lettere enn en hund (22-23 kg)14.
En så stor kroppsvektforskjell reduserer operasjonsvanskeligheten i rottemodellen enormt over store dyremodeller, siden utførelse av skjoldbruskektomi på store dyr som hunder krever mer kompliserte anestesi og kirurgiske prosedyrer, noe som gjør det vanskeligere og teknisk utfordrende. Kravet til kirurgi (grunnleggende kirurgiske ferdigheter kreves) utgjør en begrensning for denne modellen. IONP brukt i denne studien har vist utmerket biosikkerhet og biologisk nedbrytbarhet som tidligere rapportert15. Til syvende og sist håper vi at denne metoden for negativ avbildning av rotte PG ved hjelp av IONP kan gi en enkel og effektiv dyremodell for prekliniske studier som involverer PG-identifikasjon, og dermed lette utviklingen av nye PG-identifikasjonsteknikker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
PG og WZ er medoppfinnere av en patentsøknad innlevert av Cancer Hospital ved University of Chinese Academy of Sciences (Zhejiang Cancer Hospital) basert på prosjektet. De øvrige forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (NSFC) (82172598), Natural Science Foundation of Zhejiang Province, Kina (LZ22H310001), 551 Health Talent Training Project of Health Commission of Zhejiang Province, Kina, og Medical and Health Science and Technology Project of Zhejiang Province, Kina (2021KY110).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| alcohol | Li feng | 9400820067 | |
| anesthesia machine | RWD Company | R520IE | Machine number |
| blade | Daopian | TB-JZ-10# | |
| cylindrical pillow | made by ourselves | ||
| depilatory cream | Nair | TMG-001 | |
| electronic scale | Hong xingda | CN-HXD2 | |
| eosin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-2 | |
| erythromycin | Shuang ji (Beijing, China) | 200409 | |
| gauze | Fulanns | YY0331-2006 | |
| heating pad | Johon (ShenZhen,China) | JH-36-2006 | |
| hematoxylin | Thermo Fisher (Waltham, USA). | C0105S-1 | |
| insulin injection needle | Jiangyin NanquanMacromolecule | 20170702 | |
| iodophor cotton ball | HOYON | 19-6007 | |
| iron oxide nanoparticle solution | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag9110-05 | |
| isoflurane | Sigma Aldrich (St Louis USA). | 21112801 | |
| needle holder | Meijun | MH0587 | |
| operation table | BioJane | BJ-P-M | |
| paraformaldehyde solution | Biosharp | 21269333 | |
| rubber | G-CLONE | XT41050 |
|
| scanning machine | Olympus | Slideview VS200 | |
| surgical forceps | Suping | SPHC-0676 | |
| surgical knife handle | Aladdin | S3052-06-1EA | |
| surgical retractor | TOCYTO | 18-4010 | |
| surgical scissors | Suping | SPHC-0795 | |
| surgical towel | Along technology | YCKJ-RJ-036205 | |
| suture | Ethicon | SA84G | |
| suture with needle | Jinhuan (Shanghai,China) | F301 | |
| vascular forceps | Along technology | YCKJ-RJ-016218 | |
| Water Bath-Slide Drier | Hua su (Jinhua, China) | HS-1145 |
References
- Cope, O., Donaldson, G. A. Relation of thyroid and parathyroid glands to calcium and phosphorus metabolism. Study of a case with coexistent hypoparathyroidism and hyperthyroidism. The Journal of Clinical Investigation. 16 (3), 329-341 (1937).
- Mansberger, A. R., Wei, J. P. Surgical embryology and anatomy of the thyroid and parathyroid glands. Surgical Clinics of North America. 73 (4), 727-746 (1993).
- Koch, A., Hofbeck, M., Dorr, H. G., Singer, H. Hypocalcemia-induced heart failure as the initial symptom of hypoparathyroidism. Zeitschrift für Kardiologie. 88 (1), 10-13 (1999).
- Shoback, D. M., et al. Presentation of hypoparathyroidism: etiologies and clinical features. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 101 (6), 2300-2312 (2016).
- Arneiro, A. J., et al. Self-report of psychological symptoms in hypoparathyroidism patients on conventional therapy. Archives of Endocrinology Metabolism. 62 (3), 319-324 (2018).
- Olson, E., Wintheiser, G., Wolfe, K. M., Droessler, J., Silberstein, P. T. Epidemiology of thyroid cancer: a review of the national cancer database, 2000-2013. Cureus. 11 (2), 4127 (2019).
- Du, L., et al. Epidemiology of thyroid cancer: incidence and mortality in China, 2015. Frontiers in Oncology. 10, 1702 (2020).
- Barrios, L., et al. Incidental parathyroidectomy in thyroidectomy and central neck dissection. Surgery. 169 (5), 1145-1151 (2021).
- Sitges-Serra, A., et al. Inadvertent parathyroidectomy during total thyroidectomy and central neck dissection for papillary thyroid carcinoma. Surgery. 161 (3), 712-719 (2017).
- Sakorafas, G. H., et al. Incidental parathyroidectomy during thyroid surgery: an underappreciated complication of thyroidectomy. World Journal of Surgery. 29 (12), 1539-1543 (2005).
- Sahyouni, G., et al. Rate of incidental parathyroidectomy in a pediatric population. OTO Open. 5 (4), (2021).
- Erickson, A. K., et al. Incidence, survival time, and surgical treatment of parathyroid carcinomas in dogs: 100 cases (2010-2019). Journal of the American Veterinary Medical Association. 259 (11), 1309-1317 (2021).
- Bi, R., Fan, Y., Luo, E., Yuan, Q., Mannstadt, M. Two techniques to create hypoparathyroid mice: parathyroidectomy using GFP glands and diphtheria-toxin-mediated parathyroid ablation. Journal of Visualized Experiments. (121), e55010 (2017).
- Soulsby, S. N., Holland, M., Hudson, J. A., Behrend, E. N. Ultrasonographic evaluation of adrenal gland size compared to body weight in normal dogs. Veterinary Radiology & Ultrasound. 56 (3), 317-326 (2015).
- Zheng, W. H., et al. Biodegradable iron oxide nanoparticles for intraoperative parathyroid gland imaging in thyroidectomy. PNAS Nexus. 1 (3), 087 (2022).
