活细胞成像和胚胎上皮细胞的定量分析非洲爪蟾
May 23rd, 2010
非洲爪蟾胚胎上皮细胞是一个理想的模型系统来研究细胞极性的发展，并在上皮细胞形态发生改变形状等行为。传统的固定标本组织学正越来越多地辅以活细胞共聚焦成像。在这里，我们展示了隔离青蛙组织和可视化生活的上皮细胞和其骨架采用活细胞共聚焦显微镜的方法。
该程序的总体目标是展示实时成像和简单的定量方法，以分析胚胎上皮细胞形态。这是通过首先准备好所有工具和设备来实现的。该程序的第二步是从青蛙胚胎中切除 X explan，并将它们安置在腔室中进行长期培养。
该程序的第三步是实时收集上皮细胞的高分辨率图像。该程序的最后一步是使用 Image J 量化上皮细胞的形态学细节，最终，可以通过高分辨率共聚焦显微镜获得显示跟踪细胞区域和膜强度的结果。大家好，我是来自匹兹堡大学生物工程系戴维森实验室的 Sagar Joshi。
今天，我们将向您展示 Xenos lavia 胚胎上皮细胞的活细胞成像和定量分析程序。我们使用该程序来研究实时细胞细胞骨架变化。那么让我们开始吧。
为了准备用于培养动物盖帽的腔室，请使用硅脂将定制的丙烯酸腔室或小尼龙垫圈密封到 45 x 50 毫米的大盖玻片上。在三分之一的 XMBS 中加入 1 毫升 1% BSA。用相同的溶液包被小的盖玻片片段，在室温下孵育 2 到 4 小时或在 4 摄氏度下过夜。
为了减少 X 解释对玻璃的粘附，请冲洗并用 DFA 介质填充腔室，直到转移到 xs 之前，以相同的方式冲洗盖玻片碎片。然后将它们浸入一培养皿中，这些培养胚胎在一到四个细胞阶段用所需的 MR NA 显微注射到三分之一 XMBS 中的所需阶段。使用带有倾斜开口的移液管在解剖立体显微镜下将胚胎转移到 DFA 培养皿中。
使用镊子将胚胎化以切除动物 CapEx 植物。使用发环将胚胎支撑在一个位置。用毛刀在动物杆上做一个小切口。
反复进行平滑的轻弹切割以延长切口并去除帽外胚层。以相同的方式切除 3 或 4 x explan。并使用移液管将它们移动到准备好的培养室中。
使用毛环定位每个 X 解释，使上皮面向腔室的底部。使用镊子。将盖玻片片段放在其中心。
将末端浸入硅脂中。将一个片段放在每个 X 解释上。用小块硅脂轻轻固定每个碎片。
注意不要用过大的力完全砸碎 X 解释。用 DFA 填充腔室，用硅脂涂抹腔室的顶部边缘。然后用 24 x 40 毫米的盖玻片密封顶部。
调整腔室内 DFA 的水平以减少气泡，并使用纸巾吸去任何溢出物。X 植物现在可以在室温下在密封室中长期培养一天，将共聚焦显微镜的 20 倍物镜移动到位。将包含 X 解释的腔室放在显微镜载物台上，并在腔室上放置小的平衡重，以将其固定在明场下的位置。
调整焦点并使用路线定位来可视化浅表细胞的顶端。切换到荧光和更高倍率的物镜。要收集结构上皮的单个图像或延时电影，请调整采集以获得最佳图像。
有关调谐和成像的提示，请参阅本协议的书面部分。保持尽可能低的激光功率。捕获 x 外皮上皮的图像或延时电影。
有关数据收集的建议，请参阅协议的书面部分。可以通过多种方式挖掘共聚焦图像文件以获取数据。以下是如何使用带有 bio formats 插件的 Image J 分析软件分析数据文件的两个示例。
要测量上皮细胞的细胞面积，请下拉 analyze（分析）菜单，然后单击 Set measurements（设置测量值）。从工具栏中选择选择工具，并在分析菜单中勾勒出单元格的轮廓，选择工具，然后选择 ROI 管理器。要打开感兴趣区域管理器，请按 Control t。
要将轮廓添加到 ROI 管理器，请从图像中选择并添加所需数量的轮廓。然后单击 Save 以将 ROI 集保存在 ROI 管理器中。单击 measure。
结果窗口现在将显示每个 ROI 的测量区域。要测量细胞膜的强度，请从图像 J 工具栏中选择直线工具。在膜上画一条垂直线。
如上一个示例所示，按 Ctrl T。要将选择添加到 ROI 管理器，请下拉分析菜单并单击 plot profile（绘制剖面图）以生成沿线相对强度的图。要将图形保存为图像，请在出现的新绘图窗口中单击 Save。
将列表菜单下拉到文件，然后保存为我们刚刚向您展示了如何从切除的动物 CapEx 解释中实时成像和量化胚胎上皮细胞。在执行此程序时，重要的是要记住在 DFA 中添加抗生素和抗生素。为了阻止细菌和真菌的生长，在将外植体压在盖玻片下时要格外小心，因为超过所需的压力可能会粉碎外膜。
同样重要的是要记住，要在共聚焦显微镜上进行最佳设置，以获得最高质量的图像数据。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文展示了活体成像技术来研究变色龙胚胎上皮细胞的形态。它重点介绍了分离青蛙组织并使用共聚焦显微镜观察活体上皮细胞的方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 变色龙胚胎上皮是研究细胞行为的模型。
- 活细胞成像补充了传统组织学。
- 理解上皮形态发生对发育研究至关重要。
- 共聚焦显微镜允许实时观察细胞动力学。
研究目的
- 展示上皮细胞的活体成像技术。
- 量化上皮细胞的形态学细节。
- 提供分离和培养青蛙组织的协议。
使用的方法
- 准备成像工具和设备。
- 从青蛙胚胎中切取组织进行培养。
- 收集上皮细胞的高分辨率图像。
- 使用Image J软件量化细胞形态。
主要结果
- 获得了活体上皮细胞的高分辨率图像。
- 定量分析揭示了跟踪的细胞面积和膜强度。
- 活体成像提供了关于形态发生过程中细胞行为的洞察。
- 验证了方法可以用于长期培养青蛙组织。
结论
- 活细胞共聚焦显微镜对于研究上皮细胞是有效的。
- 这些方法可以应用于各种发育生物学研究。
- 结果增进了对上皮形态发生的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Live-cell imaging and quantitative analysis of embryonic epithelial cells in Xenopus laevis provide a dynamic platform for interrogating morphogenetic processes relevant to early discovery and target validation. High-resolution confocal microscopy enables real-time measurement of cellular morphology and protein localization, supporting predictive confidence in developmental biology models. This workflow enhances the translational value of epithelial systems for mechanistic de-risking and portfolio triage in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of cytoskeletal changes and cell shape dynamics in real time.
- Supports functional validation of molecular targets involved in epithelial morphogenesis.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying cell area and membrane intensity changes.
- Provides a platform for hypothesis-driven interrogation of developmental pathways.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live-cell systems for downstream quantitative imaging workflows.
- Standardizes measurement of morphological parameters using reproducible Image J analysis.
- Enables high-content screening of compounds affecting epithelial cell behavior.
- Supports assay scalability and platform reuse for comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by capturing dynamic epithelial processes.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation via quantitative outputs.
- Reduces biological risk by providing predictive, real-time cellular readouts.
- Supports biomarker identification through live imaging of protein localization.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model validation, leveraging live-cell imaging for robust data generation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification through real-time morphological analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers precise measurements of cell area and membrane intensity for comparative analytics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by supporting disease-relevant system modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse epithelial studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in epithelial biology.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to specialized imaging instrumentation and analysis software (e.g., Image J).
- Necessitates cross-team standardization of imaging and measurement protocols.
- May require adaptation for different model systems or tissue types.
- Dependent on optimal culture conditions and careful sample handling to ensure data quality.
