En vivo bioluminiscente de imágenes de tumores de mama mediante el espectro de IVIS

Mamaria células tumorales que expresan luciferasa se implanta de forma subcutánea en ratones y se visualizan con imágenes ópticas para controlar el crecimiento tumoral y el desarrollo de forma no invasiva en un estudio longitudinal.

Para comenzar este procedimiento, la línea celular tumoral mamaria que expresa luciferasa se descongela de tallos congelados y luego se expande en cultivo hasta un 90% de fluidez COF. La dilución en serie de las células suspendidas se siembra en 96. Las placas de los pocillos se exponen al luciferino y luego se determina el número óptimo de células que generan emisiones fluorescentes por encima de 500 fotones utilizando una placa A continuación, se inyectan células lectoras, por vía subcutánea en el flanco de un animal, y luego se inyecta luciferasa.

Las células intraperitoneales se pueden visualizar tan pronto como 10 minutos después de la administración de Lucifer, y la masa tumoral se puede visualizar hasta un mes in vivo hasta el inicio de la necrosis. Hola, soy Ed Lim del Laboratorio de Imágenes de Caliper Life Sciences en Alameda, California. Hoy os mostramos un procedimiento para monitorizar el crecimiento tumoral en ratones de forma no invasiva mediante bioluminiscencia.

Este procedimiento se utiliza en nuestro laboratorio y en el laboratorio ivus, el mundo para estudiar el crecimiento y desarrollo tumoral, especialmente después del tratamiento con compuestos farmacológicos. Así que comencemos. Este procedimiento comienza con la preparación de la línea celular tumoral para inyectarla en el ratón.

Una amplia gama de líneas celulares cancerosas que expresan luciferasa se puede utilizar para experimentos preclínicos bioluminiscentes. Estas células se proporcionan como un cultivo congelado libre de patógenos, que crecerá fácilmente en medios estándar sin necesidad de marcadores de selección. Para nuestro experimento, utilizaremos la línea celular de tumores mamarios murinos 41 Luke two, que expresa el gen de la luciferasa que sirve como indicador óptico de la expresión génica o la tumorgénesis.

In vivo, utilizaremos la expresión de luciferasa para rastrear el crecimiento del tumor primario de forma no invasiva, pero también se puede utilizar para localizar y monitorizar lesiones metastásicas. La actividad de la luciferasa debe verificarse antes de la inyección y, para ello, se recolecta un matraz con un 90% de confluente mediante tripsina y luego se cuenta. A continuación, se dispensan 50.000 células en un solo pocillo de una placa de microtitulación y se realiza una dilución en serie.

Lucifer se añade a los pocillos a 150 microgramos por mililitro y se incuba durante dos minutos. La microplaca se puede visualizar en ivus o en un lector de placas luminiscentes para determinar los niveles de expresión. Esta línea celular expresa hasta 6.500 fotones por segundo por célula, pero cualquier nivel de expresión superior a 30 fotones por segundo por célula puede ser visualizado con éxito in vivo.

Ahora que tenemos células de actividad óptima, podemos proceder a la etapa de inyección subcutánea. Con el fin de facilitar la detección óptima del tumor, estamos utilizando una cepa de ratón desnudo A inmunodeprimido tímico. Antes de la inyección, los animales se anestesian con flúor ISO al 3% durante cinco minutos para la anestesia profunda.

A continuación, inyectaremos 250.000 células en un centenar de microlitros de PBS por vía subcutánea en el flanco. Cargue las células en una jeringa de un mililitro y coloque una aguja de calibre 26. Levanta la piel suavemente con pinzas para hacer una tienda de campaña e inyecta las células en la base.

Las células recién inyectadas se pueden obtener imágenes inmediatamente. A continuación, se administra un total de 150 miligramos de Lucifer por kilogramo de peso corporal a través de dos inyecciones en la cavidad peritoneal. En este estudio, se toman imágenes de los animales 10 minutos después de la inyección luciferina para garantizar un flujo de fotones constante.

Te lo mostraremos en el siguiente paso. Para nuestro experimento, utilizaremos el sistema de imágenes in vivo del espectro IVUS, que utiliza un dispositivo acoplado de carga diluida enfriado a menos 90 grados Celsius para lograr la máxima sensibilidad. Para admitir la cuantificación absoluta, el sistema mide la carga oscura durante el tiempo de inactividad y ejecuta una autocalibración durante la inicialización.

Para iniciar la obtención de imágenes, inicialice el sistema IVUS y establezca los parámetros de imagen para el experimento. Seleccione el campo de visión. Para el número de animales que se están fotografiando, se pueden mantener hasta cinco animales en el instrumento utilizando el colector anestésico integral.

La etapa se encuentra a una temperatura constante de 37 grados centígrados para mantener la temperatura corporal en los animales. Se proporciona un puerto de electrocardiograma para monitorear la salud animal durante procedimientos estresantes en la exposición al software de imagen viva, el tiempo F-stop y la unión de imágenes se pueden optimizar en función del nivel de expresión de la línea celular. Esta configuración se puede cambiar en cualquier momento durante un experimento sin afectar al resultado cuantitativo.

Ivus adquiere una imagen fotográfica del animal bajo luz blanca en una señal cuantitativa bioluminiscente o fluorescente, que se superpone a la imagen, la señal bioluminiscente se expresa en fotones por segundo y se muestra como un mapa de intensidad. La visualización de la imagen se ajusta para proporcionar un contraste y una resolución óptimos en la imagen sin afectar a la cuantificación. La luminiscencia de las células se puede medir en el lugar de inyección utilizando una región de interés. Herramienta.

Los datos de medición se muestran en la tabla junto con todos los parámetros experimentales relacionados con la captura de imágenes, que se pueden guardar o exportar. Para el análisis, se pueden adquirir y comparar múltiples imágenes y realizar estudios longitudinales que abarcan segundos o meses, dependiendo de la naturaleza del experimento. Mediremos el flujo de fotones del tumor en el tiempo cero y lo monitorearemos durante cuatro semanas.

Con imágenes a intervalos quincenales, el flujo de fotones del tumor es proporcional al número de células vivas que expresan luciferasa. Por lo tanto, la bioluminiscencia se correlaciona directamente con el tamaño del tumor a los cinco días después de la implantación. El tumor aún no es palpable, pero las células se pueden cuantificar a través de la bioluminiscencia y se observa que el tumor está creciendo activamente.

En esta etapa, la señal de bioluminiscencia es mucho más fuerte. El tiempo de exposición, el número f y el giro de píxeles se pueden ajustar para que la imagen sea clara y la cámara no se sature. IVUS compensa automáticamente los cambios en la recogida de luz.

Por lo tanto, estas mediciones podrían compararse con las recogidas anteriormente y después. En el experimento. A los 15 días después de la implantación, los tumores son palpables y la medición de la bioluminiscencia ya ha generado 15 días de datos.

A los 28 días, los tumores postimplantación se vuelven necróticos y las células comienzan a morir. El tamaño del tumor estimado por la medición del calibrador no cambia apreciablemente, pero la luminiscencia del tumor disminuirá. La indicación del calibre de muerte celular y la medición de la bioluminiscencia pueden continuarse hasta que se alcance un punto final humano.

La necrosis tumoral debida a la hipoxia o a los regímenes de tratamiento se indicará por la reducción de la bioluminiscencia, aunque no reduzcan la masa tumoral. Acabamos de mostrarle cómo monitorear el desarrollo de tumores subcutáneos, un modelo simple de ratón de xenoinjerto utilizando imágenes bioluminiscentes. Al realizar este procedimiento, es importante recordar verificar el nivel de expresión de sus células antes de la implantación.

En segundo lugar, para obtener la máxima reproducibilidad, tome imágenes de los animales en el momento óptimo después de la inyección luciferina. La sensibilidad del método permite monitorear el desarrollo del tumor en etapas tempranas porque los tumores se pueden medir por bioluminiscencia mucho antes de que puedan medirse de manera confiable con calibradores. Recuerde optimizar sus parámetros de imagen en cada etapa Esa señal de luminiscencia no satura, pero por luminiscencia, los animales pueden ser monitoreados cuantitativamente durante meses para estudiar los efectos de remisión y recaída.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.