IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

루시페라제 표현 내유 종양 세포는 생쥐의 subcutaneously 이식 및 비 invasively 종단 연구에 종양이 성장과 발전을 모니터 광학 이미징을 사용하여 시각입니다.

이 절차를 시작하기 위해 유선종양 세포주를 발현하는 루시페라아제를 얼린 줄기에서 해동한 다음 배양에서 90%COF 유창성으로 확장합니다. 그런 다음 부유 세포의 연속 희석을 96년에 파종합니다. 웰 플레이트(Well plate)를 루시퍼(Luciferian)에 노출시킨 다음 500 광자 이상의 형광 방출을 생성하는 최적의 세포 수를 플레이트를 사용하여 측정합니다. 리더 세포를 동물의 옆구리에 피하로 주입한 다음 루시페라아제를 주입합니다.

복강내 세포는 루시퍼 투여 후 10분 이내에 영상화할 수 있으며, 괴사가 시작될 때까지 생체 내에서 최대 한 달까지 종양 덩어리를 시각화할 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 캘리포니아 알라메다에 있는 Caliper Life Sciences의 이미징 실험실에서 근무하는 Ed Lim입니다. 오늘은 생물 발광을 사용하여 비침습적으로 마우스의 종양 성장을 모니터링하는 절차를 보여드리겠습니다.

이 절차는 당사 실험실과 전 세계 ivus 실험실에서 특히 약물 화합물 치료 후 종양 성장 및 발달을 연구하는 데 사용됩니다. 시작하겠습니다. 이 절차는 마우스에 주입하기 위해 종양 세포주를 준비하는 것으로 시작됩니다.

암 세포주를 발현하는 광범위한 루시퍼라아제를 생물 발광 전임상 실험에 사용할 수 있습니다. 이러한 세포는 병원균이 없는 동결 배양물로 제공되며, 선택 마커가 필요 없이 표준 배지에서 쉽게 성장할 수 있습니다. 이 실험에서는 유전자 발현 또는 종양 발생의 광학 지표 역할을 하는 루시페라제 유전자를 발현하는 41 Luke two murine 유방 종양 세포주를 사용할 것입니다.

In vivo에서는 루시페라아제 발현을 사용하여 원발성 종양의 성장을 비침습적으로 추적할 수 있지만, 전이성 병변을 찾고 모니터링하는 데에도 사용할 수 있습니다. 루시페라아제 활성은 주입 전에 확인해야 하며, 이를 위해 트립신으로 90%의 융합 플라스크를 수확한 다음 계수합니다. 50, 000 세포는 microtiter 플레이트의 단일 웰에 분배되고 연속 희석이 수행됩니다.

루시퍼를 밀리리터당 150마이크로그램으로 웰에 첨가하고 2분 동안 배양합니다. microplate는 ivus 또는 발광 플레이트 리더에서 이미지화하여 발현 수준을 결정할 수 있습니다. 이 세포주는 세포당 초당 최대 6,500개의 광자를 발현하지만, 세포당 초당 30 광자를 초과하는 발현 수준은 in vivo에서 성공적으로 이미징할 수 있습니다.

이제 최적의 활성을 보이는 세포가 생겼으므로 피하 주사 단계로 진행할 수 있습니다. 종양의 최적 검출을 용이하게 하기 위해 우리는 A 흉선 면역 저하 누드 마우스 균주를 사용하고 있습니다. 주사 전에 동물은 깊은 마취를 위해 3% ISO 불소를 사용하여 5분 동안 마취합니다.

다음으로, 우리는 옆구리로 100 마이크로 리터 PBS에 있는 250, 000의 세포를 피하로 주입할 것입니다. 1밀리리터 주사기에 세포를 넣고 26게이지 바늘을 부착합니다. 집게로 피부를 부드럽게 들어 올려 텐트를 만들고 바닥의 세포를 주입합니다.

새로 주입된 세포는 즉시 이미징할 수 있습니다. 그런 다음 체중 1kg당 총 150mg의 루시퍼를 복막강에 두 번 주사하여 투여합니다. 이 연구에서는 일관된 광자 플럭스를 보장하기 위해 루시퍼 주입 후 10분 후에 동물을 이미지화합니다.

다음 단계에서 이를 보여드리겠습니다. 이 실험에서는 최대 감도를 달성하기 위해 섭씨 음의 90도로 냉각된 역박형 전하 결합 장치를 사용하는 IVUS 스펙트럼 생체 내 이미징 시스템을 사용할 것입니다. 절대 정량 분석을 지원하기 위해 시스템은 가동 중단 시간 동안 다크 차지를 측정하고 초기화 중에 자체 보정을 실행합니다.

이미징을 시작하려면 IVUS 시스템을 초기화하고 실험에 대한 이미징 매개변수를 설정합니다. 시야각을 선택합니다. 이미징되는 동물의 수에 대해 통합 마취 매니폴드를 사용하여 기기에서 최대 5마리의 동물을 유지할 수 있습니다.

이 단계는 동물의 체온을 유지하기 위해 섭씨 37도로 일정하게 유지됩니다. EKG 포트는 생동감 있는 이미지 소프트웨어 노출, 시간, F-stop 및 pix 결합에서 스트레스가 많은 절차 중 동물의 건강을 모니터링하기 위해 제공되며, 세포주의 발현 수준에 따라 시간 F-stop 및 pix 결합을 최적화할 수 있습니다. 이러한 설정은 정량적 결과에 영향을 주지 않고 실험 중 언제든지 변경할 수 있습니다.

Ivus는 정량적 생물 발광 또는 형광 신호에서 백색광 아래에서 동물의 사진 이미지를 획득하며, 이는 이미지에 오버레이되며, 생물 발광 신호는 초당 광자로 표현되고 강도 맵으로 표시됩니다. 이미지 디스플레이는 정량 분석에 영향을 주지 않고 이미지에서 최적의 대비와 해상도를 제공하도록 조정됩니다. 세포로부터의 발광은 관심 영역을 사용하여 주입 부위에서 측정할 수 있습니다. 도구.

측정 데이터는 이미지 캡처와 관련된 모든 실험 매개변수와 함께 표에 표시되며, 저장하거나 내보낼 수 있습니다. 분석을 위해 여러 이미지를 획득 및 비교할 수 있으며 실험의 성격에 따라 몇 초 또는 몇 개월에 걸친 종단 연구가 가능합니다. 시간 0에서 종양에서 광자 플럭스를 측정하고 4주 동안 모니터링할 것입니다.

격주 간격으로 이미징하면 종양에서 발생하는 광자 플럭스는 루시페라아제를 발현하는 살아있는 세포의 수에 비례합니다. 따라서 생물 발광은 이식 후 5일째 되는 시점의 종양 크기와 직접적인 상관관계가 있습니다. 종양은 아직 만져지지 않지만 생물 발광을 통해 세포를 정량화할 수 있으며 종양이 활발하게 성장하는 것으로 보입니다.

이 단계에서는 생물 발광 신호가 훨씬 더 강합니다. 노출 시간, f-stop 및 픽셀 회전을 조정하여 이미지가 선명하고 카메라가 포화되지 않도록 할 수 있습니다. IVUS는 집광의 변화를 자동으로 보정합니다.

따라서 이러한 측정값은 이전 및 나중에 수집된 측정값과 비교할 수 있습니다. 실험에서. 이식 후 15일이 지나면 종양을 만질 수 있으며 생물 발광 측정을 통해 이미 15일간의 데이터가 생성되었습니다.

28일이 되면 착상 후 종양이 괴사하고 세포가 죽기 시작합니다. 캘리퍼스 측정으로 추정된 종양 크기는 눈에 띄게 변하지 않지만 종양의 발광은 감소합니다. 세포 사멸 범위 표시 및 생물 발광 측정은 인도적인 종말점에 도달할 때까지 계속될 수 있습니다.

저산소증 또는 치료 요법으로 인한 종양 괴사는 종양 질량을 감소시키지 않더라도 생물 발광이 감소하는 것으로 표시됩니다. 생물 발광 이미징을 사용하여 간단한 이종 이식 마우스 모델인 피하 종양 발달을 모니터링하는 방법을 보여드렸습니다. 이 절차를 수행할 때 이식 전에 세포의 발현 수준을 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

둘째, 재현성을 극대화하기 위해 루시퍼 주입 후 최적의 시간에 동물을 이미지화합니다. 이 방법의 민감도로 인해 종양은 캘리퍼로 안정적으로 측정하기 훨씬 전에 생물 발광으로 측정할 수 있기 때문에 초기 단계에서 종양 발달을 모니터링할 수 있습니다. 각 단계에서 이미징 매개변수를 최적화하는 것을 잊지 마십시오.발광 신호는 포화되지 않지만 발광을 통해 동물을 수개월 동안 정량적으로 모니터링하여 관해 및 재발 효과를 연구할 수 있습니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.