使用IVIS频谱的乳腺肿瘤在体内生物发光成像

在小鼠乳腺肿瘤细胞表达荧光素酶植入皮下和可视化使用光学成像监测肿瘤的生长和发展非侵入性的一项纵向研究。

为了开始此过程，从冷冻茎中解冻表达荧光素酶的乳腺肿瘤细胞系，然后在培养物中扩增至 90% COF 流畅度。然后将悬浮细胞的连续稀释接种在 96 中。孔板暴露于荧光素，然后使用酶标仪确定产生 500 光子以上荧光发射的最佳细胞数，然后将细胞皮下注射到动物的侧面，然后注射荧光素酶。

最早可以在施用 Lucifer 后 10 分钟内对腹膜内细胞进行成像，并且可以在体内可视化肿瘤肿块长达一个月，直到坏死开始。大家好，我是来自加利福尼亚州阿拉米达 Caliper Life Sciences 成像实验室的 Ed Lim。今天，我们将向您展示一种使用生物发光非侵入性监测小鼠肿瘤生长的程序。

该程序在我们的实验室和 ivus 实验室使用，在全球范围内用于研究肿瘤的生长和发展，尤其是在用药物化合物治疗后。那么让我们开始吧。该程序首先准备用于注射到小鼠中的肿瘤细胞系。

多种表达荧光素酶的癌细胞系可用于生物发光临床前实验。这些细胞以无病原体的冷冻培养物形式提供，可在标准培养基中轻松生长，无需选择标记。在我们的实验中，我们将使用 41 Luke 两个小鼠乳腺肿瘤细胞系，该细胞系表达荧光素酶基因，该基因用作基因表达或肿瘤发生的光学指标。

在体内，我们将使用荧光素酶表达来无创地跟踪原发肿瘤的生长，但它也可用于定位和监测转移病灶。注射前必须验证荧光素酶活性，为此，通过胰蛋白酶收获 90% 汇合的培养瓶，然后进行计数。然后将 50， 000 个细胞分配到微量滴定板的单个孔中，并进行连续稀释。

以 150 μg/mL 的浓度将 Lucifer 添加到孔中并孵育 2 分钟。可以在 ivus 或发光酶标仪中对微孔板进行成像以确定表达水平。该细胞系每个细胞每秒可表达多达 6， 500 个光子，但每个细胞每秒 30 个光子以上的任何表达水平都可以在体内成功成像。

现在我们已经有了最佳活性的细胞，我们可以进行皮下注射步骤。为了促进肿瘤的最佳检测，我们使用的是 A 胸腺免疫功能低下的裸鼠品系。注射前，使用 3% ISO 氟麻醉动物 5 分钟以进行深度麻醉。

接下来，我们将 250， 000 个细胞皮下注射 100 微升 PBS 到侧腹。将细胞装入 1 毫升注射器中，并连接 26 号针头。用镊子轻轻提起皮肤，形成帐篷，并在基部注射细胞。

新注射的细胞可以立即成像。然后通过两次注射到腹膜腔中，每公斤体重总共 150 毫克的 Lucifer。在这项研究中，在荧光素注射后 10 分钟对动物进行成像，以确保光子通量一致。

我们将在下一步中向您展示这一点。在我们的实验中，我们将使用 IVUS 光谱体内成像系统，该系统使用冷却至负 90 摄氏度的背照式电荷耦合器件来实现最大灵敏度。为了支持绝对定量，系统在停机期间测量暗电荷，并在初始化期间运行自校准。

要开始成像，请初始化 IVUS 系统并设置实验的成像参数。选择 field of view。对于被成像的动物数量，使用整体麻醉歧管最多可以在仪器中保持五只动物。

该阶段恒定在 37 摄氏度以维持动物的体温。提供心电图端口以在活体图像软件曝光的压力过程中监测动物健康状况，时间 F 停止和 pix 结合可以根据细胞系的表达水平进行优化。在实验期间，可以随时更改这些设置，而不会影响定量结果。

Ivus 在白光下以定量生物发光或荧光信号获取动物的摄影图像，该图像叠加在图像上，生物发光信号以每秒光子数表示，并显示为强度图。调整图像显示，在图像中提供最佳对比度和分辨率，而不会影响定量。可以使用感兴趣的区域在注射部位测量细胞的发光。工具。

测量数据与与图像捕获相关的所有实验参数一起显示在表中，可以保存或导出。对于分析，可以获取和比较多张图像，并根据实验的性质进行几秒钟或几个月的纵向研究。我们将在零时间测量来自肿瘤的光子通量并监测 4 周。

每两周进行一次成像，来自肿瘤的光子通量与表达荧光素酶的活细胞数量成正比。因此，生物发光与植入后 5 天的肿瘤大小直接相关。肿瘤尚不可触及，但可以通过生物发光量化细胞，并且可以看到肿瘤正在积极生长。

在这个阶段，生物发光信号要强得多。可以调整曝光时间 f-stop 和像素旋转，使图像清晰且相机不会饱和。IVUS 会自动补偿光收集的变化。

因此，可以将这些测量值与之前和以后收集的测量值进行比较。在实验中。植入后 15 天，肿瘤可触及，生物发光测量已经生成了 15 天的数据。

在 28 天时，植入后肿瘤坏死，细胞开始死亡。通过卡尺测量估计的肿瘤大小不会发生明显变化，但肿瘤的发光会减少。指示细胞死亡口径和生物发光测量可以继续进行，直到达到人道终点。

由于缺氧或治疗方案引起的肿瘤坏死将表现为生物发光减少，即使它们不会减少肿瘤质量。我们刚刚向您展示了如何监测皮下肿瘤的发展，这是一种使用生物发光成像的简单异种移植小鼠模型。进行此程序时，请务必记住在植入前检查细胞的表达水平。

其次，为了获得最大的可重复性，请在荧光素注射后的最佳时间对动物进行成像。该方法的灵敏度使人们能够在早期监测肿瘤的发展，因为在卡尺能够可靠地测量肿瘤之前，很久就可以通过生物发光来测量肿瘤。请记住在每个阶段优化您的成像参数 发光信号不会饱和，但通过发光，可以定量监测动物数月，以研究缓解和复发效应。

就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。