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 JoVE Biology

En vivo bioluminiscente de imágenes de tumores de mama mediante el espectro de IVIS

1, 1, 1

1Biology Research and Development , Caliper Life Sciences

Article
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    Summary

    Mamaria células tumorales que expresan luciferasa se implanta de forma subcutánea en ratones y se visualizan con imágenes ópticas para controlar el crecimiento tumoral y el desarrollo de forma no invasiva en un estudio longitudinal.

    Date Published: 4/29/2009, Issue 26; doi: 10.3791/1210

    Cite this Article

    Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum. J. Vis. Exp. (26), e1210, doi:10.3791/1210 (2009).

    Abstract

    Células 4T1 de tumor mamario de ratón puede ser implantado subcutáneamente en ratones nu / nu para formar tumores palpables en 15 a 20 días. Este sistema modelo de xenoinjerto tumoral es útil para la pre-clínica en la evaluación in vivo de compuestos antitumorales putativo.

    La línea celular 4T1 se ha diseñado para expresar constitutivamente el gen de la luciferasa de luciérnaga (luc2). Cuando ratones portadores de tumores 4T1-luc2 son inyectados con luciferina los tumores emiten una señal de luz visible que pueden ser monitoreados utilizando un sistema sensible de imágenes ópticas, como el espectro de IVIS. El flujo de fotones del tumor es proporcional al número de células que emiten luz y la señal puede ser medida para controlar el crecimiento tumoral y el desarrollo. IVIS está calibrada para permitir la cuantificación absoluta de la señal bioluminiscente y los estudios longitudinales se pueden realizar durante muchos meses y en varios órdenes de magnitud de la señal, sin comprometer el resultado cuantitativo.

    El crecimiento del tumor se puede controlar durante varios días antes de la bioluminiscencia por el tamaño del tumor se hace palpable y mensurable por los tradicionales medios físicos. Este monitoreo rápido puede dar una idea de los primeros eventos en el desarrollo de tumores o dar lugar a procedimientos más cortos experimentales.

    Muerte de las células del tumor y necrosis debido al tratamiento de la hipoxia o fármaco está indicado temprano por la reducción de la señal bioluminiscente. Esta muerte celular no puede ir acompañado de una reducción en el tamaño del tumor, medido por medios físicos. La capacidad de ver los primeros eventos en necrosis tumoral tiene un impacto significativo en la selección y desarrollo de agentes terapéuticos.

    Imagen cuantitativa del crecimiento tumoral con IVIS ofrece la cuantificación precisa y acelera el proceso experimental para generar resultados.

    Protocol

    Una amplia variedad de luciferasa que expresan las líneas celulares de cáncer puede ser utilizado para la investigación preclínica en modelos de ratón.

    Estas células se proporcionan como una cultura congelada libre de patógenos, que rápidamente crecerá en los medios de comunicación estándar, sin necesidad de marcadores de selección.

    Para nuestro experimento, vamos a utilizar el 4T1-luc2 murino línea de células tumorales mamarias, que expresa el gen de la luciferasa, que sirve como un indicador óptico de la expresión génica o tumorgenesis in vivo. Vamos a usar la expresión de luciferasa para observar el crecimiento del tumor primario, de forma no invasiva, pero también se puede utilizar para localizar y controlar las lesiones metastásicas.

    La actividad luciferasa debe ser verificada antes de la inyección, y con el fin de hacer esto, un frasco de 90% confluentes se cosechan por tripsinización y contaron.

    50.000 células se entrega en un solo pozo de una placa de microtitulación y diluciones seriadas se llevan a cabo. Luciferina se añade a los pozos de 150ug por ml y se incubó durante 2 minutos. La microplaca se pueden leer en IVIS o un lector de placas luminiscentes para determinar los niveles de expresión. Esta línea celular expresa hasta 6500 fotones por células por segundo, pero cualquier nivel de expresión por encima de 500 fotones por segundo por cada célula se pueden visualizar con éxito en vivo.

    Ahora que tenemos las células de la actividad óptima, podemos pasar a la etapa de inyección subcutánea.

    Con el fin de facilitar la detección óptima del tumor, estamos utilizando una cepa atímicos inmunodeficientes ratón desnudo. Antes de la inyección, los animales son anestesiados para llevar a cabo para la anestesia profunda.

    A continuación vamos a inyectar hasta 250.000 células en 100 ul de PBS se inyectan por vía subcutánea en el flanco. La carga de las células en una jeringa de 1 ml y ponga una aguja de calibre 26. Levante la piel suavemente con unas pinzas para hacer una "tienda" e inyectar las células en la base. Las nuevas células inyectadas se pueden visualizar de inmediato. En cada sesión de imágenes de un total de 150 mg de luciferina por kg de peso luego se administra a través de dos inyecciones en la cavidad peritoneal.

    En este estudio, los animales son imágenes 10 minutos después de la inyección luciferina para asegurar el flujo de fotones coherentes. Le mostraremos esto en el próximo paso. Cinética de la luciferina puede variar de un día para otro. En este modelo en particular, la medición de 10 minutos después de la inyección luciferina dio un resultado dentro de un rango de 15% de la variabilidad.

    Para nuestro experimento vamos a utilizar el espectro IVIS en vivo sistema de imágenes utiliza un back-adelgazado dispositivo de carga acoplada refrigerados a -90 ° C para conseguir la máxima sensibilidad. Para apoyar la cuantificación absoluta, el sistema mide la carga oscura durante el tiempo de inactividad y ejecuta una auto-calibración durante la inicialización. Para empezar la imagen, inicializar el sistema IVIS (un clic) y establecer los parámetros de imagen para el experimento.

    Seleccione el campo de visión para el número de animales que se explora. Hasta 5 animales se pueden mantener en el instrumento a través del colector de anestésico integral. El escenario está en una constante de 37 ° C para mantener la temperatura corporal en los animales. Un puerto de ECG se proporciona para controlar la salud de los animales durante los procedimientos estresantes.

    Vivir en el software de imagen, tiempo de exposición, diafragmas y pixel binning se puede optimizar en función del nivel de expresión de la línea celular. Estos ajustes se pueden cambiar en cualquier momento durante un experimento sin afectar el resultado cuantitativo.

    IVIS adquiere una imagen fotográfica de los animales con luz blanca y una señal cuantitativa bioluminiscentes o fluorescentes, que se superpone en la imagen.

    La señal bioluminiscente se expresa en forma de fotones por segundo y se muestra como un mapa de intensidad. La visualización de la imagen se ajusta para proporcionar un contraste óptimo y la resolución de la imagen sin afectar a la cuantificación.

    Luminiscencia de las células se puede medir en el lugar de inyección con una región de la herramienta de interés. Los datos de medición se muestran en la tabla, junto con todos los parámetros experimentales relacionados con la captura de imágenes que se pueden guardar o exportar para su análisis

    Varias imágenes pueden ser adquiridas y comparados en los estudios longitudinales que cubren segundos o meses, dependiendo de la naturaleza del experimento. Vamos a medir el flujo de fotones del tumor en el momento cero y el monitor durante 4 semanas con imágenes a intervalos de dos semanas.

    Flujo de fotones del tumor es proporcional al número de células vivas que expresan luciferasa para la bioluminiscencia se correlaciona directamente con el tamaño del tumor.

    A los 5 días posteriores a la implantación del tumor no es aún palpable, pero las células pueden ser cuantificados a través de la bioluminiscencia y el tumor se ve que es de crecimiento activo. En esta etapa la señal de bioluminiscencia es mucho stronger. El tiempo de exposición, f-stop y pixel binning se puede ajustar para que la imagen es clara y la cámara no se sature. IVIS compensa automáticamente los cambios en la recolección de la luz así que estas medidas se puede comparar con los obtenidos antes y después del experimento.

    A los 7 días después del implante tumores son palpables, por primera vez y bioluminiscencia medida ya ha generado 7 días de datos.

    A los 28 días posteriores a la implantación, los tumores se están convirtiendo en necrosis y las células comienzan a morir. Estima que el tamaño del tumor mediante un calibre de medición no cambia apreciablemente, pero la luminiscencia del tumor se reducirá lo que indica la muerte celular.

    Mediciones de la pinza y la medición de bioluminiscencia se puede continuar hasta un punto final que se alcance humano. Necrosis del tumor debido a los regímenes de la hipoxia o el tratamiento será indicado por la bioluminiscencia reducido, incluso si no reducen la masa tumoral.

    Disclosures

    Me gustaría asegurar que todos los experimentos realizados para producir el artículo del Journal of experimentos visualizados se realizaron en cumplimiento del Protocolo de animales 060 aprobado por el Comité Institucional y el empleo Comisión (IACUC) en Caliper Life Sciences, Alameda CA Jae Kim, Ph . D., Presidente IACUC, Caliper Life Sciences.

    Comments

    29 Comments

    I  can't see any vedio, why?
    Reply

    Posted by: Jack M.April 30, 2009, 8:57 AM

    Jack, sorry you are having problems.  Please check that you have Flash installed.  If you still have problems, please send me an email at nikitab@jove.com and I'll help you out.
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 30, 2009, 10:37 AM

    1.why did you give ² injections of the ip luciferin?
    ².Do you have correlation in the caliper measurements compared to the BLI measurements?
    Reply

    Posted by: Tomi O.June 22, 2009, 7:18 AM

    Hi Tomi,

    1) Two ip injections of luciferin are given in case of a missed injection, although a partial dose may not give you a satisfactory image (in which case you will need to re-image the animal). A single injection of luciferin can be administered and the animal may be conscious or unconscious. Select a method and use it consistently throughout your study to avoid any variability.

    ²) Yes, there is correlation between bioluminescence and caliper measurements in the 4T1-luc² subcutaneous model.
    Reply

    Posted by: Ed L.June 26, 2009, 5:29 PM

    Microparticles can be stained fluorescently or a labeled compound in a microparticle can be traced in vivo as long as either is sufficiently bright and the signal dŒsn&#x²019;t interfere with that from the labeled cells. I don&#x²019;t know what type of microparticle you are using but there are commercially available staining kits depending on the type.
    Yes, you can inject non-labeled cells subcutaneously and visualize the resulting tumor with a fluorescently-labeled antibody.
    Reply

    Posted by: Ed L.January 8, 2010, 7:46 PM

    Is it possible to trace microparticles loaded with a drug in vivo ? If positive how should I label them? Also would it be possible to visualize in the way you showed in video antibodies directed to non-labeled tumoral cells?

    Thanks

    G
    Reply

    Posted by: Helio T.August 19, 2009, 2:18 PM

    How can I use this methods to quantify apoptosis?
    Reply

    Posted by: Silvio M.December 9, 2009, 1:05 AM

    Miranda,

    Here is a nice publication covering apoptosis:
    Clinical Cancer Research ²008;14(8) April 15, ²008
    Reply

    Posted by: Ed L.January 8, 2010, 7:48 PM

    How can I use this methods to quantify apoptosis?
    Reply

    Posted by: Silvio M.December 9, 2009, 1:06 AM

    New in this. I have a question:
    The signal intensity change over time, in order to give a good pic. I guess people use different settings at different time point. The picture thus are not comparable? How could I take the pictures over time under different settings but still comparable?

    Thanks a lot.

    L
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 28, 2009, 12:35 PM

    As the tumor increases in size, the light emission will increase and camera settings may need to be adjusted so as not to get a saturated image (which cannot be accurately quantified). When performing a longitudinal study, it would be ideal to have all the images with the same scale and binning. You may not always be able to use the same scale for the entire study but you can still get a good overall picture of disease progression. If you select the same units throughout (ie &#x²01C;photons/second/cm²/sr&#x²01D;), the images and quantification will be comparable. In the case where different binning was used to capture the image, the Living Image software allows you to change the binning on any image after it was taken.
    Reply

    Posted by: Ed L.January 8, 2010, 7:50 PM

    Is there a reason to nu/nu mice vs. normal Balb/C mice ? 4T1 is a syngeneic xenograft model.
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 27, 2010, 2:00 PM

    Is there a reason to use nu/nu mice vs. normal Balb/C mice ? 4T1 is a syngeneic xenograft model.
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 27, 2010, 2:00 PM

    Nu/nu mice would be preferable if you are using fluorescence. Fur will auto-fluoresce and may mask your signal (you can shave or use a depilatory in this case). Otherwise, we could have also used a Balb/C mouse with the 4T1-luc² in the video.
    Reply

    Posted by: AnonymousJanuary 27, 2010, 4:07 PM

    hello Is there any mice model for the research of glioma? Our lab has just begin the study in this area.We really need some help here.
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 20, 2010, 9:09 AM

    Hi Aaron,

    There is a very good video demonstrating this procedure www.jove.com/index/Details.stp?ID=1986
    You can use U87-MG-luc cells.
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 21, 2010, 3:14 PM

    In the video you've mentioned monitoring of metastatic lesions.
    What settings do I need to enter in order to see the lesions (in my case lymph node mets) with the primary tumor in one hole body shot?
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 20, 2010, 6:33 AM

    Hi Rachel,

    The primary tumor will be very bright while the lymph node metastases will be dim. You won't be able to image everything in a single, whole body image. In order to image the mets, you will need to shield the primary tumor and try imaging with large binning for 3 minutes as a start. Adjust your exposure time as needed and you can also change the FOV to bring the animal closer to the camera.
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 21, 2010, 1:01 PM

    Is is possible to use this method for imaging intra-abdominal metastases? Are there any specific tricks to doing so (other than placing the mouse on its back) and imaging for very dim signals?
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 7, 2011, 5:13 PM

    Dr. Holtz,
    Using the exact same method, you can image intra-abdominal metastases. You may want to use brighter cells to increase your chances to detect small metastases.
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 7, 2011, 6:08 PM

    Dear Mr. Lim,

    I'm new to the IVIS technology and I have some problems understanding the absolute quantitation of the obtained data. Prior to s/c injection of Luc²-cancer cells, cel expression levels were measured via dilution series in 96 well plate. I understand that after using the averaging tool one receives a certain value expressed in photons/sec/cell (for instance 700 p/s/cell). After injection of these cells, several bioluminescent pictures were taken in function of time. When ROI analyses is performed and data is displayed in Radiance mode, one obtaines a value in photons/sec/cm²/sr (for instance 7x10E7 p/s/cm²/sr) . How dŒs one now quantify the amount of cells ? In the example between brackets, would this be a cell number of 100000 cells in a tissue surface area of 1cm² ?

    Kind regards
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 20, 2011, 4:08 PM

    Hi Bram,

    The well plate values cannot be used directly to quantitate the in vivo image. Imaging the cells on the well plate gives you the light output in photons/sec and you can further calculate the photons/sec/cell to ensure that the cells are within the parameters in the product sheet. For in vivo imaging, a specified number of cells are injected into the animal and imaged. The light output is in units of photons/sec/cm^²/sr. This is the light that is detected at the surface of the animal per square centimeter per steradian. The bioluminescent signal will increase as the tumor increases in volume. Quantitating the in vivo signal needs to be approached with caution: photon intensity decreases with increase in tissue depth and optical properties of tissues may affect scattering/absorption of light (i.e. necrosis).

    Ed
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 12, 2011, 7:39 PM

    what is the type of 96 -microwell plate do you use?what is the lotnumber of it ?
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 8, 2011, 10:31 PM

    Hi Lily,

    We use 96-well plates with black walls and clear bottom (polystyrene). The particular plate is Costar #3603.

    Ed
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 12, 2011, 7:42 PM

    Hi,
    I have been trying the same procedure for LUC B16F10 cells..but I am not getting any signal in vitro... I tried changing the procedure for luminescence but not getting any results. i have tries seeding different number of cells in 1² well plate, though cannot see any signal. What could be the possible reason for the same? and can i just use PBS+luciferin for the imaging instead of the complete media?

    thanks,
    Krishna
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 20, 2012, 12:04 PM

    Hi Krishna,

    Are your B16F10 cells luc or luc²? The luc version has a light output of 15photons/second/cell whereas the luc² version is brighter at 450ph/sec/cell. In contrast, 4T1-luc² is about 6500ph/sec/cell. What is your exposure time when you image your cells? You may need to use a longer exposure time and a larger binning to see a signal. Hope this helps.

    Ed
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 6, 2012, 3:14 PM

    Hi,

    our group is working on adoptive T cell therapy and is successfully using the IVIS ²00 for tracing T cells and measuring tumor size.
    But since I'm new I do have some questions no one could properly answer :-)

    We always inject the substrate (Luciferin od CŒlenterazine) i.v.
    Is there a difference to s.c. or i.p. injection?

    And I was wondering if one could also detect resting tumor cells in the bone marrow? Or is the luc² signal (of let say 1-6 cells) to weak to shine thru the bones?

    Thanks,

    Peter
    Reply

    Posted by: Peter M.June 15, 2012, 7:23 AM

    hi, i am in confusion and would like to know from you that,
    is bioluminescence signal in photos/sec/cm² just shown of tumors ? why it is not shown of other live cells of mouse other than tumor? is luciferin is selective to tumors or what would be the reasons?pls
    Reply

    Posted by: arjun t.November 7, 2012, 7:13 PM

    Could you share any data about group size, ie how much variability would I expect with subcutaneous tumors? Also, how does the presence of hair affect the measurement and reproducibility?
    Thanks.
    Reply

    Posted by: e w.June 24, 2014, 2:19 AM

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