Summary
我们提出了一种基于石墨烯阵列的脑映射程序，以减少侵入性并提高时空分辨率。基于石墨烯阵列的表面电极表现出长期的生物相容性、机械灵活性和在卷曲大脑中用于大脑映射的适用性。该协议允许同时和顺序构建多种形式的感官图谱。
Abstract
皮质图表示大脑皮层中对感觉运动刺激的位置依赖性神经反应的空间组织，从而能够预测生理相关行为。各种方法，如穿透电极、脑电图、正电子发射断层扫描、脑磁图和功能性磁共振成像，已被用于获得皮质图。然而，这些方法受到时空分辨率差、信噪比（SNR）低、成本高、非生物相容性或对大脑造成物理损害的限制。本研究提出了一种基于石墨烯阵列的体感映射方法，作为皮质电图的一个特点，该方法具有优异的生物相容性、高时空分辨率、理想的信噪比和最小的组织损伤，克服了以前方法的缺点。本研究证明了石墨烯电极阵列在大鼠体感映射中的可行性。所提出的方案不仅可以应用于躯体感觉皮层，还可以应用于其他皮层，例如听觉、视觉和运动皮层，为临床实施提供先进的技术。
Introduction
皮质图是一组局部斑块，表示大脑皮层中对感觉运动刺激的反应属性。它们是神经网络的空间形成，能够预测感知和认知。因此，皮质图可用于评估对外部刺激的神经反应和处理感觉运动信息1,2,3,4。有创和非侵入性方法可用于皮质映射。最常见的侵入性方法之一是使用皮质内（或穿透）电极来映射5,6,7,8。
使用穿透电极评估按需高分辨率皮质图面临着几个障碍。该方法太费力，无法获得像样的地图，而且侵入性太强，无法在临床上使用，从而阻碍了进一步发展。脑电图 （EEG）、正电子发射断层扫描 （PET）、脑磁图 （MEG） 和功能性磁共振成像 （fMRI） 等最新技术越来越受欢迎，因为这些技术侵入性较小且可重复。然而，鉴于其高昂的成本和解决率低，它们在有限数量的案例中使用9,10,11。近年来，具有优异信号可靠性的柔性表面电极引起了广泛的关注。基于石墨烯的表面电极表现出长期的生物相容性和机械灵活性，在复杂的大脑中提供稳定的记录12,13,14,15,16。我们小组最近开发了一种基于石墨烯的多通道阵列，用于皮质表面的高分辨率记录和位点特异性神经刺激。这项技术使我们能够长时间跟踪感官信息的皮层表征。
本文介绍了使用 30 通道石墨烯多电极阵列获取体感皮层大脑图所涉及的步骤。为了测量大脑活动，将石墨烯电极阵列放置在皮层的硬膜下区域，同时用木棍刺激前爪，前肢，后爪，后肢，躯干和胡须。记录体感区域的体感诱发电位 （SEP）。该协议也可以应用于其他大脑区域，例如听觉，视觉和运动皮层。
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Protocol
所有动物处理程序均已获得仁川国立大学机构动物护理和使用委员会的批准（INU-ANIM-2017-08）。
1. 动物手术准备
注意：使用Sprague Dawley Rat（8-10周大）进行本实验，没有性别偏见。
- 腹膜内用90mg / kg氯胺酮和10mg / kg甲苯噻嗪混合物麻醉大鼠。为了在整个手术过程中保持所需的麻醉深度，当大鼠出现醒来迹象时，提供补充 45 mg/kg 氯胺酮和 5 mg/kg 甲苯噻嗪鸡尾酒。
- 确认大鼠处于深度麻醉状态，并定期检查身体反射，如脚趾捏、尾捏和角膜反射。
- 使用修剪器剃掉眼睛和耳朵后面的毛发。
- 在眼睛上涂抹眼药膏，以防止它们变干。
2. 皮质表面暴露手术
- 用立体定位适配器将鼠头固定在立体定位装置上。为了在手术过程中保持37°C的体温，将大鼠放在温控加热垫上。
- 用酒精和聚维酮碘交替擦洗三次对剃光区域进行消毒。
- 用镊子牢牢抓住头皮，用注射器将0.1mL利多卡因（2%）直接注射到头皮中，诱导手术区域的局部麻醉。
- 用手术刀做一个2-3厘米长的中线切口，拉开头皮，露出头骨。
- 用蚊子镊子夹住头皮，露出头骨。
- 用镊子刮擦颅骨表面以去除骨膜。
- 钝性解剖枕骨上的肌肉，以暴露脊髓顶部轴上方的大池。
- 用刀片切开大池排出脑脊液，并在大池切口内放无菌纱布，不断吸收脑脊液，防止脑水肿，尽量减少炎症。
- 用铅笔在头骨上标记一个矩形窗口，从右半球前膛开始，前后轴测量 3 毫米，右侧向测量 6 毫米。
注意：标记必须与中线保持 1 mm 的距离，以避免上矢状窦破裂。 - 根据立体定位坐标钻标记区域，并用骨头去除头骨。
- 要去除硬脑膜，请将 26 G 针的尖端弯曲至 90°，在硬脑膜上开一个孔，提起硬脑膜，将镊子插入该孔中，然后用镊子撕裂。
- 将盐水润湿的纱布放在躯体感觉皮层上，以防止其变干。
3. 连接到记录系统的石墨烯电极阵列的制备
- 准备带有预兆连接器的石墨烯电极阵列。
- 通过应用盐溶液分离石墨烯多电极阵列而不会造成损坏。
- 从连接器上拆下参考线和接地线的外壳。
- 将带有石墨烯电极阵列的头部平台连接到连接器。
- 将连接到头级的接口电缆插入录制系统。
- 将石墨烯电极阵列复合物固定到立体定位臂中。
- 为了捕获来自所有通道的神经信号，请按照预定的立体定位坐标将阵列放置在躯体感觉皮层上，没有任何弯曲。
- 将参考线放在枕骨后面的组织下方，并将地线连接到接地的光学工作台。
4. 物理刺激和记录 SEP 以进行映射
- 打开神经信号记录软件。
- 设置记录软件环境：（1）设置SEP和陷波滤波器的采样率（60或50 Hz，家用电源的频率）以消除电源线中的噪声。
- 对于晶须映射，用细棍弯曲晶须。
- 经常用木棍戳前爪、前肢、后爪、后肢和躯干进行身体映射。
- 在数据采集系统中记录指定时间的神经信号。
5. 动物安乐死
- 在所有记录程序之后，使用>5%异氟醚麻醉处死大鼠并进行宫颈解剖。
6. 皮质映射的SEP测量
- 打开代号为 read_Intan_RHS2000_file.m 的 MATLAB 进行信号分析。
注意：read_Intan_RHS2000_file.m 可以从“https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software”下载。 - 单击 “运行” 按钮，选择文件扩展名为“.rhs”的录制文件，然后等待文件被处理和读取。
- 输入命令“plot （t， amplifier_data（”通道号“，:)）”，创建记录数据的二维线图，找到标准必要专利，并计算所有通道中标准必要专利的幅度。
注：在“频道号”处输入频道号。例如，“plot（t， amplifier_data（1，:)）”创建通道 1 的 2D 线图。此外，当实验者计算响应的幅度时，选择从每个通道记录的响应。 - 根据标准必要专利的振幅，用不同的色调为网格着色来获取数据。
注意：MATLAB 命令“imagesc”有助于更快地获取地形图。
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Representative Results
该协议描述了石墨烯多通道阵列如何安装在大脑表面。通过获取对物理刺激的神经反应并计算反应的幅度来构建体感图。 图1 显示了该实验的示意图。
图2A 显示了石墨烯电极阵列的结构特征。电极之间有基板的通孔。这些孔有助于电极牢固地接触皮质表面（图2B）。电极与皮层的强粘附有助于以更少的噪音记录神经信号。
图2C （左）显示了通过刺激以不同颜色编码的胡须，躯干，爪子和四肢获得的位置依赖性神经反应。用躯体感觉皮层图中每种颜色大小的实际比例绘制大鼠人形，即大鼠的微型身体（图2C，右）。
图2D 显示了刺激特异性反应以及与每个身体部位相关的颜色。响应通过放置在皮层表面上的石墨烯电极阵列记录。使用从石墨烯阵列记录的数据，计算标准必要专利的振幅以获得振幅依赖性的体感图。
感觉刺激诱导的局部场电位能够构建体感图。对每个身体刺激的反应大小构成啮齿动物。每种颜色代表不同的身体部位（图3）。
使用该协议获得的皮层图揭示了躯体感觉皮层内对胡须、前爪、前肢、后爪、后肢和躯干做出反应的特定区域。它提供了对皮质区域参与处理每个身体部位的物理刺激信息的程度的见解。
图 1：实验设置示意图。 基于石墨烯的电极阵列附着在体感皮层上，晶须或其他身体部位受到轻柔触摸的刺激。红色粗线表示电缆，红色和蓝色细线表示接地线和参考线。黑点表示前膛。数据采集系统通过USB连接到计算机。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：用于皮质表面大脑映射的基于石墨烯的微 电极阵列。 （A）石墨烯基电极阵列示意图。（B）皮质表面上石墨烯电极阵列的光学图像。（C）大鼠的听觉和躯体感觉皮质。两张听觉和躯体感觉区域响应听觉刺激的图，对每个身体部位施加各种频率音调和物理刺激。 （D）皮质表面上石墨烯电极阵列的30通道（不包括参考和接地电极）记录。盒子颜色与皮质表面的地理位置相关。这些数字改编和修改自 Lee 等人 （2021）。4请点击此处查看此图的大图。
图3：躯体感觉图。 （A）神经记录在皮层上的位置（左）。使用石墨烯电极阵列确定的皮质表面图。使用响应幅度构建并与人形重叠的颜色编码的体感图（右）。（B）记录每个身体部位刺激后的皮质SEP和地图。该图改编自 Lee 等人 （2021） 。4请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
所提出的协议提供了一个深入的分步过程，解释了如何使用石墨烯电极阵列访问和映射大鼠的体感反应。协议获取的数据是标准必要专利，提供与每个身体部位突触相关的躯体感觉信息。
应考虑该协议的几个方面。在提取脑脊液以防止脑水肿和减轻炎症时，实验者不要损坏位于大池前面的脑干至关重要。
面部胡须提供有关周围环境的触觉感官信息，例如黑暗和狭窄的环境。因此，啮齿动物的晶须发育良好，足以通过偏转方向、刺激强度和受刺激晶须的位置来感知物体。躯体感觉皮层对每个晶须的弯曲方向、强度和位置的反应不同18,19.因此，在该协议中，所有晶须都以恒定的强度和方向受到刺激。
该协议无法记录深部大脑结构中诱发的信号，因为我们的石墨烯电极阵列安装在皮质表面上。因此，实验者无法确定柱状网络是如何在神经反应方面分层组织的。
该协议优于以前的记录方法，因为石墨烯电极阵列侵入性较小，适应性强且具有生物相容性12,13,14,15,16。此外，石墨烯电极阵列具有>30个用于记录信号的通道，因此比单个或四极电极能够更快地进行皮质映射。该协议可以在需要时进一步应用于其他皮质区域15,20。实验者可以将电极阵列放置在听觉或视觉皮层上，以提取听觉和视觉信息作为听觉或视觉图。最后，该方法可用于神经疾病的慢性植入和诊断，如中风、癫痫、耳鸣和帕金森病。
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Disclosures
我们没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了仁川国立大学（国际合作）对Sunggu Yang的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
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