Summary
Мы представляем процедуру картирования мозга на основе графенового массива для снижения инвазивности и улучшения пространственно-временного разрешения. Поверхностные электроды на основе графеновых матриц демонстрируют долгосрочную биосовместимость, механическую гибкость и пригодность для картирования мозга в извитом мозге. Этот протокол позволяет строить несколько форм сенсорных карт одновременно и последовательно.
Abstract
Корковые карты представляют собой пространственную организацию зависящих от местоположения нейронных реакций на сенсомоторные стимулы в коре головного мозга, что позволяет предсказывать физиологически значимое поведение. Для получения карт коры головного мозга использовались различные методы, такие как проникающие электроды, электроэнцефалография, позитронно-эмиссионная томография, магнитоэнцефалография и функциональная магнитно-резонансная томография. Однако эти методы ограничены плохим пространственно-временным разрешением, низким отношением сигнал/шум (SNR), высокой стоимостью, а также небиосовместимостью или физическим повреждением мозга. В этом исследовании предлагается метод соматосенсорного картирования на основе графеновой матрицы в качестве особенности электрокортикографии, который обеспечивает превосходную биосовместимость, высокое пространственно-временное разрешение, желательное отношение сигнал/шум и минимальное повреждение тканей, преодолевая недостатки предыдущих методов. Это исследование продемонстрировало возможность использования графеновой электродной решетки для соматосенсорного картирования у крыс. Представленный протокол может быть применен не только к соматосенсорной коре, но и к другим корам, таким как слуховая, зрительная и моторная кора, обеспечивая передовые технологии для клинической реализации.
Introduction
Корковая карта представляет собой набор локальных участков, представляющих свойства реакции на сенсомоторные стимулы в коре головного мозга. Они представляют собой пространственное образование нейронных сетей и позволяют предсказывать восприятие и познание. Таким образом, корковые карты полезны для оценки нейронных реакций на внешние стимулы и обработки сенсомоторной информации 1,2,3,4. Существуют инвазивные и неинвазивные методы картирования коры головного мозга. Один из наиболее распространенных инвазивных методов предполагает использование интракортикальных (или проникающих) электродов для картирования 5,6,7,8.
Оценка карт коры головного мозга с высоким разрешением с помощью проникающих электродов столкнулась с рядом препятствий. Метод слишком трудоемкий, чтобы получить достойную карту, и слишком инвазивный для клинического использования, что препятствует дальнейшему развитию. Более современные технологии, такие как электроэнцефалография (ЭЭГ), позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), магнитоэнцефалография (МЭГ) и функциональная магнитно-резонансная томография (фМРТ), приобрели популярность, поскольку они менее инвазивны и воспроизводимы. Однако, учитывая их непомерно высокую стоимость и плохое разрешение, они используются в ограниченном числе случаев 9,10,11. В последнее время большое внимание привлекли гибкие поверхностные электроды с превосходной надежностью сигнала. Поверхностные электроды на основе графена демонстрируют долгосрочную биосовместимость и механическую гибкость, обеспечивая стабильные записи в извитом мозге 12,13,14,15,16. Наша группа недавно разработала многоканальный массив на основе графена для записи с высоким разрешением и сайт-специфической нейростимуляции на поверхности коры головного мозга. Эта технология позволяет нам отслеживать корковые представления сенсорной информации в течение длительного периода времени.
В этой статье описываются этапы получения карты мозга соматосенсорной коры с использованием 30-канальной графеновой мультиэлектродной решетки. Для измерения мозговой активности на субдуральную область коры помещают графеновую электродную решетку, а переднюю лапу, переднюю конечность, заднюю лапу, заднюю лапу, заднюю конечность, туловище и усы стимулируют деревянной палочкой. Соматосенсорные вызванные потенциалы (СЭП) регистрируются для соматосенсорных областей. Этот протокол также может быть применен к другим областям мозга, таким как слуховая, зрительная и моторная кора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры обращения с животными были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Инчхонского национального университета (INU-ANIM-2017-08).
1. Подготовка животных к операции
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте используйте крысу Sprague Dawley Rat (8-10 недель) без предвзятости по половому признаку.
- Обезболивайте крыс коктейлем 90 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина внутрибрюшинно. Чтобы поддерживать желаемую глубину анестезии на протяжении всей операции, дайте крысе дополнительный коктейль 45 мг/кг кетамина и 5 мг/кг ксилазина, когда крыса проявляет признаки пробуждения.
- Убедитесь, что крыса находится под глубоким наркозом, и регулярно проверяйте отражения тела, такие как защемление пальца ноги, хвоста и роговичный рефлекс.
- Сбрейте шерсть между глазами и задней частью ушей с помощью триммера.
- Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить их пересыхание.
2. Хирургическое вмешательство по поводу обнажения кортикальной поверхности
- Закрепите голову крысы на стереотаксическом аппарате с помощью стереотаксического адаптера. Чтобы поддерживать температуру тела 37 °C во время операции, поместите крысу на грелку с регулируемой температурой.
- Простерилизуйте выбритый участок чередующимися скрабами из спирта и повидон-йода три раза.
- Используйте щипцы, чтобы крепко захватить кожу головы, и введите 0,1 мл лидокаина (2%) с помощью шприца непосредственно в кожу головы, чтобы вызвать местную анестезию в области операции.
- Сделайте скальпелем разрез по средней линии длиной 2-3 см и раздвиньте скальп, чтобы обнажить череп.
- Зажмите кожу головы комариными щипцами, чтобы обнажить череп.
- Поцарапайте поверхность черепа щипцами, чтобы удалить надкостницу.
- Тупым рассекаем мышцы над затылочным черепом, чтобы обнажить большую цистерну над осью на верхней части спинного мозга.
- Разрежьте большую цистерну лезвием, чтобы слить спинномозговую жидкость, и поместите стерильную марлю внутрь разреза большой цистерны, чтобы постоянно впитывать спинномозговую жидкость, чтобы предотвратить отек мозга и свести к минимуму воспаление.
- Карандашом отметьте на черепе прямоугольное окошко размером 3 мм по переднезадней оси и 6 мм в правом боковом направлении от брегмы правого полушария.
ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка должна быть закреплена на расстоянии 1 мм от средней линии, чтобы избежать разрыва верхнего сагиттального синуса. - Просверлите отмеченный участок в соответствии со стереотаксической координатой и удалите череп костяным ронжером.
- Чтобы удалить твердую мозговую оболочку, согните кончик иглы 26 G на 90°, сделайте отверстие в твердой мозговой оболочке, приподнимите твердую мозговую оболочку, вставьте в это отверстие щипцы и разорвите ее щипцами.
- Положите смоченную физиологическим раствором марлю на соматосенсорную кору, чтобы предотвратить ее высыхание.
3. Подготовка графеновой электродной решетки, подключенной к системе регистрации
- Подготовьте графеновую электродную решетку с омнетическим разъемом.
- Отсоедините графеновую многоэлектродную решетку, не повредив ее, нанеся солевой раствор.
- Снимите внешнюю оболочку опорного и заземляющего проводов с разъема.
- Подключите головной столик с графеновой электродной решеткой к разъему.
- Подключите интерфейсный кабель, подключенный к головному столику, к системе записи.
- Закрепите комплекс графеновых электродов в стереотаксическом плече.
- Для захвата нейронных сигналов со всех каналов расположите массив на соматосенсорной коре головного мозга без каких-либо изгибов, следуя заданным стереотаксическим координатам.
- Поместите опорный провод под ткань за затылочной костью и подсоедините провод заземления к заземленному оптическому столу.
4. Физическая стимуляция и запись SEP для картирования
- Откройте программное обеспечение для записи нейронных сигналов.
- Настройте программную среду записи: (1) установите частоту дискретизации для SEP и режекторного фильтра (60 или 50 Гц, частота бытовой электрической мощности), чтобы удалить шум из линии питания.
- Для отображения усов согните их тонкой палочкой.
- Постоянно тыкайте в переднюю лапу, переднюю конечность, заднюю лапу, заднюю конечность и туловище деревянной палочкой для картографирования тела.
- Запись нейронных сигналов в систему сбора данных за указанное время.
5. Эвтаназия животных
- После всех регистрирующих процедур принесите крыс в жертву анестезией с использованием >5% изофлурана и проведите рассечение шейки матки.
6. Измерение SEP для картирования коры головного мозга
- Откройте MATLAB под кодовым именем read_Intan_RHS2000_file.m для анализа сигналов.
ПРИМЕЧАНИЕ: read_Intan_RHS2000_file.m можно загрузить с сайта "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software". - Нажмите кнопку «Выполнить », выберите файл записи с расширением «.rhs» и подождите, пока файл будет обработан и прочитан.
- Введите команду "plot (t, amplifier_data("номер канала",:))" для создания 2D линейного графика записываемых данных, найдите SEP и рассчитайте амплитуду SEP во всех каналах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Введите номер канала в поле «Номер канала». Например, "plot(t, amplifier_data(1,:))" создает 2D-график линии канала 1. Кроме того, когда экспериментатор рассчитывает амплитуду отклика, выбирайте отклик, записанный с каждого канала. - Получите данные, раскрасив сетку в другой оттенок в соответствии с амплитудой SEP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Команда MATLAB "imagesc" помогает быстрее получить топографическую карту.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает, как графеновая многоканальная матрица монтируется на поверхности мозга. Соматосенсорная карта была построена путем получения нейронных реакций на физические стимулы и вычисления амплитуды ответа. На рисунке 1 показана схема этого эксперимента.
На рисунке 2А представлены структурные характеристики графеновой электродной решетки. Между электродами имеются сквозные отверстия подложки. Эти отверстия помогают электроду плотно контактировать с кортикальной поверхностью (рис. 2B). Сильная адгезия электрода к коре головного мозга помогает записывать нейронные сигналы с меньшим шумом.
На рисунке 2C (слева) показаны зависящие от местоположения нейронные реакции, полученные при стимуляции усов, туловища, лап и конечностей, закодированных разными цветами. Гомункулус крысы, миниатюрное тело крысы, нарисован с фактическим соотношением каждого цветового размера на карте соматосенсорной коры (рис. 2C, справа).
На рисунке 2D представлены специфические для стимулов реакции с цветами, связанными с каждой частью тела. Ответы регистрируются через графеновую электродную решетку, размещенную на поверхности коры головного мозга. Используя данные, записанные с графеновой матрицы, вычисляется амплитуда SEP для получения амплитудно-зависимой соматосенсорной карты.
Индуцированные сенсорными стимулами локальные полевые потенциалы позволяют построить соматосенсорную карту. Величина реакции на каждый стимул организма представляет собой гомункула грызуна. Каждый цвет соответствует отдельной части тела (рис. 3).
Приобретенная карта коры головного мозга с использованием этого протокола выявляет специфические области в соматосенсорной коре, которые реагируют на усы, передние лапы, передние конечности, задние лапы, задние конечности и туловище. Это дает представление о степени вовлеченности корковой области в обработку информации о физических стимулах для каждой части тела.
Рисунок 1: Схема постановки эксперимента. Электродная решетка на основе графена прикрепляется к соматосенсорной коре, а усы или другие части тела стимулируются мягким прикосновением. Толстая красная линия представляет кабель, а тонкие красные и синие линии представляют провода заземления и опорные провода. Черной точкой обозначена брегма. Система сбора данных подключается к компьютеру через USB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Микроэлектродная решетка на основе графена для картирования мозга на поверхности коры головного мозга . (А) Схема электродной решетки на основе графена. (B) Оптическое изображение графеновой электродной решетки на поверхности кортикальной головки. В) Слуховая и соматосенсорная кора крыс. Две карты слуховой и соматосенсорной областей, реагирующих на слуховые стимулы с различными частотными тонами и физическими стимулами, приложенными к каждой части тела. (D) 30-канальная (исключая опорные и заземляющие электроды) запись графен-электродной решетки на поверхности коры. Цвета прямоугольников коррелируют с географическим расположением кортикальной поверхности. Цифры адаптированы и изменены по Lee et al. (2021). 4Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Соматосенсорная карта. (А) Расположение нейронных записей в слоях коры (слева). Карта кортикальной поверхности, определенная с помощью графеновой электродной решетки. Соматосенсорная карта с цветовой кодировкой, построенная с использованием амплитуд ответов и наложенная на гомункулуса (справа). (Б) Регистрируемые кортикальные SEP и карты после стимуляции каждой части тела. Эта цифра адаптирована и изменена из Lee et al. (2021). 4Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный протокол представляет собой углубленный пошаговый процесс, который объясняет, как получить доступ к соматосенсорным реакциям крыс и отобразить их с помощью графеновой электродной решетки. Данные, полученные протоколом, представляют собой SEP, которые предоставляют соматосенсорную информацию, синаптически связанную с каждой частью тела.
Следует рассмотреть несколько аспектов этого протокола. При извлечении спинномозговой жидкости для предотвращения отека мозга и смягчения воспаления экспериментатору крайне важно не повредить ствол мозга, расположенный перед большой цистерной.
Лицевые усы обеспечивают тактильную сенсорную информацию об окружающей среде, например, о темной и узкой среде. Соответственно, усы грызунов достаточно хорошо развиты, чтобы воспринимать объект по направлению отклонения, интенсивности стимула и расположению стимулируемых усов. Соматосенсорная кора по-разному реагирует на направление изгиба, интенсивность и расположение каждого уса18,19. Поэтому в этом протоколе все усы стимулируются с постоянной интенсивностью и направлением.
Этот протокол не может записывать сигналы, вызванные глубокими структурами мозга, поскольку наша графеновая электродная решетка установлена на поверхности коры головного мозга. Таким образом, экспериментатор не может определить, как иерархически организована столбчатая сеть в отношении нейронных реакций.
Этот протокол превосходит предыдущие методы записи, потому что графеновая электродная решетка менее инвазивна, адаптируема и биосовместима 12,13,14,15,16. Кроме того, графеновая электродная решетка имеет >30 каналов для записи сигналов, что обеспечивает более быстрое кортикальное картирование, чем одиночный или тетродный электрод. Этот протокол может быть дополнительно применен к другим областям коры головного мозга, когда это необходимо15,20. Экспериментатор может поместить электродную решетку в слуховую или зрительную кору головного мозга для извлечения слуховой и визуальной информации в виде слуховых или зрительных карт. Наконец, этот метод может быть применен для хронической имплантации и диагностики неврологических заболеваний, таких как инсульт, эпилепсия, шум в ушах и болезнь Паркинсона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего разглашать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Инчхонским национальным университетом (Международный кооператив) для Sunggu Yang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
- Leergaard, T. B., et al. Rat somatosensory cerebropontocerebellar pathways: spatial relationships of the somatotopic map of the primary somatosensory cortex are preserved in a three-dimensional clustered pontine map. Journal of Comparative Neurology. 422 (2), 246-266 (2000).
- Craner, S. L., Ray, R. H. Somatosensory cortex of the neonatal pig: I. Topographic organization of the primary somatosensory cortex (SI). Journal of Comparative Neurology. 306 (1), 24-38 (1991).
- Benison, A. M., Rector, D. M., Barth, D. S. Hemispheric mapping of secondary somatosensory cortex in the rat. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 200-207 (2007).
- Lee, M., et al. Graphene-electrode array for brain map remodeling of the cortical surface. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
- Yang, S. C., Weiner, B. D., Zhang, L. S., Cho, S. J., Bao, S. W. Homeostatic plasticity drives tinnitus perception in an animal model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (36), 14974-14979 (2011).
- Yang, S., Zhang, L. S., Gibboni, R., Weiner, B., Bao, S. W. Impaired development and competitive refinement of the cortical frequency map in tumor necrosis factor-alpha-deficient mice. Cerebral Cortex. 24 (7), 1956-1965 (2014).
- Miyakawa, A., et al. Tinnitus correlates with downregulation of cortical glutamate decarboxylase 65 expression but not auditory cortical map reorganization. Journal of Neuroscience. 39 (50), 9989-10001 (2019).
- Yang, S., Su, W., Bao, S. Long-term, but not transient, threshold shifts alter the morphology and increase the excitability of cortical pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (6), 1567-1574 (2012).
- Beniczky, S., Schomer, D. L. Electroencephalography: basic biophysical and technological aspects important for clinical applications. Epileptic Disorders. 22 (6), 697-715 (2020).
- Kim, S. G., Richter, W., Uğurbil, K. Limitations of temporal resolution in functional MRI. Magnetic Resonance Medicine. 37 (4), 631-636 (1997).
- Cho, Z. H., et al. A fusion PET-MRI system with a high-resolution research tomograph-PET and ultra-high field 7.0 T-MRI for the molecular-genetic imaging of the brain. Proteomics. 8 (6), 1302-1323 (2008).
- Viventi, J., et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nature Neuroscience. 14 (12), 1599-1605 (2011).
- Masvidal-Codina, E., et al. High-resolution mapping of infraslow cortical brain activity enabled by graphene microtransistors. Nature Materials. 18 (3), 280-288 (2019).
- Blaschke, B. M., et al. Mapping brain activity with flexible graphene micro-transistors. 2D Materials. 4 (2), 025040 (2017).
- Park, S. W., et al.
- Lim, J., et al. Hybrid graphene electrode for the diagnosis and treatment of epilepsy in free-moving animal models. NPG Asia Materials. 15 (1), 7 (2023).
- Hermanns, H., et al. Molecular mechanisms of action of systemic lidocaine in acute and chronic pain: a narrative review. British Journal of Anaesthesia. 123 (3), 335-349 (2019).
- Tchoe, Y., et al. Human brain mapping with multithousand-channel PtNRGrids resolves spatiotemporal dynamics. Science Translational Medicine. 14 (628), (2022).
- Wilent, W. B., Contreras, D. Dynamics of excitation and inhibition underlying stimulus selectivity in rat somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 8 (10), 1364-1370 (2005).
- Insanally, M. N., Köver, H., Kim, H., Bao, S. Feature-dependent sensitive periods in the development of complex sound representation. Journal of Neuroscience. 29 (17), 5456-5462 (2009).
