JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of Developmental Biology

You have subscription access to videos in this collection through your user account.

Automatic Translation

This translation into Japanese was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

好中球細胞外トラップ:それらを生成して可視化する方法

1, 1, 1,2, 1,2, 2

1Core Facility Microscopy, Max Planck Institute for Infection Biology, 2Cellular Microbiology, Max Planck Institute for Infection Biology

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    好中球細胞外トラップ(NETS)は、病原性細菌、真菌、寄生虫を戦うために重要な自然免疫機構です。ここでは、ヒトの血液から好中球顆粒球を分離するやネットを形成するためにそれらを有効にする方法を説明します。我々は、光と電子顕微鏡内のネットを可視化する準備のテクニックを紹介。

    Date Published: 2/24/2010, Issue 36; doi: 10.3791/1724

    Cite this Article

    Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them. J. Vis. Exp. (36), e1724, doi:10.3791/1724 (2010).

    Abstract

    好中球顆粒球は、末梢血中の白血球の最も豊富に存在するグループです。プロの食細胞として、彼ら巻き込む細菌とその抗菌顆粒はファゴソームと融合するときに細胞内にそれらを殺す。活性化により、彼らは一緒に病原体に結合する細胞外繊維を形成顆粒のタンパク質とクロマチンを解放:私たちは、その好中球が微生物を殺すの追加の方法を持っています。これらの新規な構造、または好中球細胞外トラップは(NETS)、病原性因子を低下させ、細菌1、真菌2および寄生虫3を殺す。ネットの構造骨格はDNAであり、そして彼らはDNasesの存在下で速やかに分解される。従って、DNasesを表現する細菌は、4より病原性があります。 TEM、SEM、免疫蛍光法および生細胞イメージング技術を組み合わせて相関顕微鏡を用いて、我々は、刺激によって、好中球の核は、その形状を失うとEUとヘテロクロマチンが均質化することを示している可能性があります。その後、核膜と顆粒膜は、NETコンポーネントの混合を可能に崩壊する。最後に、NETSは、細胞膜の区切りとしてリリースされています。この細胞死のプログラム(NETosis)は、アポトーシスとネクローシスとは区別され、NADPHオキシダーゼ5による活性酸素種の生成に依存する。

    好中球細胞外トラップは、急性炎症のサイトで豊富です。 NETSは、バインドの微生物という、拡散を防ぐ、および病原性因子を分解し、好中球は、さらに彼らの寿命を超えて、その抗菌機能を発揮できるようにするため、病原体を殺すために抗菌剤の高い局所濃度を確保する自然免疫応答の形のように見える。証拠が高まっている、しかし、そのネットもその疾患に関与している自己免疫症候群から不妊6の範囲。

    我々は、末梢ヒト血液の7から好中球顆粒球を分離し、NETSを形成するためにそれらを刺激する方法を説明します。また、我々は、光と電子顕微鏡内のネットを視覚化するプロトコルが含まれます。

    Protocol

    1。ヒト血液からPMN分離

    抗凝固剤としてEDTAまたはヘパリン(10 U / ml)で約24ミリリットルのヒトの血液を使用してください。

    1. 15ミリリットルファルコンチューブに6ミリリットルHistopaque 1119を追加し、慎重にレイヤ上に5〜7ミリリットルの全血。
    2. ブレーキなしで800 × gで20分間遠心する。
    3. 吸引して廃棄黄色と透明な上部層を、新鮮なファルコンチューブに顆粒球を含む低赤相を転送する。
    4. 300 × gで10分間PBSと遠心機でファルコンチューブを充填することにより細胞を洗浄
    5. その間に2ミリリットル10倍PBSで18 mlのパーコールを混合して100%のパーコール溶液を調製。 1X PBSは85%、80%、75%、70%、65%パーコール4mlの溶液を調製して。
    6. 降順で互いの上にすべての割合のレイヤー2ミリリットルでPercoll勾配で2ファルコンチューブを準備します。
    7. 遠心分離上清を除去した後、PBS 4 mlでペレットを再懸濁します沈降した細胞を組み合わせる。
    8. グラデーションの各上に再懸濁の慎重にレイヤ2ミリリットル。
    9. ブレーキなしで800 × gで20分間遠心する。
    10. 遠心分離後に末梢血単核細胞でトップ層は65%層の大部分を削除し、新たなファルコンチューブに85%層まで、白残りinterphasesを収集する。
    11. PBSと300 × gで10分間、遠心分離でファルコンチューブを充填することにより細胞を洗浄
    12. PBSの2ミリリットルで上清と再懸沈殿細胞を(通常> 95%がPMNいる)を取り外します。
    13. 血球計算板を用いて細胞を数える。

    2。アクティベーションPMNは

    1. 各ウェルに滅菌した13ミリメートル円形のガラスカバースリップ(#1,5)を置くことによって、24ウェル細胞培養プレートを準備します。
    2. シード2ウェルあたり500μLRPMIで× 10 5細胞(ヒト血清アルブミン2%を含む)と37℃CO 2インキュベーターで1時間インキュベート℃に
    3. 一方RPMIに600 nMのPMA溶液を調製し、ウェルあたり100μlの細胞に加える。 37℃までCO 2インキュベーター内で4時間まで15分のインキュベート℃まで
    4. PBSに溶解した4%(最終濃度)パラホルムアルデヒドで細胞を固定する。

    PMAは、ポジティブコントロールとして機能し、これまでNET形成を誘導するための最も強力なエージェントです。また、病原体と他​​の刺激または共培養は、NET誘導に使用することができます。

    追加のパラレルサンプルが用意されている場合、時間の経過は、進行している間、NET形成のそれぞれの状態を確認することができます。 SYTOXグリーン(Invitrogen社)のような非透過性のDNA色素は非固定細胞に添加されている場合は、唯一の細胞外DNAが検出されます。新しいネットの形成以来、何らかの形で、各時点ごとに1つのパラレルサンプルを使用する必要がある、SYTOXの存在下で低下している。

    3。免疫標識NETの検出

    ネットがさらに固定後に非常に壊れやすく、大半が準備中に迷子になるそうでなければ、細心の注意を払って操作する必要があります。

    1. 慎重にカーブした針で端にそれを持ち上げて、24ウェル培養プレートから添付された細胞とガラスカバースリップを削除し、微細な鉗子でそれをつかむ。 PBSのドロップに逆さまにカバースリップを置く。これは、試験管のスタンドを覆うパラフィルムシートで行うことができます。このような5分間3回洗浄する。
    2. トリトンX - 100室温で1分間、細胞を透過性に0.5%の低下で同じようにカバースリップをインキュベートする。 1分間PBSで3回洗浄する。
    3. パラフィルムやウェットティッシュで湿度の高い部屋を準備します。カバーは​​、ブロッキングバッファー(5%ロバ血清)のドロップに逆さま伝票はレイと37℃で30分間インキュベート℃に
    4. ブロッキングバッファーで一次抗体、例えば、MS抗ヒストンとRB抗好中球エラスターゼを、希釈する。
    5. 一次抗体の低下にブロッキングバッファーから直接湿度の高い部屋でスリップをカバーし、37℃で1時間インキュベート転送℃に
    6. PBSで5分間3回洗浄する。
    7. 二次抗体、例えばDKアンチMS Cy2とし、ブロッキング緩衝液でDK抗RBのCy3を、希釈する。
    8. 37℃で1時間二次抗体とインキュベートのドロップ℃の上に湿潤なチャンバにカバースリップを転送する
    9. PBSで5分間3回洗浄する。染色DNAはUV励起または遠赤色励起のためのDRAQ5とを必要とdistで二回洗うヘキスト33342(1μg/ mlの)のいずれかで5分間、あなたの蛍光顕微鏡のオプションによって異なります。水。
    10. スライドガラス上にMowiolの20μlのドロップを設定し、逆さまに細胞をカバースリップをマウントします。細胞がカバーガラスとスライドの間にあることがあります。 Mowiolのドロップは、カバースリップがドロップで配置される均質な厚さの薄層を形成することになる。通常は、サンプルを押す必要はありません。あなたが非液浸レンズを使用する場合、試料は、検査の準備ができています。液浸レンズと顕微鏡分析のために、Mowiolは、サンプルの端に固化するまで約1時間のための試料は乾燥させて。

    4。走査型電子顕微鏡のための準備NETS(SEM)

    1. 2,5%のグルタルアルデヒドで24ウェルプレートにガラスカバースリップ上に細胞を固定ポスト。
    2. 24ウェル培養プレートから細胞を含むガラスカバースリップを外し、水滴に逆さまに置く。このような5分間3回洗浄する。
    3. 30分間0.5%OsO4とインキュベートを含む24ウェル細胞培養プレートに戻してカバースリップを転送します。
    4. 24ウェル培養プレートから細胞を含むガラスカバースリップを外し、水滴に逆さまに置く。このような5分間3回洗浄する。
    5. バック30分で1%タンニン酸とインキュベートを含む24ウェル細胞培養プレートにカバースリップを転送する。
    6. 繰り返しのステップ4.2から4.4
    7. 以下のレジメン(5分ごとに)を介して脱水。
      • 30%エタノール
      • 50%エタノール
      • 70%エタノール
      • 80%エタノール
      • 90%エタノール
      • 100%エタノール
      • 100%エタノール
      • 100%エタノール
    8. 臨界点乾燥機と乾燥試料中にスリップをカバー転送する。
    9. 薄層蒸発器を使用して5nmのプラチン/カーボン層を持つ試料のコートの表面

    5。代表的な結果:

    分離方法は、通常95%より高い純度を持つ無刺激の実行可能な好中球が得られます。刺激後の異なる時点で固定したとき、免疫染色のプロトコルはNETosisの平坦化細胞、核の小葉の喪失、顆粒の消失と核(ヒストンすなわち)と粒状の(すなわちの増加重複につながる核の完全性の間に形態学的変化のシーケンスを示しています。好中球エラスターゼ)染色。このプロトコルは、好中球による病原体の特異的な相互作用を分析する出発点として利用することもできます。この相互作用は、走査型電子顕微鏡のための準備のプロトコルを使用してより詳細に解剖することができます。

    NET蛍光

    NETコンポーネント(青= DNA、赤=ヒストン、緑=好中球エラスターゼ)について染色刺激好中球のサンプル。画像はNETローカリゼーション、DNAとヒストンの核局在化と好中球エラスターゼのための顆粒状パターンのほかに、表示されます。

    SEM PMA刺激

    非刺激およびPMA -刺激好中球を示す電子顕微鏡写真をスキャン。刺激後、好中球は平らにならすとネットを生成する。

    SEMネットと赤痢菌

    NETSの中に閉じ込め赤痢菌の高分解能SEM像。

    Discussion

    提供するプロトコルでは、かなりの純度で非刺激好中球の分離、NET形成の誘導とNETosis時の形態学的変化の解析が可能になります。つまり、緩く接続されたネットのほとんどが失われます過酷な洗浄条件を避け、慎重に試料を取り扱うときは、別の刺激条件下でのNETの形成(持続時間、刺激)の量を比較することができます。好中球/病原体相互作用、刺激の順序、他の免疫細胞との相互作用:この点において、提供されているプロトコルは、より洗練されたシナリオを分析する手法を確立するための出発点として利用することもできます。

    Disclosures

    References

    1. Brinkmann, V. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 Forthcoming.
    2. Urban, C. F., Reichard, U., Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps capture and kill Candida albicans yeast and hyphal forms. Cell Microbiol. 8, 668-676 (2006).
    3. M, E. Leishmania amazonensis promastigotes induce and are killed by neutrophil extracellular traps. PNAS. 106, 6748-6753 (2009).
    4. Buchanan, J. T., Simpson, A. J., Aziz, R. K., Liu, G. Y., Kristian, S. A., Kotb, M., Feramisco, J., Nizet, V. DNase expression allows the pathogen group A Streptococcus to escape killing in neutrophil extracellular traps. Curr Biol. 14, 396-400 (2006).
    5. Fuchs, T. A. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
    6. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nat Rev Microbiol. 5, 577-582 (2007).
    7. Aga, E., Katschinski, D. M., van Zandbergen, G., Laufs, H., Hansen, B., Muller, K., Solbach, W., Laskay, T. Inhibition of the spontaneous apoptosis of neutrophil granulocytes by the intracellular parasite Leishmania major. J Immunol. 169-898 (2002).

    Comments

    22 Comments

    Hi,
    The protocol looks good for imaging- 1) how can you be sure if you are isolating only NETs but not also neutrophil ²) how intact are the NETs? 3) Is there a particular protocol for isolating only NETs? if not how hard is it?
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 16, 2010, 8:19 AM

    Hi - the protocol is about isolating neutrophils and induce NET formation, not about NET isolation. If you fix NETs in the supernatant of stimulated neutrophils they are pretty intact. There is a protocol for isolation and quantification of NETs in Fuchs et al.
    Reply

    Posted by: Volker B.September 1, 2010, 11:02 AM

    Hi! good day... how i can download this video? would you tell about this? i need to explain to my students...
    Thanks!
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 31, 2010, 3:14 PM

    Please send us an email to support@jove.com
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 31, 2010, 3:23 PM

    Sirs,
    This is a wonderful video on a hot subject. I will give a talk on our own work on NETS, and I would like to show the audience the way you prepare NETS. Could you permit me use your video in my talk?. If so, would you allow me to download the video?.Thank you very much.
    o. rojas-espinosa (rojas_espinosa@hotmail.com)
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 3, 2010, 9:06 PM

    Hello from Greece,
    I am trying to follow your protocol and althought Imanaged to isolate the PMNs when I am trying to activate them with the pma I get results similar to the control group. I noticed that sytox has a toxic effect on the PMNs. Could you please tell me what is the concentration you are using? I would also like to ask you what is the Human Albumin serum you are using (cat no. and putity) and if you think I could use BSA cell culture tested instead.

    Ariana Gavriil, Ph.D.
    Immunology and Transplantation Center
    Foundation for Biomedical Research
    4 Soranou Ephessiou, 115 ²7
    Athens, Greece
    Tel.: +30²10 65 97 335, Fax.: +30²10 65 97 348
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 15, 2011, 6:48 AM

    try to use 100nM of PMA from Molecular Probes
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 1, 2011, 5:38 PM

    What a great video. Thank you very much. The idea to present video protocols is wonderful. Unfortunately, my university has no subscription. It seems to be too expensive. I think these kind of videos would save a lot of money being spent in unseccessful efforts. :)

    Do you think that NETs can bee seen in cytospins?
    After fixation of cells in Formalin or Methanol, what would be the reason for the fragility of NET structures?
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 17, 2012, 6:55 AM

    Hello all,
    I am wanting to properly prepare and perform immunostaining (using primary and secondary antibodies) on a pus-filled clinical sample to determine the presence of neutrophil nets, complete with (hopefuly) organisms trapped/attached of "caught in the act" of biofilm growth. If anyone would be so kind, please share some insight on how to proceed with this idea. I know that I will have to be careful during collection and slide preparation as to keep any nets intact, and I know I will have to fix the slides somehow before I start the staining process. Everything else is beyond my knowledge. Any ideas on how to proceed?
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 3, 2012, 11:06 AM

    Dear colleagues, thank you very much for sharing the experience.
    Could you tell me where did you obtain H²A-H²B-DNA complex antibody (they seems to be not commercial) or recommend some other anti Histone antibodies?
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 7, 2012, 8:17 AM

    This is a novice Percoll user question. I prepared the percoll solutions with PBS as described under "1. PMN Isolation from human blood" step number 5. I made large enough volumes to prepare multiple gradients over a period of several days, and the solutions were stored @ 4C until needed. The first two neutrophil separations worked fine in that the RBCs pelleted as expected. The last two times resulted in incomplete pelleting of the RBCs leaving some left mixed in with the neutrophils. Should I be making fresh percoll solutions each time? Any other suggestions?
    Reply

    Posted by: M C.September 24, 2012, 2:29 PM

    It is OK to store made up Percoll solutions at 4°C for some days or even weeks and the fact of storing them alone should not cause incomplete separation of the RBCs. The lowest band of PMN just above the RBC pellet often contains a larger portion of RBCs and can be omitted if you don't need the highest possible PMN count. If the RBC pellet dŒsn't form clearly at all there might still be something wrong with your solutions or the exact layering of the discontinuous gradient. First, try running the tubes longer to see if sedimentation was just slower than normal. There could also be causes in the preceding steps, so you might have to do more troubleshooting.
    Reply

    Posted by: Christian G.September 25, 2012, 4:37 AM

    Thank you for your quick response and suggestions!
    Reply

    Posted by: M C.September 25, 2012, 8:20 AM

    Thanks for the great video! In which step (if any) would it be possible to stop the protocol and continue the next day? Perhaps after fixing with the formaldehyde I could wash and store them overnight in PBS at 4C. I am trying to visualize NETs from mouse neutrophils collected from the bone marrow and just purifying the PMN takes half a day.
    Reply

    Posted by: Xavier R.November 21, 2012, 12:23 PM

    Hi,thanks for your great video! It's very useful for me. I want to know whether the cover slips were lysinated before incubated neutrophils. Thank you !
    Reply

    Posted by: Yin X.June 25, 2013, 9:00 AM

    We think it works best on glass slips that were not treated with polylysin.
    Reply

    Posted by: Christian G.June 25, 2013, 11:25 AM

    But ,if not,how did neutrophils seed at slips stabe since they were not adherent cell?
    Reply

    Posted by: Yin X.June 25, 2013, 11:34 AM

    Dear sir:
    For my experiment I am trying to isolate mature Neutrophils from peritoneal cavity of mice.
    Can you help me to answer my few questions please.

    How to prepare 3% thioglycollate broth?
    how many hours we should wait after injecting 3% thioglycollate to get mature neutrophils?

    Thank you
    Piya Patel
    Reply

    Posted by: Piya P.January 17, 2014, 11:54 AM

    hi,

    Thank you for the protocol :) it is well explain !
    Have questions tough :
    -for fixation : you put the PFA within the media or do you first take it out then rinse with PBS then fix ?
    - can I fix and freeze the coverslip at -80°C to do the staining later ?
    - can I use mounting media with DAPI instead of staining DAPI then mounting ?

    Thank you very much !
    Anthony
    Reply

    Posted by: anthony l.May 6, 2014, 12:56 PM

    Hi Anbthony,

    We put double concentrated PFA directly into the warm medium. Rinsing would destroy most of the NETs. Onced the specimens are fixed you can keep them for some time until staining. We never freeze them but keep them refrigerated after replacing the fixative with PBS (gently!). You can use DAPI-containing embedding media but we get less background when we wash the cells after DAPI staining.

    Good luck, Volker
    Reply

    Posted by: Volker B.May 7, 2014, 9:52 AM

    Hi,

    Thank for the tips !
    It worked beautifully ;).
    I fixed with PFA as you explain, then wash 1x pbs carrefully Freeze them at -80°C and used mouting media with DAPI.
    PMA use : 600nM for 1h at 37°C.

    Thanks!
    anthony
    Reply

    Posted by: anthony l.May 15, 2014, 8:22 AM

    Hi, I have a few questions regarding the isolation.
    Is it possible to isolate PMN's from buffy coat or is it only possible do this from Whole blood?
    How many PMN's is it possible to get if following this protocol? How much blood did you start with?
    Is it important to use 15 mL tubes when using both Histopaque and Percoll, or does it work with 50 mL tubes?

    Thank you in advance!
    Helena

    Reply

    Posted by: Helena E.May 20, 2014, 9:31 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter