Imagerie des cellules vivantes et de l'analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis

L’objectif général de cette procédure est de démontrer des méthodes d’imagerie en direct et de quantification simples pour analyser la morphologie des cellules épithéliales embryonnaires. Ceci est accompli en préparant d’abord tous les outils et appareils. La deuxième étape de la procédure consiste à exciser X explan des embryons de grenouille et à les loger dans des chambres pour une culture à long terme.

La troisième étape de la procédure consiste à collecter des images à haute résolution des cellules épithéliales en temps réel. La dernière étape de la procédure consiste à quantifier les détails morphologiques des cellules épithéliales à l’aide de l’Image J.En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui montrent des zones cellulaires suivies et des intensités membranaires grâce à la microscopie confocale à haute résolution. Bonjour, je suis Sagar Joshi du Davidson Laboratory du département de bio-ingénierie de l’Université de Pittsburgh.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’imagerie de cellules vivantes et d’analyse quantitative des cellules épithéliales embryonnaires de Xenos lavia. Nous utilisons cette procédure pour étudier les changements cytosquelettiques cellulaires en temps réel. Alors commençons.

Pour préparer des chambres pour la culture de capuchons d’animaux, utilisez de la graisse silicone pour sceller une chambre en acrylique personnalisée ou une petite rondelle en nylon sur un grand verre de protection de 45 x 50 millimètres. Ajoutez un millilitre de 1 % BSA dans un tiers XMBS dans la chambre. Enduisez de petits fragments de lamelles avec la même solution et incubez pendant deux à quatre heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Pour réduire l’adhérence de l’explan X sur le verre, rincez et remplissez la chambre avec du fluide DFA jusqu’à ce que, juste avant le transfert dans le xs, rincez les fragments de lamelle de la même manière. Ensuite, immergez-les dans une boîte d’embryons de culture DFA qui ont été micro-injectés au stade d’une à quatre cellules avec le MR NA souhaité au stade souhaité dans un tiers XMBS. À l’aide d’une pipette de transfert à ouverture oblique, transférez les embryons dans une boîte d’AFD sous un stéréomicroscope à dissection.

Utilisez des pinces pour éliminer les embryons afin d’exciser une plante de CapEx animale. Utilisez une boucle de cheveux pour soutenir un embryon dans une position. Utilisez un couteau à cheveux pour faire une petite incision dans le poteau de l’animal.

Faites des coupes lisses répétées pour étendre l’incision et retirer l’ectoderme du capuchon. Accise trois ou quatre fois explan de la même manière. Et utilisez une pipette de transfert pour les déplacer vers la chambre de culture préparée.

À l’aide de la boucle de cheveux, positionnez chaque explant X de manière à ce que l’épithélium fasse face au fond de la chambre. À l’aide de forceps. Tenez un fragment de lamelle en son centre.

Trempez les extrémités dans de la graisse silicone. Placez un fragment sur chaque explan X. Fixez légèrement chaque fragment en place avec de petites touches de graisse silicone.

En prenant soin de ne pas briser complètement l’explan X avec une force excessive. Remplissez la chambre de DFA, enduisez les bords supérieurs de la chambre de graisse silicone. Scellez ensuite le dessus avec une lamelle de 24 x 40 millimètres.

Ajustez le niveau du DFA à l’intérieur de la chambre pour réduire les bulles d’air et utilisez un mouchoir pour éponger tout débordement. Les plantes X peuvent maintenant être cultivées à long terme dans la chambre scellée pendant une journée à température ambiante, en mettant en place l’objectif 20 x d’un microscope confocal. Placez la chambre contenant l’explication X sur la platine du microscope et placez de petits poids d’équilibrage sur la chambre pour la maintenir en position sous fond clair.

Ajustez la mise au point et utilisez le positionnement de la trajectoire pour visualiser les extrémités apicales des cellules superficielles. Passez à la fluorescence et à un objectif de puissance plus élevée. Pour collecter des images uniques ou des films en accéléré de l’épithélium explan, réglez l’acquisition pour obtenir la meilleure image possible.

Reportez-vous à la partie écrite de ce protocole pour obtenir des conseils sur le réglage et l’imagerie. Maintenir la puissance laser aussi faible que possible. Capturez des images ou des vidéos en accéléré de l’épithélium x explan.

Veuillez consulter la partie écrite du protocole pour obtenir des suggestions sur la collecte de données. Les fichiers d’images confocales peuvent être exploités pour obtenir des données de différentes manières. Voici deux exemples de comment analyser des fichiers de données à l’aide du logiciel d’analyse Image J avec le plugin de formats bio.

Pour mesurer l’aire cellulaire d’une cellule épithéliale, déroulez le menu Analyser et cliquez sur Définir les mesures. Sélectionnez l’outil de sélection dans la barre d’outils et tracez le contour de la cellule dans le menu d’analyse, sélectionnez les outils, puis le gestionnaire de retour sur investissement. Pour ouvrir le gestionnaire de régions d’intérêt, appuyez sur la touche Ctrl t.

Pour ajouter le contour au gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez et ajoutez autant de contours que vous le souhaitez à partir de l’image. Cliquez ensuite sur Enregistrer pour enregistrer le retour sur investissement défini dans le gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur mesurer.

La fenêtre des résultats affichera désormais les zones mesurées de chaque retour sur investissement. Pour mesurer l’intensité d’une membrane cellulaire, sélectionnez l’outil Ligne droite dans la barre d’outils de l’image J. Tracez une ligne perpendiculaire à travers la membrane.

Appuyez sur CTRL T comme dans l’exemple précédent. Pour ajouter la sélection au gestionnaire de retour sur investissement, déroulez le menu d’analyse et cliquez sur le profil de tracé pour générer un graphique d’intensités relatives sur la ligne. Pour enregistrer le graphique sous forme d’image, cliquez sur Enregistrer dans la nouvelle fenêtre de tracé qui s’affiche.

Déroulez le menu de la liste pour classer, puis enregistrez sous Nous venons de vous montrer comment afficher en direct et quantifier les cellules épithéliales embryonnaires à partir d’excised animal CapEx explan. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’ajouter un antibiotique et un antibiotique à l’AFF. Pour décourager la croissance bactérienne et fongique, faites très attention lorsque vous pressez les explants sous les lamelles de couverture, car une pression supérieure à celle nécessaire peut briser l’explan.

Il est également important de ne pas oublier d’avoir des réglages optimaux sur le microscope confocal pour obtenir des données d’image de qualité maximale. Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.