JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Spanish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

Células vivas, imágenes y análisis cuantitativo de las células epiteliales embrionarias en Xenopus laevis

1, 1,2

1Bioengineering, University of Pittsburgh, 2Developmental Biology, University of Pittsburgh

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Biology. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 204.236.254.124, User IP: 204.236.254.124, User IP Hex: 3438083708

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Xenopus epitelios embrionarios son un sistema modelo ideal para estudiar los comportamientos celulares, tales como el desarrollo de la polaridad y cambiar de forma durante la morfogénesis epitelial. Histología tradicional de muestras fijas cada vez se complementa con células vivas de imagen confocal. Aquí se demuestra métodos para aislar los tejidos de rana y visualizar en directo las células epiteliales y su citoesqueleto utilizando células vivas, la microscopía confocal.

    Date Published: 5/23/2010, Issue 39; doi: 10.3791/1949

    Cite this Article

    Joshi, S. D., Davidson, L. A. Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1949, doi:10.3791/1949 (2010).

    Abstract

    Embrionario las células epiteliales servir como un modelo ideal para estudiar la morfogénesis, donde multicelulares tejidos experimentan cambios en su geometría, tales como cambios en el área de la superficie celular y la altura de la celda, y donde las células sufren mitosis y la migración. Además, las células epiteliales también pueden regular los movimientos morfogenéticos en los tejidos adyacentes

    Protocol

    Antes de comenzar

    1. Sintetizar ARNm tope de la plantilla de ADN que codifica la proteína lineal marcado con fluorescencia y el ARNm de purificar por métodos estándar (kit AmpliCap transcripción; Biotecnologías Epicentro, Madison WI). ARNm debe ser alícuotas para el uso del tiempo solo en tubos de 0,2 ml de centrífuga y se almacenan a -80 ° C.
    2. Métodos estándar para obtener los huevos, la fecundación in vitro y la eliminación de la capa de huevo se han descrito anteriormente 2. Un procedimiento para obtener huevos de rana Xenopus laevis mujeres se ha demostrado anteriormente 3. Fertilizar los óvulos in vitro inmediatamente después de su obtención a partir de las ranas hembra con testículos antes aisladas a partir de una rana macho. De jalea huevos 20 minutos después de la fecundación y se inyecta ARNm, proteínas, ADN, o dextrano de inmediato para permitir una difusión suficiente de reactivos microinyección. Inyecciones de más de una hora después de la fertilización a menudo no se difunden desde el sitio de inyección.
    3. Microinyección de ovocitos ha sido demostrada con anterioridad 4 utilizando una presión de la válvula de inyección controlada (PLI-100, Harvard Apparatus). Seguir un método similar para la inyección de ARNm en el hemisferio animal de embriones de rana en el 1 - a la fase de 4 células. La transferencia de embriones fertilizados al 3% Ficoll (Sigma, St. Louis MO) en 1x MBS (MBS-Ficoll) y microinject con el volumen deseado (2 a 4 nl) de las buenas prácticas agrarias tope mRNA dirigido a la membrana (mem-GFP) o F -actina (moe-GFP). Para obtener una distribución uniforme del ARNm se inyectan en 4 sitios equidistantes en el polo animal. Los embriones pueden permanecer en el MBS-Ficoll durante varias horas, pero necesitan ser transferidos a 1 / 3 x MBS antes del inicio de la gastrulación.

    Los materiales necesarios (artículos marcados con * se muestran en la Figura 1.)

    1. La disección con microscopio estereoscópico iluminación por fibra óptica. Una etapa de la disección de refrigeración es recomendable, pero opcional.
    2. Herramientas de pelo (pelo cuchillo y el lazo del pelo) *.
    3. Pinzas (Dumont n º 5 de acero inoxidable, herramientas de Bellas Ciencia, Foster City, CA) *.
    4. Saline modificado Barth medios de cultivo de embriones (MBS, 88 mM NaCl, 2,4 mM NaHCO 3, 1 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2, 0,41 mm (Cano 3) 2, 0,82 mM MgSO4, 10 mM HEPES (H3375, Sigma-Aldrich, St. Louis MO)).
    5. Danilchik para Amy explante cultura mediática (DFA, 53 mM NaCl 2, 5 mM Na 2 CO 3, 4,5 mM de gluconato de potasio, 32 gluconato sódico mM, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4). Incluye un 0,1% de albúmina sérica bovina con DFA (BSA; A7906, Sigma-Aldrich). DFA se filtra de manera estéril, pero puede ser en alícuotas de 50 ml tubos cónicos y se almacenan a -20 ° C. Antibióticos y antimicóticos (0,8% en los medios de comunicación, A5955, Sigma-Aldrich), debe añadirse a recién descongelado DFA para inhibir el crecimiento bacteriano o fúngico.
    6. 60 o 100 mm placas de Petri *.
    7. Cubierta de vidrio grande, 45 por 50 mm (12-544-F, # 1,5, Fisher Scientific, Hampton, Nueva Hampshire) *.
    8. Cubierta de vidrio pequeño, 24 por 40 mm (12-544C, # 1,5, Fisher Scientific).
    9. Grasa de silicona (de alto vacío, Dow Chemical) cargado en una jeringa "masilla-gun" *.
    10. Personalizado cámaras acrílico o arandelas de nylon (piezas pequeñas Inc., Miramar, FL) *. Cámaras de costumbre se puede moler en un taller mecánico de un 25 por 50 por 5 mm de acrílico del bloque para proporcionar una cámara interior que es de 1,2 cm por 2,8 cm. Esta cámara tiene un volumen de trabajo de 1,68 ml. Arandelas de nylon opcional se puede seleccionar en una variedad de tamaños, preferimos tamaños compatibles con 18 mm de diámetro de vidrio cubreobjetos circular.
    11. Lápiz de diamante *.

    Parte 1: La escisión de los explantes de tapa de los animales

    1. Cultivar los embriones en la etapa deseada 5 en 1 / 3 x MBS. La velocidad de desarrollo puede ser controlado con la cultura temperaturas entre 15 y 21 ° C a fin de que los experimentos se puede hacer en un momento conveniente del día. Temperatura ambiente se puede utilizar pero los embriones se desarrollan más rápidamente.
    2. La transferencia de embriones a DFA.
    3. Quitar las membranas vitelina el uso de fórceps.
    4. Bajo el microscopio estereoscópico de disección, los impuestos especiales de un explante tapa animal con pelo cuchillos y bucles de pelo-6. Uso el pelo de circuito para apoyar o sostener el embrión en una posición y el cuchillo de pelo para hacer una pequeña incisión en el polo animal de los embriones. El uso repetido de "giro-cortes", con el pelo cuchillo para hacer una incisión de 360 ​​° para eliminar el tope de los animales ectodermo del embrión. Con la práctica, se puede hacer cortes suaves que dan como resultado un daño mínimo a los explantes o células lisadas en el margen (Fig. 2A).
    5. Repita el paso 4 para extirpar 3-4 explantes animales tapa y proceda a la Parte 2. Hay que ser rápido, mientras que el corte de explantes, ya que tienen una tendencia a la pelota con rapidez. Una etapa de la disección de frío puede retrasar el proceso o, alternativamente, usted puede hacer menos explantes.

    Parte 2: Preparación de las cámaras, los explantes de carga, y sellar la cámara de la cultura a largo plazo

    1. Usograsa de silicona para pegar o sellar la cámara de acrílico para la cubierta de cristal de gran tamaño.
    2. Para reducir la adhesión de los explantes de la capa de vidrio de la copa dentro de la cámara con un sustrato no adhesivo mediante la incubación de la cámara de 2 a 4 horas a temperatura ambiente o de la noche a 4 ° C con 1% de BSA en 1 / 3 x MBS (BSA -MBS).
    3. Prepare pequeños fragmentos cubreobjetos (aprox. 2 de 8 mm) con un lápiz de diamante. Pre-capa con fragmentos de BSA-MBS.
    4. Enjuague BSA-MBS de la cámara y vuelva a colocar los medios de comunicación con DFA.
    5. Al consumo de animales tapa explantes (s) (Parte 1;. Fig. 2A) y la transferencia a la cámara. La posición de cada explante usando un secador de bucle (con capa epitelial hacia la parte inferior de la cámara) y suavemente fijar el explante en el lugar con un fragmento de cubreobjetos en manos de pequeños toques de grasa de alto vacío (Fig. 2B). Tenga mucho cuidado al presionar el cubreobjetos ya que la presión excesiva puede romper el explante. Explantes múltiples se pueden cargar en cada cámara en función del tamaño de los fragmentos pequeños cubreobjetos se utiliza para mantener los explantes en su lugar. Con la práctica de hasta 20 explantes se pueden cargar en la cámara de acrílico se describe aquí. Llene las cámaras con DFA hasta la tarde con la apertura en la parte superior. Utilice grasa de silicona para sellar la parte superior de la cámara con el 24 por 40 mm cubierta de vidrio. Agregar o quitar DFA para reducir las burbujas de aire en la cámara de sellado y desbordamiento de borrar de la cámara.
    6. Esta cámara sellada permitirá a la cultura a largo plazo y las imágenes en vivo de los explantes de tapa de los animales a través de la gran superficie, el cristal inferior de la cámara. Es crucial para mantener la superficie del vidrio inferior de la cámara libre de suciedad, grasa, o los medios de comunicación para obtener imágenes más tarde. Se recomienda la preparación de una toalla de papel de fondo placas de Petri para almacenar las cámaras, ya que están preparados para la imagen.

    Parte 3: de alta resolución en vivo de imágenes de microscopía confocal

    El protocolo de esta sección ha sido desarrollada para el uso de un microscopio confocal a disposición de nuestro laboratorio (Leica TCS SP5, Leica Microsystems, Bannockburn IL). Diferentes microscopios confocal puede requerir una ligera modificación y recomendamos a los usuarios seguir las instrucciones de operación respectivos.

    1. Encienda el sistema de imagen, inicializar la platina del microscopio, y encienda el láser adecuado para fluoróforos, es decir, el láser de argón para la fluoresceína o EGFP y 543 HeNe láser para la rodamina o RFP.
    2. Coloque la carcasa de una cámara los explantes en la platina del microscopio. Antes de colocar la cámara se mueven un objetivo adecuado en su lugar. Se recomienda utilizar una alta apertura numérica 20x objetivo de aire (0,7 na) para imágenes iniciales, se recomienda using1.4 na los objetivos de 40x o 63x de petróleo para obtener imágenes de alta resolución y seguimiento de células grandes campos. (Nota: la inmersión en aceite Una vez que se aplica a la precaución cuando se use el objetivo, utilizando un objetivo de aire para que no limiten el objetivo de inmersión en el aceite.) Utilice pequeñas pesas para mantener la cámara en su lugar.
    3. Uso de campo claro o fluorescencia de la iluminación y ajustar el enfoque hasta que vea los extremos apicales de las células superficiales. Tenga cuidado de no "crash" el objetivo en la base de la cámara. Evitar la inclusión o la producción de burbujas de aire cuando se utilizan los objetivos de inmersión en aceite. Una vez que las muestras se colocan con el "grueso" modo de posicionamiento, el cambio en el modo "fine" de posicionamiento.
    4. Recomendaciones para el ajuste de la imagen confocal para vivir:
      1. Potencia del láser debe ser lo más bajo posible: 1) para evitar decoloración, 2) para prevenir los efectos fototóxicas, y 3) para evitar cualquier puesta en marcha accidental del cambio celular forma 7. Láser de potencia requisito varía según el nivel de expresión y el tipo de periodistas molecular expresada en los embriones.
      2. Utilizar un formato de escaneo de 1024 x 1024 píxeles para imágenes en vivo, ya que proporciona buena resolución de imagen. Si necesita velocidad de refresco muy alta (mínimo es de 1.3s para nuestro sistema), a continuación, utilizar el formato de barrido de 512 por 512 píxeles. Esto reducirá la resolución de la imagen, pero aún así puede ser suficiente para extraer cantidad razonable de información.
      3. Ajustar el rango espectral de la emisión, dicroicas, excitación y filtros en su caso.
      4. Ajustar el agujero confocal de entre 1 y 1,5 unidades de Airy.
      5. Aumento de fotomultiplicador debe mantenerse a un nivel mínimo para reducir el ruido todavía proporcionar la señal suficiente para identificar las estructuras celulares y localización de la proteína.
      6. Ajuste el nivel de negro de compensación para ajustar el fondo para mejorar la calidad de las imágenes.
      7. Pasos (1) a (6) se aplica iterativamente para producir la mejor calidad de imagen posible. Imágenes de calidad debe resolver la estructura o las proteínas localizadas con intensidades de los píxeles en un amplio rango dinámico. Si los análisis cuantitativos son el objetivo no debe ser una cantidad mínima de cero píxeles intensidad o saturadas.
      8. Pasos (1), (3), (5) y (6) que sea necesario repetir para cada canal de fluorescencia adicionales para producir la mejor calidad de imagen para posibles.
      9. Cuando dos imágenes o sondas fluorescentes es importante asegurarse de que no hay un mínimo sangrado a través del espectro de una proteína a los espectros de emisión de una segunda proteína. Sangrado puede ser probada a través de la reducción de la potencia del láser emocionante la primera proteína y la observación de la señal producida en las longitudes de onda utilizadas por la segunda proteína. Sangrado a través del espectro se puede reducir con más opciones restrictivas de filtros o mediante la reducción de la potencia del láser utilizado para la excitación y el aumento de la ganancia utilizada para la detección de la proteína primero.
    5. Con la sintonía confocal utilizando estas directrices debería ser posible para capturar imágenes individuales a una profundidad focal, en modo XY (Fig. 3).
    6. Si uno está interesado en la recogida de time-lapse películas de un proceso que ocurre de forma dinámica, como cambiar de forma durante la contracción celda 7, uno tiene que elegir entre los modos alternativos confocal siguientes:
      1. XYT: Este modo permite recoger una serie de imágenes a través del tiempo, sin cambiar el plano Z. Utilizamos este modo para observar las fluctuaciones endógenas en las células epiteliales. Normalmente, se adquiere un marco cada 5 segundos durante 20 minutos para observar la variación endógena o cambia de forma inducida por la estimulación externa de las células epiteliales. Elección de frame-rate es completamente dependiente de lo que uno está interesado en la observación y la forma dinámica el proceso.
      2. XYZ: El uso de este modo, podemos cobrar una sola serie Z de la pila a través de las células epiteliales. Nuestra configuración predeterminada para recoger la serie Z son de 0,1 micras en un rango de 5 micras. Utilizamos este modo para determinar si se están produciendo cambios en el citoesqueleto sólo en una posición determinada, como en el nivel de las uniones adherentes, o en todas partes de la corteza celular.
      3. XZT (Fig. 3): Este modo se utiliza principalmente para observar los rápidos cambios en la organización apical-basal de células en el epitelio. Este modo es muy popular por su utilidad en la confirmación de que el modo de XYT es un periodista confiable de los cambios en el dominio de la célula apical, y que la adquisición de la imagen confocal no está a la deriva a lo largo del eje Z.
      4. XYZT: Este combina los modos de XYZ y XYT. Este modo puede proporcionar detalles ricos en el total apical-basal del epitelio de la dinámica, pero es lento para adquirir las pilas de la imagen completa y puede reducir severamente la viabilidad celular, debido a photobleaching y efectos fototóxicas.
    7. La calidad de imagen se puede mejorar hasta cierto punto mediante el uso de uno o una combinación de los cuatro enfoques: 1) un promedio de línea, 2) la acumulación de la línea, 3) un promedio de marco, y 4) la acumulación de marco. Estos modos de promedio para la adquisición de la imagen puede mejorar la calidad de imagen, pero reducirá la viabilidad de las células y requieren más tiempo para reunir las imágenes.
    8. Con todas las opciones cuidadosamente ajustado, recoger y guardar las imágenes, la serie Z-, y los datos de series de tiempo a un disco duro externo, servidor USB memory stick, o conectado a la red.
    9. Una vez que se haya completado el experimento, inferior al objetivo de la seguridad, limpiar el aceite del objetivo y la platina del microscopio con el papel de la lente, y el poder-el sistema confocal.

    Parte 4: en vivo de imágenes de F-actina microfilamentos

    Como se ha demostrado en la parte 3, la localización de la proteína de la membrana miembros de GFP se puede utilizar para la etiqueta fluorescente las membranas celulares. En vivo de imágenes de los sub-componentes celulares se logra mediante el uso de otras proteínas. Una proteína como moesina-GFP que contiene un dominio de F-actina de unión puede ser utilizada para etiquetar la F-actina en células vivas. Estrategias similares para células vivas, imágenes y colección de secuencias de lapso de tiempo seguir los procedimientos indicados en el apartado 3. En vivo de imágenes de F-actina implica más habilidades de microscopía de imagen miembros de las buenas prácticas agrarias ya que las estructuras son más finos y localizados con más fuerza que la membrana. Por ejemplo, las burbujas pequeñas en el aceite de inmersión puede producir artefactos aberración como visión borrosa o brillo variable en la imagen capturada. Por otra parte, la deriva en el pequeño centro o Z-avión puede causar moesina-GFP etiquetados cortical F-actina para mover fuera de foco. Por lo tanto, uno debe ser redoblar los esfuerzos para estabilizar el escenario, el explante, y la cámara, mientras que imágenes corticales F-actina y otras proteínas subcelular. Imágenes XY y XZT mostrando moesina-GFP etiquetados F-actina se muestran como ejemplos (Fig. 3B y "B).

    Parte 5: Análisis de Imágenes

    Imágenes y secuencias de lapso de tiempo obtenido en la sesión confocal en células vivas pueden ser analizados con el fin de probar las hipótesis sobre los cambios de forma o patrones de localización de la proteína. El ojo humano es a menudo la mejor herramienta para el análisis cualitativo, pero puede ser aumentado o automático mediante técnicas de análisis de imágenes para extraer los datos cuantitativos. Datos de imagen de Leica confocal se pueden guardar en un formato abierto, tales como. Archivos de imagen TIF formato o un formato propietario. LIF que conserva la información detallada sobre la condición microscopio durante la adquisición. Las dos cosas. TIF y los archivos. LIF pueden ser importados directamente por una J de análisis de imágenes de libre acceso de la imagen del programa (Rasband, WS, ImageJ, EE.UU. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EE.UU., http://rsb.info.nih.gov/ij /, 1997-2009) usando los formatos de Bio-plug-in (Kevin Eliceiri, los lugares, de la Universidad de Wisconsin, Madison, WI). En la siguiente sección se ofrecen dos ejemplos para ilustrar cómo los usuarios pueden iniciar el análisis cuantitativo de los datos de imagen confocal.

    1. Abrir cualquier archivo. TIF o archivo. LIF (Fig. 4 A y A ') ABIERTO Archivo>
    2. Ejemplo 1: Medir la superficie celular de una célula epitelial (Fig. 4B B''').
      1. Seleccione el área de Análisis> MEDIDAS DE AJUSTE.
      2. Seleccione un polígono de selección de herramientas de la barra de herramientas Imagen de J, y el esquema de la célula.
      3. Abra el Administrador de retorno de la inversión de Análisis> Herramientas> Administrador de retorno de la inversión y añadir el esquema para que pulsando la tecla [Control + T], que es el acceso directo para agregar una nueva "zona de interés" o retorno de la inversión para el Administrador de retorno de la inversión. Es importante añadir esta selección y guardar el ROI conjunto ya que se puede volver en otro momento y hacer las mediciones de otros parámetros. Grupos de regiones de interés salvo (haga clic en "Guardar") puede ser recargada posteriormente para su posterior análisis.
      4. Se puede repetir el paso (c) con cualquier número de células en una imagen y agregar el rendimiento de la inversión de ROI Manager. Una vez que uno tiene suficiente rendimiento de la inversión registrado, haga clic en "medida" en el ROI Manager. En la ventana de resultados, ahora uno puede ver las áreas contra el rendimiento de la inversión. Dimensiones de la imagen que los valores correspondientes en los parámetros de medición.
    3. Ejemplo 2: Medir la intensidad de una membrana celular (Fig. 4C C''').
      1. Seleccione "línea recta" de la herramienta de la barra de herramientas de imagen J, y dibujar una línea en la imagen que es perpendicular a la membrana de la célula de interés y atraviesa la membrana. Esta selección de línea recta es otro tipo de retorno de la inversión y se puede añadir a la Gerente de retorno de la inversión que el anterior.
      2. Parcela intensidades relativas en unidades arbitrarias por analizar el perfil de PARCELA>. Guardar como imagen y como lista de valores haciendo clic en Guardar y LIST> Archivo> Guardar como, respectivamente, en la pantalla PLOT.
    4. Diversas medidas cuantitativas se pueden hacer usando J imagen en función de los intereses de los investigadores y qué hipótesis se están probando. Parcela Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Seattle, WA) o Sigma (Systat Software Inc., San Jose, CA) se puede utilizar para representar gráficamente los datos. Otros ejemplos de análisis de imágenes se han presentado con anterioridad 7.

    Figura 1
    Figura 1. Material necesario. A) Herramientas necesarias para la microcirugía y el montaje de la cámara de cultivo. Placa de Petri (a), hoja de cubierta de gran tamaño (b), herramientas de pelo (c), lápiz de diamante (d), fórceps (e), grasa de silicona "pistola de calafateado" (f), la arandela de nylon (g), y la cultura de acrílico personalizado cámara (h). B) Primer plano de la navaja el pelo, y C) de bucle de cabello.

    Figura 2
    Figura 2. Escisión de explantes de tapa de los animales. Un esquema) de la manipulación de microcirugía utiliza para eliminar un explante tapa animal (d, dorsal, v, ventral, ah, animal hemisferio, vh, vegetal hemisferio). B) Esquema de explante (e) colocado debajo de un fragmento de cubreobjetos en su lugar por grasa de silicona (s) con la superficie apical adosados ​​a la cubierta de vidrio BSA (g). El explante se coloca de modo de la capa epitelial es el más cercano al objetivo de microscopio (m). C) Animal tapa explante (flecha roja) se cultiva en DFA y alojado en la cámara de acrílico (flecha azul) en un portaobjetos de vidrio de gran tamaño (flecha negro) y en su lugar por fragmentos de vidrio cubreobjetos y grasa de silicona.

    Figura 3
    Figura 3. Las células epiteliales observadas con microscopio confocal. A) Un punto de vista XY y una XZ (A ') para ver la localización de la membrana de las buenas prácticas agrarias (mem-GFP) etiquetados hoja epitelial. B) Un punto de vista XY y XZ vista (B) de un moesina-GFP etiquetados F-actina corteza celular apical.

    Figura 4
    Figura 4. Análisis de la imagen usando la imagen J. A) Imagen original de una membrana de localización de hoja de buenas prácticas agrarias de células marcadas. Un punto de vista de alta resolución (A ') de la caja de inserción en (A) muestra dos "regiones de interés" o ROI. El esquema de color amarillo-indica el límite de una sola célula seleccionada mediante la herramienta polígono (véase el panel B) y la línea verde indica el camino de un perfil de intensidad a través de un límite de celda-celda seleccionada utilizando la herramienta de línea recta (ver panel C). ) B 'Método para seleccionar las opciones de medición y elegir la opción "Area" (B''). Una vez que el retorno de la inversión se ha seleccionado puede ser almacenado en el Administrador de retorno de la inversión (B'''). C) El método para seleccionar las opciones de medida para el perfil tomó. C'') Una vez que la línea recta o una herramienta de línea segmentada que se elija el perfil de intensidad a lo largo del camino se pueden trazar con el "perfil de Parcela" de comandos. Una lista de intensdad los valores también se pueden guardar en un formato de hoja de cálculo fácil de leer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Hemos presentado los protocolos experimentales utilizados regularmente en nuestro laboratorio para la imagen del citoesqueleto cambian dinámicamente en la corteza celular apical y oscilantes las membranas celulares de las células epiteliales en los embriones de Xenopus. Se debe utilizar estos protocolos como punto de partida para la creación de imágenes en vivo de las formas de las células epiteliales, la optimización de este protocolo es esencial, y algunos de los valores cambian en función del tipo de sistema de microscopio que se tiene y el tipo de proteínas que uno está interesado en las imágenes . En conjunto, los pasos del protocolo (aislamiento de explante, la imagen y la visualización de los componentes celulares y subcelulares, y la metodología de cuantificación) ofrezca un procedimiento global para estudiar la morfogénesis epitelial.

    Aspectos críticos para recordar

    1. Es importante preparar de alta calidad de ARNm para micro-inyección en embriones. tubos de ARNm se almacenan en el hielo para evitar la degradación. Una vez probado, los tubos se almacenan en -80 ° C en pequeñas alícuotas para evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación.
    2. Es esencial para inyectar ARNm en los sitios múltiples para asegurar una distribución uniforme de ARNm en un gran campo de las células del ectodermo tapa animal.
    3. Además de antibiótico / antimicótico es esencial para la cultura a largo plazo para controlar el crecimiento de bacterias y hongos.
    4. Se debe tener cuidado mientras se presiona explantes en los fragmentos cubreobjetos desde hace más de lo necesario la presión puede romper los explantes.
    5. Mientras que la imagen, los valores óptimos son esenciales para obtener datos con la máxima calidad de imagen posible, que refleja comportamientos y la dinámica endógena de la proteína. Seleccionar la configuración óptima es cuestión de práctica y experiencia.
    6. Para el análisis de imágenes ImageJ es muy recomendable. ImageJ es una excelente herramienta de código abierto que puede ser descargado y modificado con la adición de macros personalizadas-por escrito o descargado y plug-ins.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    No hay conflictos de interés declarado.

    Acknowledgements

    Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (R01-HD044750), una subvención de carrera de la Fundación Nacional de Ciencias, y el apoyo de la Asociación Americana del Corazón (A partir de Grant-in-Aid). Los autores agradecen a los miembros del laboratorio de Davidson: HY Kim, M. y J. von Dassow Zhou (para ayudar en las tareas de laboratorio al día), y Zhang Lin por su ayuda en la biología molecular y la síntesis de ARNm. Reconocemos los esfuerzos experimentales de los laboratorios de la rana (especialmente Ray Keller y Doug DeSimone) que han contribuido a alguna parte de este protocolo, mediante el desarrollo y pruebas de los distintos métodos en los últimos años. Damos las gracias a Richard Harland y Wallingford Juan para sus regalos de tipo de miembros de las buenas prácticas agrarias y los plásmidos moesina-gfp respectivamente.

    References

    1. Ninomiya, H. and Winklbauer, R., Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension. Nat Cell Biol 10 (1), 61 (2008).
    2. Kay, B. K. and Peng, H. B., Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Academic Press, New York. (1991); Sive, H.L. , Grainger, R. M. , and Harlard, R., Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000).
    3. Cross, M. K. and Powers, M., Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp (18) (2008).
    4. Cohen, S., Au, S., and Pante, N., Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp (24) (2009).
    5. Nieuwkoop, P. D. and Faber, J., Normal Tables of Xenopus laevis (Daudin). Elsevier North-Holland Biomedical Press, Amsterdam. (1967).
    6. Davidson, L. A., Ezin, A. M., and Keller, R., Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton 53 (3), 163 (2002).
    7. Joshi, S. D., von Dassow, M., and Davidson, L. A., Experimental control of excitable embryonic tissues: three stimuli induce rapid epithelial contraction. Exp Cell Res 316 (1), 103 (2010).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter