In vivo Biolumineszenz Imaging von Brusttumoren mit IVIS Spectrum

Um dieses Verfahren zu beginnen, wird die Luziferase-exprimierende Brusttumorzelllinie von gefrorenen Stielen aufgetaut und dann in Kultur auf 90 % COF-Flüssigkeit expandiert. Die serielle Verdünnung der suspendierten Zellen wird dann in 96 eingesät. Well-Platten, die Luziferian ausgesetzt sind, und dann wird die optimale Zellzahl, die Fluoreszenzemissionen über 500 Photonen erzeugt, mit einer Platte bestimmt. Reader-Zellen werden dann subkutan in die Flanke eines Tieres injiziert, und dann wird Luciferase injiziert.

Intraperitoneale Zellen können bereits 10 Minuten nach der Verabreichung von Lucifer abgebildet werden, und die Tumormasse kann bis zu einem Monat in vivo bis zum Einsetzen der Nekrose sichtbar gemacht werden. Hallo, ich bin Ed Lim vom Imaging Laboratory bei Caliper Life Sciences in Alameda, Kalifornien. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren, mit dem sich das Tumorwachstum bei Mäusen nicht-invasiv mittels Biolumineszenz überwachen lässt.

Dieses Verfahren wird in unserem Labor und im ivus lab weltweit zur Untersuchung des Tumorwachstums und der Tumorentwicklung, insbesondere nach der Behandlung mit Wirkstoffen, eingesetzt. Also lasst uns loslegen. Dieses Verfahren beginnt mit der Vorbereitung der Tumorzelllinie für die Injektion in die Maus.

Eine breite Palette von Luciferase-exprimierenden Krebszelllinien kann für biolumineszierende präklinische Experimente verwendet werden. Diese Zellen werden als pathogenfreie Gefrierkultur zur Verfügung gestellt, die ohne Selektionsmarker problemlos in Standardmedien wachsen können. Für unser Experiment verwenden wir die 41 Luke zwei murine Brusttumorzelle, die das Luciferase-Gen exprimiert, das als optischer Indikator für die Genexpression oder Tumorgenese dient.

In vivo werden wir die Luciferase-Expression verwenden, um das Wachstum des Primärtumors nicht-invasiv zu verfolgen, aber sie kann auch zur Lokalisierung und Überwachung von metastasierenden Läsionen verwendet werden. Die Luziferase-Aktivität muss vor der Injektion überprüft werden, und um dies zu tun, wird ein 90%iger konfluenter Kolben mit Trypsin entnommen und dann gezählt. 50.000 Zellen werden dann in eine einzige Vertiefung einer Mikrotiterplatte abgegeben und eine serielle Verdünnung durchgeführt.

Luzifer wird mit 150 Mikrogramm pro Milliliter in die Vertiefungen gegeben und zwei Minuten lang inkubiert. Die Mikroplatte kann in ivus oder einem Lumineszenzplatten-Reader abgebildet werden, um die Expressionsniveaus zu bestimmen. Diese Zelllinie exprimiert bis zu 6.500 Photonen pro Sekunde und Zelle, aber jedes Expressionsniveau über 30 Photonen pro Sekunde und Zelle kann erfolgreich in vivo abgebildet werden.

Jetzt, da wir Zellen mit optimaler Aktivität haben, können wir mit dem Schritt der subkutanen Injektion fortfahren. Um eine optimale Detektion des Tumors zu ermöglichen, verwenden wir einen thymusimmungeschwächten Nacktmausstamm A. Vor der Injektion werden die Tiere fünf Minuten lang mit 3%igem ISO-Fluor für eine Tiefenanästhesie betäubt.

Als nächstes werden wir 250.000 Zellen in hundert Mikroliter PBS subkutan in die Flanke injizieren. Laden Sie die Zellen in eine Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel. Heben Sie die Haut vorsichtig mit einer Pinzette an, um ein Zelt zu bilden, und injizieren Sie die Zellen an der Basis.

Die neu injizierten Zellen können sofort abgebildet werden. Insgesamt werden dann 150 Milligramm Luzifer pro Kilogramm Körpergewicht über zwei Injektionen in die Bauchhöhle verabreicht. In dieser Studie werden die Tiere 10 Minuten nach der luziferischen Injektion abgebildet, um einen konsistenten Photonenfluss zu gewährleisten.

Das zeigen wir Ihnen im nächsten Schritt. Für unser Experiment verwenden wir das IVUS-Spektrum-In-vivo-Bildgebungssystem, das ein auf minus 90 Grad Celsius gekühltes ladungsgekoppeltes Gerät verwendet, um eine maximale Empfindlichkeit zu erreichen. Um die absolute Quantifizierung zu unterstützen, misst das System die Dunkelladung während der Ausfallzeiten und führt während der Initialisierung eine Selbstkalibrierung durch.

Um die Bildgebung zu starten, initialisieren Sie das IVUS-System und stellen Sie die Bildgebungsparameter für das Experiment ein. Sichtfeld auswählen. Für die Anzahl der abzubildenden Tiere können mit dem integrierten Anästhesieverteiler bis zu fünf Tiere im Instrument gehalten werden.

Das Stadium ist konstant bei 37 Grad Celsius, um die Körpertemperatur der Tiere zu halten. Ein EKG-Anschluss dient zur Überwachung der Tiergesundheit während stressiger Verfahren bei der Belichtung von Lebendbild-Softwares, Zeit, Blende und Bildbindung können basierend auf dem Expressionsniveau der Zelllinie optimiert werden. Diese Einstellungen können während eines Experiments jederzeit geändert werden, ohne dass sich dies auf das quantitative Ergebnis auswirkt.

Ivus nimmt ein fotografisches Bild des Tieres unter weißem Licht in einem quantitativen Biolumineszenz- oder Fluoreszenzsignal auf, das auf das Bild gelegt wird, das Biolumineszenzsignal wird in Photonen pro Sekunde ausgedrückt und als Intensitätskarte dargestellt. Die Bildanzeige ist so eingestellt, dass sie einen optimalen Kontrast und eine optimale Auflösung im Bild bietet, ohne die Quantifizierung zu beeinträchtigen. Die Lumineszenz der Zellen kann an der Injektionsstelle anhand eines interessierenden Bereichs gemessen werden. Werkzeug.

In der Tabelle werden die Messdaten zusammen mit allen experimentellen Parametern zur Bilderfassung angezeigt, die gespeichert oder exportiert werden können. Für die Analyse können mehrere Bilder aufgenommen und verglichen werden, sowie Längsschnittstudien über Sekunden oder Monate, je nach Art des Experiments. Wir werden den Photonenfluss aus dem Tumor zum Zeitpunkt Null messen und vier Wochen lang überwachen.

Bei der Bildgebung in zweiwöchentlichen Abständen ist der Photonenfluss aus dem Tumor proportional zur Anzahl der lebenden Zellen, die Luciferase exprimieren. Die Biolumineszenz korreliert also direkt mit der Tumorgröße fünf Tage nach der Implantation. Der Tumor ist noch nicht tastbar, aber die Zellen können durch Biolumineszenz quantifiziert werden und es wird gesehen, dass der Tumor aktiv wächst.

In diesem Stadium ist das Biolumineszenzsignal viel stärker. Die Belichtungszeit, die Blende und das Pixeldrehen können so eingestellt werden, dass das Bild klar ist und die Kamera nicht übersättigt. IVUS kompensiert automatisch die Änderungen in der Lichterfassung.

So konnten diese Messungen mit denen verglichen werden, die früher und später erhoben wurden. Im Experiment. 15 Tage nach der Implantation sind Tumore tastbar und die Biolumineszenzmessung hat bereits Daten für 15 Tage generiert.

Nach 28 Tagen werden Tumore nach der Implantation nekrotisch und die Zellen beginnen abzusterben. Die durch die Messschiebermessung geschätzte Tumorgröße ändert sich nicht nennenswert, aber die Lumineszenz des Tumors nimmt ab. Die Anzeige des Zelltods, des Kalibers und die Biolumineszenzmessung können fortgesetzt werden, bis ein humaner Endpunkt erreicht ist.

Tumornekrosen aufgrund von Hypoxie oder Behandlungsschemata werden durch eine verminderte Biolumineszenz angezeigt, auch wenn sie die Tumormasse nicht reduzieren. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie die subkutane Tumorentwicklung, ein einfaches Xenotransplantat-Mausmodell, mithilfe der Biolumineszenzbildgebung überwachen können. Wenn Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, daran zu denken, das Expressionsniveau Ihrer Zellen vor der Implantation zu überprüfen.

Zweitens, um eine maximale Reproduzierbarkeit zu erreichen, bilden Sie die Tiere zum optimalen Zeitpunkt nach der luziferischen Injektion ab. Die Sensitivität der Methode ermöglicht es, die Tumorentwicklung in frühen Stadien zu überwachen, da Tumore durch Biolumineszenz vermessen werden können, lange bevor sie zuverlässig mit Messschiebern gemessen werden können. Denken Sie daran, Ihre Bildgebungsparameter in jeder Phase zu optimieren. Dieses Lumineszenzsignal sättigt nicht, aber durch Lumineszenz können die Tiere monatelang quantitativ überwacht werden, um Remissions- und Rückfalleffekte zu untersuchen.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.