Imagerie des cellules vivantes et de l'analyse quantitative des cellules embryonnaires épithéliales Xenopus laevis

L'objectif général de cette procédure est de démontrer des méthodes d'imagerie en direct et de quantification simple permettant d'analyser la morphologie des cellules épithéliales embryonnaires. Cela est réalisé en préparant tout d'abord les outils et l'appareillage nécessaires. La deuxième étape de la procédure consiste à exciser l'explants X des embryons de grenouille et à les placer dans des chambres pour une culture à long terme.

La troisième étape de la procédure consiste à acquérir en temps réel des images haute résolution des cellules épithéliales. La dernière étape de la procédure consiste à quantifier les détails morphologiques des cellules épithéliales à l'aide d'ImageJ. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant les aires cellulaires suivies et les intensités membranaires grâce à une microscopie confocale haute résolution. Bonjour, je suis Sagar Joshi du laboratoire Davidson, du département de génie biomédical de l'Université de Pittsburgh.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'imagerie de cellules vivantes et d'analyse quantitative des cellules épithéliales embryonnaires de Xenos lavia. Nous utilisons cette procédure pour étudier en temps réel les changements du cytosquelette cellulaire. Commençons donc.

Pour préparer les chambres destinées à la culture de calottes animales, utilisez de la graisse silicone pour sceller une chambre en acrylique sur mesure ou une petite rondelle en nylon sur un grand couvre-objet de 45 par 50 millimètres. Ajoutez un millilitre de BSA à 1 % dans un tiers de XMBS à la chambre. Recouvrez de petits fragments de lamelles avec la même solution et incubez de deux à quatre heures à température ambiante ou toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Pour réduire l'adhérence de l'X explan au verre, rincez et remplissez la chambre avec du milieu DFA juste avant de transférer les xs, rincez les fragments de lamelle de la même manière. Ensuite, immergez-les dans une boîte contenant des embryons en culture DFA qui ont été micro-injectés au stade une à quatre cellules avec l'ARNm désiré jusqu'au stade désiré dans un tiers de XMBS. Utilisez une pipette de transfert à ouverture inclinée pour transférer les embryons dans une boîte de DFA sous un microscope stéréo de dissection.

Utilisez une pince pour immobiliser les embryons afin d'exciser une usine CapEx animale. Utilisez une boucle de cheveu pour maintenir un embryon en une position donnée. Utilisez un couteau en cheveu pour pratiquer une petite incision au pôle animal.

Effectuez plusieurs coupes lisses et rapides pour prolonger l'incision et retirer l'ectoderme du capuchon. Excisez trois ou quatre x explants de la même manière. Utilisez ensuite une pipette de transfert pour les déplacer vers la chambre de culture préparée.

À l'aide de la boucle capillaire, positionner chaque explant X de manière à ce que l'épithélium soit orienté vers le fond de la chambre. À l'aide de pinces, tenir un fragment de lame couvre-objet par son centre.

Trempez les extrémités dans de la graisse au silicone. Placez un fragment au-dessus de chaque X explan. Fixez légèrement chaque fragment en place à l’aide de petites touches de graisse au silicone.

Veiller à ne pas écraser complètement l'explan X avec une force excessive. Remplir la chambre avec le DFA et enduire les bords supérieurs de la chambre de graisse silicone. Puis sceller le dessus avec une lame couvre-objet de 24 x 40 millimètres.

Ajustez le niveau du DFA dans la chambre afin de réduire les bulles d'air et utilisez du papier absorbant pour éliminer tout excès. Les plantes X peuvent désormais être cultivées sur le long terme dans la chambre scellée pendant un jour à température ambiante ; mettez en place l'objectif 20 x d'un microscope confocal. Placez la chambre contenant l'explant X sur la platine du microscope et ajoutez de petites masses d'équilibrage sur la chambre pour la maintenir en position en champ clair.

Réglez la mise au point et utilisez le positionnement grossier pour visualiser les extrémités apicales des cellules superficielles. Passez à la fluorescence et à un objectif de plus fort grossissement. Pour acquérir des images individuelles ou des séries temporelles de l'épithélium explanté, ajustez les paramètres d'acquisition afin d'obtenir la meilleure qualité d'image possible.

Se référer à la partie écrite de ce protocole pour des conseils sur le réglage et l'acquisition d'images. Maintenir la puissance du laser aussi faible que possible. Acquérir des images ou des vidéos en prise de vue séquentielle de l'épithélium x.

Consulter la partie écrite du protocole pour des suggestions concernant la collecte des données. Les fichiers d'images de microscopie confocale peuvent être exploités pour extraire des données de diverses manières. Voici deux exemples d'analyse de fichiers de données à l'aide du logiciel Image J avec le plugin Bio-Formats.

Pour mesurer la surface cellulaire d'une cellule épithéliale, déroulez le menu analyser et cliquez sur « définir les mesures ». Sélectionnez l'outil de sélection dans la barre d'outils, puis délimitez la cellule dans le menu analyser, sélectionnez outils, puis le gestionnaire de zones d'intérêt. Pour ouvrir le gestionnaire des zones d'intérêt, appuyez sur Ctrl+T.

Pour ajouter le contour au gestionnaire de zones d'intérêt (ROI), sélectionnez et ajoutez autant de contours que souhaité à partir de l'image. Ensuite, cliquez sur « Enregistrer » pour sauvegarder le jeu de zones d'intérêt dans le gestionnaire de ROI. Cliquez sur « Mesurer ».

La fenêtre des résultats affichera désormais les aires mesurées de chaque région d'intérêt. Pour mesurer l'intensité de la membrane cellulaire, sélectionnez l'outil de ligne droite dans la barre d'outils d'ImageJ. Tracez une ligne perpendiculaire traversant la membrane.

Appuyez sur CTRL T comme dans l'exemple précédent. Pour ajouter la sélection au gestionnaire de zones d'intérêt (ROI), déroulez le menu analyser et cliquez sur profil de tracé afin de générer un graphique des intensités relatives le long de la ligne. Pour enregistrer le graphique en tant qu'image, cliquez sur enregistrer dans la nouvelle fenêtre de tracé qui apparaît.

Déroulez le menu vers Fichier, puis enregistrez sous. Nous venons de vous montrer comment réaliser une imagerie en direct et quantifier des cellules épithéliales embryonnaires à partir d’explant CapEx excisé. Lors de cette procédure, il est important de se souvenir d’ajouter un antibiotique et un antimycosique au DFA. Pour limiter la croissance bactérienne et fongique, faites particulièrement attention lorsque vous appuyez sur les explants sous les lamelles, car une pression excessive peut écraser l’explant.

Il est également important de se rappeler de configurer de façon optimale le microscope confocal afin d'obtenir des données d'images de qualité maximale. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.