活细胞成像与胚胎上皮细胞的定量分析 Xenopus laevis

本实验的总体目标是演示活体成像及简单的定量分析方法，以研究胚胎上皮细胞的形态。首先需准备好所有工具和设备。实验的第二步是从蛙胚胎中分离X外植体，并将其置于培养 chamber 中进行长期培养。

该实验流程的第三步是实时采集上皮细胞的高分辨率图像。最后一步是使用 ImageJ 对上皮细胞的形态学细节进行定量分析。最终可以获得显示通过高分辨率共聚焦显微镜追踪的细胞区域和膜强度的结果。大家好，我是来自匹兹堡大学生物工程系Davidson实验室的Sagar Joshi。

今天我们将向您展示一种对 Xenos lavia 胚胎上皮细胞进行活细胞成像和定量分析的实验方法。我们利用该方法研究活体细胞骨架的实时动态变化。现在让我们开始吧。

为准备用于培养动物帽的培养室，使用硅脂将定制的丙烯酸腔室或小型尼龙垫圈密封至一块较大的45 × 50毫米盖玻片上。向腔室内加入1毫升含1% BSA的三分之一浓度XMBS溶液。用相同溶液包被小片盖玻片，并在室温下孵育2至4小时，或在4摄氏度下过夜。

为了减少X表皮组织对玻璃的黏附，在转移X样本前，用DFA培养基冲洗并充满培养室。以同样方式冲洗盖玻片碎片，然后将其浸入含有DFA培养胚胎的培养皿中；这些胚胎在1至4细胞阶段已通过显微注射导入了所需浓度的mRNA，并在1/3 XMBS中培养至所需发育阶段。在解剖体视显微镜下，使用带有斜口的转移移液管将胚胎转移至盛有DFA的培养皿中。

使用镊子固定胚胎，以切除动物极帽状外植体。用毛发环将胚胎固定在某一位置。用毛发刀在动物极做一小切口。

通过反复进行轻柔的切削操作以延长切口，并去除帽状外胚层。以相同方式分离三到四个x explan，然后使用移液管将其转移至已准备好的培养室中。

使用毛细环将每个X explan放置到位，使上皮朝向 chamber 的底部。使用镊子，夹住盖玻片碎片的中心。

将末端蘸取硅脂。在每个 X explan 上放置一片碎片。用少量硅脂轻轻固定每片碎片的位置。

注意操作时不要用力过猛而完全压碎 X explan。用 DFA 填充腔室，并在腔室的顶部边缘涂抹硅脂，然后用一块 24 × 40 毫米的盖玻片密封顶部。

调节培养室中DFA的液面高度以减少气泡，并用纸巾吸去任何溢出的液体。X植株现在可于密封培养室中在室温下长期培养一天，将共聚焦显微镜的20倍物镜移至工作位置。将含有X外植体的培养室置于显微镜载物台上，并在培养室上放置小型平衡配重，以在明场条件下固定其位置。

调节焦距，使用粗调定位观察表层细胞的顶端。切换至荧光模式并使用更高倍数的物镜。为采集外植上皮的单张图像或延时录像，需优化采集参数以获得最佳图像质量。

有关调谐和成像的提示，请参阅本方案的书面部分。尽可能降低激光功率。采集 x explan 上皮的图像或延时视频。

有关数据采集的建议，请参阅方案的书面部分。共聚焦图像文件可通过多种方式进行数据挖掘。以下是使用带 Bio-Formats 插件的 Image J 分析软件分析数据文件的两个示例。

为了测量上皮细胞的细胞面积，下拉分析菜单并点击“设置测量”。从工具栏中选择选区工具，在分析菜单中勾勒出细胞轮廓，选择“工具”，然后进入“ROI 管理器”。要打开感兴趣区域管理器，请按 Ctrl+T。

要将轮廓添加到 ROI 管理器，请从图像中选择并添加任意数量的轮廓。然后单击保存，将 ROI 集保存至 ROI 管理器中。单击测量。

结果窗口现在将显示每个 ROI 的测量面积。要测量细胞膜的强度，请从 ImageJ 工具栏中选择直线工具，在膜上垂直画一条线。

按 CTRL T，如同上一个示例所示。要将选区添加到 ROI 管理器，请下拉分析菜单并点击剖面图（plot profile），以生成沿该直线的相对强度图。要将该图形保存为图像，请在新出现的绘图窗口中点击保存。

下拉列表菜单，选择“文件”，然后选择“另存为”。我们刚刚向您展示了如何对切除的动物帽外植体（CapEx explan）中的胚胎上皮细胞进行活体成像和定量分析。在进行此操作时，务必要记得在DFA中添加抗生素和抗真菌剂，以抑制细菌和真菌的生长。在盖玻片下压紧外植体时需格外小心，因为过大的压力可能会压碎外植体。

还需要注意在共聚焦显微镜上设置最佳参数，以获得最高质量的图像数据。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。