Summary
Presentiamo una procedura di mappatura cerebrale basata su array di grafene per ridurre l'invasività e migliorare la risoluzione spazio-temporale. Gli elettrodi di superficie basati su array di grafene mostrano biocompatibilità a lungo termine, flessibilità meccanica e idoneità per la mappatura cerebrale in un cervello contorto. Questo protocollo consente di costruire più forme di mappe sensoriali contemporaneamente e in sequenza.
Abstract
Le mappe corticali rappresentano l'organizzazione spaziale delle risposte neurali dipendenti dalla posizione agli stimoli sensomotori nella corteccia cerebrale, consentendo la previsione di comportamenti fisiologicamente rilevanti. Vari metodi, come gli elettrodi penetranti, l'elettroencefalografia, la tomografia a emissione di positroni, la magnetoencefalografia e la risonanza magnetica funzionale, sono stati utilizzati per ottenere mappe corticali. Tuttavia, questi metodi sono limitati da una scarsa risoluzione spazio-temporale, da un basso rapporto segnale/rumore (SNR), da costi elevati e dalla non biocompatibilità o causano danni fisici al cervello. Questo studio propone un metodo di mappatura somatosensoriale basato su array di grafene come caratteristica dell'elettrocorticografia che offre una biocompatibilità superiore, un'elevata risoluzione spazio-temporale, un SNR desiderabile e un danno tissutale ridotto al minimo, superando gli inconvenienti dei metodi precedenti. Questo studio ha dimostrato la fattibilità di un array di elettrodi di grafene per la mappatura somatosensoriale nei ratti. Il protocollo presentato può essere applicato non solo alla corteccia somatosensoriale ma anche ad altre cortecce come la corteccia uditiva, visiva e motoria, fornendo una tecnologia avanzata per l'implementazione clinica.
Introduction
Una mappa corticale è un insieme di chiazze locali che rappresentano le proprietà di risposta agli stimoli sensomotori nella corteccia cerebrale. Sono una formazione spaziale di reti neurali e consentono la previsione della percezione e della cognizione. Pertanto, le mappe corticali sono utili per valutare le risposte neurali agli stimoli esterni e per elaborare le informazioni sensomotorie 1,2,3,4. Sono disponibili metodi invasivi e non invasivi per la mappatura corticale. Una delle metodiche invasive più comuni prevede l'uso di elettrodi intracorticali (o penetranti) perla mappatura 5,6,7,8.
La valutazione delle mappe corticali ad alta risoluzione su richiesta utilizzando elettrodi penetranti ha incontrato diversi ostacoli. Il metodo è troppo laborioso per ottenere una mappa decente e troppo invasivo per essere implementato per uso clinico, impedendo ulteriori sviluppi. Tecnologie più recenti come l'elettroencefalografia (EEG), la tomografia a emissione di positroni (PET), la magnetoencefalografia (MEG) e la risonanza magnetica funzionale (fMRI) hanno guadagnato popolarità perché sono meno invasive e riproducibili. Tuttavia, dati i loro costi proibitivi e la scarsa risoluzione, vengono utilizzati in un numero limitato di casi 9,10,11. Recentemente, gli elettrodi di superficie flessibili con un'affidabilità del segnale superiore hanno attirato una notevole attenzione. Gli elettrodi di superficie a base di grafene dimostrano biocompatibilità a lungo termine e flessibilità meccanica, fornendo registrazioni stabili in un cervello contorto 12,13,14,15,16. Il nostro gruppo ha recentemente sviluppato un array multicanale a base di grafene per la registrazione ad alta risoluzione e la neurostimolazione sito-specifica sulla superficie corticale. Questa tecnologia ci permette di tenere traccia delle rappresentazioni corticali delle informazioni sensoriali per un periodo prolungato.
Questo articolo descrive i passaggi necessari per acquisire una mappa cerebrale della corteccia somatosensoriale utilizzando un array multielettrodo di grafene a 30 canali. Per misurare l'attività cerebrale, un array di elettrodi di grafene viene posizionato sull'area subdurale della corteccia, mentre la zampa anteriore, l'arto anteriore, la zampa posteriore, l'arto posteriore, il tronco e i baffi vengono stimolati con un bastoncino di legno. I potenziali evocati somatosensoriali (SEP) vengono registrati per le aree somatosensoriali. Questo protocollo può essere applicato anche ad altre aree cerebrali, come la corteccia uditiva, visiva e motoria.
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Protocol
Tutte le procedure di gestione degli animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università Nazionale di Incheon (INU-ANIM-2017-08).
1. Preparazione dell'animale per l'intervento chirurgico
NOTA: Utilizzare Sprague Dawley Rat (8-10 settimane) senza pregiudizi sessuali per questo esperimento.
- Anestetizzare il ratto con 90 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di cocktail di xilazina per via intraperitoneale. Per mantenere la profondità di anestesia desiderata durante l'intervento, fornire un supplemento di 45 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di cocktail di xilazina quando il ratto mostra segni di risveglio.
- Verificare che il ratto sia in anestesia profonda e controllare regolarmente i riflessi del corpo come il pizzicamento delle dita dei piedi, il pizzicamento della coda e il riflesso corneale.
- Radere il pelo tra gli occhi e la parte posteriore delle orecchie usando un rifinitore.
- Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per evitare che si secchino.
2. Chirurgia per l'esposizione della superficie corticale
- Fissare la testa di ratto sull'apparecchio stereotassico con un adattatore stereotassico. Per mantenere la temperatura corporea di 37 °C durante l'intervento, posizionare il ratto su un termoforo a temperatura controllata.
- Sterilizzare la zona rasata con scrub alternati di alcool e iodio povidone per tre volte.
- Utilizzare una pinza per afferrare saldamente il cuoio capelluto e iniettare 0,1 ml di lidocaina (2%) con una siringa direttamente nel cuoio capelluto per indurre l'anestesia locale nell'area chirurgica.
- Fai un'incisione sulla linea mediana lunga 2-3 cm con un bisturi e separa il cuoio capelluto per esporre il cranio.
- Blocca il cuoio capelluto con una pinza per zanzare per esporre il cranio.
- Grattare la superficie del cranio con una pinza per rimuovere il periostio.
- Smussare sezionare i muscoli sopra il cranio occipitale per esporre la cisterna magna sopra l'asse sulla parte superiore del midollo spinale.
- Incidere la cisterna magna con la lama per drenare il liquido cerebrospinale e mettere una garza sterile all'interno dell'incisione della cisterna magna per assorbire costantemente il liquido cerebrospinale per prevenire l'edema cerebrale e ridurre al minimo l'infiammazione.
- Usando una matita, segnare sul cranio una finestra rettangolare di 3 mm nell'asse antero-posteriore e 6 mm in direzione laterale destra dal bregma dell'emisfero destro.
NOTA: La marcatura deve garantire una distanza di 1 mm dalla linea mediana per evitare la rottura del seno sagittale superiore. - Forare l'area contrassegnata secondo la coordinata stereotassica e rimuovere il cranio con un rongeur osseo.
- Per rimuovere la dura madre, piegare la punta dell'ago da 26 G a 90°, creare un foro nella dura madre, sollevare la dura madre, inserire una pinza in quel foro e strapparla con una pinza.
- Metti una garza bagnata con soluzione salina sulla corteccia somatosensoriale per evitare che si secchi.
3. Preparazione dell'array di elettrodi di grafene collegato al sistema di registrazione
- Preparare un array di elettrodi di grafene con un connettore omnetics.
- Staccare l'array di multielettrodi di grafene senza causare danni applicando la soluzione salina.
- Rimuovere il rivestimento esterno dei cavi di riferimento e di terra dal connettore.
- Collegare lo stadio di testa con l'array di elettrodi di grafene al connettore.
- Collegare il cavo di interfaccia collegato al palco principale al sistema di registrazione.
- Fissare il complesso dell'array di elettrodi di grafene nel braccio stereotassico.
- Per catturare i segnali neurali da tutti i canali, posizionare l'array sulla corteccia somatosensoriale senza alcuna flessione, seguendo le coordinate stereotassiche predeterminate.
- Posizionare un filo di riferimento sotto il tessuto dietro l'osso occipitale e collegare il filo di terra al tavolo ottico con messa a terra.
4. Stimolazione fisica e registrazione dei SEP per la mappatura
- Aprire il software di registrazione del segnale neurale.
- Impostare l'ambiente del software di registrazione: (1) impostare la frequenza di campionamento per i SEP e il filtro notch (60 o 50 Hz, una frequenza dell'energia elettrica domestica) per rimuovere il rumore dalla linea elettrica.
- Per la mappatura dei baffi, piega i baffi con un bastoncino fine.
- Colpisci costantemente la zampa anteriore, l'arto anteriore, la zampa posteriore, l'arto posteriore e il tronco con un bastoncino di legno per mappare il corpo.
- Registrare i segnali neurali nel sistema di acquisizione dati per il tempo indicato.
5. Eutanasia animale
- Dopo tutte le procedure di registrazione, sacrificare i ratti con l'anestesia utilizzando l'isoflurano al >5% ed eseguire la dissezione cervicale.
6. Misurazione SEP per la mappatura corticale
- Apri MATLAB, nome in codice read_Intan_RHS2000_file.m, per l'analisi dei segnali.
NOTA: read_Intan_RHS2000_file.m può essere scaricato da "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software". - Fare clic sul pulsante Esegui , selezionare il file di registrazione con l'estensione ".rhs" e attendere che il file venga elaborato e letto.
- Immettere il comando "plot (t, amplifier_data("channel number",:))" per creare un grafico a linee 2D dei dati di registrazione, trovare i SEP e calcolare l'ampiezza dei SEP in tutti i canali.
NOTA: Immettere il numero del canale in "numero canale". Ad esempio, "plot(t, amplifier_data(1,:))" crea il grafico a linee 2D del canale 1. Inoltre, quando lo sperimentatore calcola l'ampiezza della risposta, sceglie la risposta registrata da ciascun canale. - Ottenere i dati colorando la griglia con una tonalità diversa in base all'ampiezza dei SEP.
NOTA: Il comando MATLAB "imagesc" consente di ottenere una mappa topografica più rapidamente.
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Representative Results
Questo protocollo descrive il modo in cui un array multicanale di grafene viene montato sulla superficie del cervello. La mappa somatosensoriale è stata costruita acquisendo risposte neurali a stimoli fisici e calcolando l'ampiezza della risposta. La Figura 1 mostra lo schema di questo esperimento.
La Figura 2A presenta le caratteristiche strutturali di un array di elettrodi in grafene. Ci sono fori passanti del substrato tra gli elettrodi. Questi fori aiutano l'elettrodo a entrare saldamente in contatto con la superficie corticale (Figura 2B). La forte adesione dell'elettrodo alla corteccia aiuta a registrare i segnali neurali con meno rumore.
La Figura 2C (a sinistra) mostra le risposte neurali dipendenti dalla posizione acquisite stimolando i baffi, il tronco, le zampe e gli arti codificati in diversi colori. Un homunculus di ratto, il corpo in miniatura del ratto, è disegnato con il rapporto effettivo di ogni dimensione di colore nella mappa della corteccia somatosensoriale (Figura 2C, a destra).
La Figura 2D presenta le risposte specifiche degli stimoli con i colori associati a ciascuna parte del corpo. Le risposte vengono registrate attraverso una serie di elettrodi di grafene posizionati sulla superficie della corteccia. Utilizzando i dati registrati dall'array di grafene, l'ampiezza dei SEP viene calcolata per ottenere la mappa somatosensoriale dipendente dall'ampiezza.
I potenziali di campo locali indotti da stimoli sensoriali consentono la costruzione della mappa somatosensoriale. La dimensione della risposta a ogni stimolo corporeo pone un homunculus di roditori. Ogni colore rappresenta una parte del corpo diversa (Figura 3).
La mappa della corteccia acquisita utilizzando questo protocollo rivela le regioni specifiche all'interno della corteccia somatosensoriale che rispondono ai baffi, alle zampe anteriori, agli arti anteriori, alle zampe posteriori, agli arti posteriori e al tronco. Fornisce approfondimenti sull'entità del coinvolgimento dell'area corticale nell'elaborazione delle informazioni sullo stimolo fisico per ciascuna parte del corpo.
Figura 1: Schema dell'impostazione dell'esperimento. L'array di elettrodi a base di grafene è collegato alla corteccia somatosensoriale e i baffi o altre parti del corpo vengono stimolati da un tocco delicato. La linea rossa spessa rappresenta il cavo, mentre le linee sottili rosse e blu rappresentano i fili di terra e di riferimento. Il punto nero indica il bregma. Il sistema di acquisizione dati è collegato al computer tramite USB. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Array di microelettrodi a base di grafene per la mappatura cerebrale sulla superficie corticale . (A) Schema dell'array di elettrodi a base di grafene. (B) Immagine ottica dell'array di elettrodi di grafene sulla superficie corticale. (C) Cortecce uditive e somatosensoriali del ratto. Due mappe delle aree uditive e somatosensoriali che rispondono agli stimoli uditivi con vari toni di frequenza e stimoli fisici applicati a ciascuna parte del corpo. (D) La registrazione a 30 canali (esclusi gli elettrodi di riferimento e di massa) dell'array di elettrodi di grafene sulla superficie corticale. I colori della scatola sono correlati con le posizioni geografiche della superficie corticale. Le figure sono adattate e modificate da Lee et al. (2021). 4Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Mappa somatosensoriale. (A) Posizione delle registrazioni neurali attraverso gli strati corticali (a sinistra). Una mappa della superficie corticale determinata utilizzando un array di elettrodi di grafene. Una mappa somatosensoriale codificata a colori costruita utilizzando le ampiezze di risposta e sovrapposta all'homunculus (a destra). (B) Registrazioni di SEP corticali e mappe che seguono la stimolazione di ciascuna parte del corpo. Questa figura è adattata e modificata da Lee et al. (2021). 4Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il protocollo presentato fornisce un processo approfondito e passo dopo passo che spiega come accedere e mappare le risposte somatosensoriali dei ratti utilizzando un array di elettrodi di grafene. I dati acquisiti dal protocollo sono SEP che forniscono informazioni somatosensoriali che sono sinapticamente collegate a ciascuna parte del corpo.
Diversi aspetti di questo protocollo dovrebbero essere considerati. Quando si estrae il liquido cerebrospinale per prevenire l'edema cerebrale e mitigare l'infiammazione, è fondamentale che lo sperimentatore non danneggi il tronco encefalico situato davanti alla cisterna magna.
I baffi facciali forniscono informazioni sensoriali tattili sull'ambiente circostante, come un ambiente buio e stretto. Di conseguenza, i baffi dei roditori sono abbastanza ben sviluppati da percepire un oggetto attraverso le direzioni di deflessione, l'intensità dello stimolo e la posizione dei baffi stimolati. La corteccia somatosensoriale risponde in modo diverso alla direzione di curvatura, all'intensità e alla posizione di ciascun baffo18,19. Pertanto, tutti i baffi vengono stimolati con intensità e direzione costanti in questo protocollo.
Questo protocollo non è in grado di registrare i segnali evocati nelle strutture cerebrali profonde poiché il nostro array di elettrodi di grafene è montato sulla superficie corticale. Pertanto, lo sperimentatore non è in grado di identificare come la rete colonnare sia organizzata gerarchicamente per quanto riguarda le risposte neurali.
Questo protocollo è superiore ai metodi di registrazione precedenti perché l'array di elettrodi di grafene è meno invasivo, adattabile e biocompatibile 12,13,14,15,16. Inoltre, l'array di elettrodi in grafene ha >30 canali per la registrazione dei segnali, consentendo così una mappatura corticale più rapida rispetto a un elettrodo singolo o a un tetrodo. Questo protocollo può essere ulteriormente applicato ad altre aree corticali ogni volta che è necessario15,20. Lo sperimentatore può posizionare l'array di elettrodi sulla corteccia uditiva o visiva per estrarre informazioni uditive e visive come le mappe uditive o visive. Infine, questo metodo può essere implementato per l'impianto cronico e la diagnosi di malattie neurali, come ictus, epilessia, acufene e morbo di Parkinson.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Università Nazionale di Incheon (International Cooperative) per Sunggu Yang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
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