JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

1, 2, 2, 3, 2, 1

1Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Immunology Institute, Mount Sinai School of Medicine, 2NSF Center for Biophotonics, University of California, Davis, 3Structural and Computational Biology Unit, European Molecular Biology Laboratory

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

    Date Published: 10/07/2010, Issue 44; doi: 10.3791/2061

    Cite this Article

    Dale, B., McNerney, G. P., Thompson, D. L., Hübner, W., Huser, T., Chen, B. K. Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (44), e2061, doi:10.3791/2061 (2010).

    Abstract

    Kaynaştırma sevdikleri proteinler yeşil flüoresan protein, biyologlar, floresan video mikroskopi kullanılarak karmaşık hücresel süreçleri yaşayan çalışma yeteneğine sahip. Insan immün yetmezlik virüsü hücre-hücre iletim sırasında insan immün yetmezlik virüsü çekirdek protein hareketlerini izlemek için, HIV bulaşıcı bir moleküler klon bağlamında Gag protein, HIV Gag-iGFP denilen GFP etiketli. Biz viral klon video konfokal mikroskopi kullanılarak bu çalışma. Aşağıdaki görüntülenmiştir deneyde, bir insan T hücre hattı HIV Gag-iGFP transfect ve biz floresan etiketli bulaşmamış CD4 + T hücreleri virüs için hedef hücreler olarak hizmet etmek için kullanır. Hücrelerarası yapılar arasında kolayca viral üretim ve nakliye takip edebilirsiniz farklı floresan etiketleri kullanarak virolojik sinaps denir. Basit gaz geçirgen görüntüleme odaları, bize gün dakika canlı konfokal mikroskobu ile sinaps gözlemlemek için izin verir. Bu yaklaşımlar, bir hücreden diğerine hareket gibi viral proteinleri izlemek için kullanılabilir.

    Protocol

    Bu yöntem bildirilen araştırma Hübner ve ark Bilim 323: 1743-1747 (2009) .

    1. Genel bakış

    HIV hücre-hücre yayılmasını başlangıçta donör hücreleri ve birincil CD4 + T lenfositleri acceptor hücreleri 1,2,3 olarak HIV ile enfekte Jurkat hücreleri kullanılarak tarif edilmiştir. Bu çalışmalarda, virüs sabit hücrelerin antikor boyama ile tespit edildi. Canlı hücrelerde virüs hücreye transfer izlemek için, biz HIV, HIV Gag-iGFP 4 olarak adlandırılan bir rekombinant, bulaşıcı moleküler klon istifade eder. MA ve CA etki alanları arasında Gag protein dahili takılı yeşil floresan proteininin (GFP) taşır. HIV Bu moleküler klon yardımcı virüs için gerek kalmadan enfektivite korur. Bu klon yapılan virüs partikülleri stoichiometrically hücreleri arasındaki viral montaj ve transfer izlemek için güçlü bir floresan bir sinyal sağlayarak, yeşil floresan protein ile yüklenir. Ile birlikte kullanıldığında asal hücre izleme floresan boyalar, alıcı hücreleri girdi donör hücreleri ayrımcılık ve bir HIV virüslü bir T hücre bulaşmamış T hücre 5 transfer görselleştirmek için izin olabilir. Mühürlü bir gaz geçirgen görüntüleme odasında kültüre ise Virolojik sinaps oluşumu ve sonra virüs bir hücreden diğerine transferi canlı hücreler görülebilir.

    (Gün 1)

    2. HIV Gag iGFP hazırlanması Jurkat T Hücreler transfekte

    1. Dikkatle 2 x 10 5 ve 8 x 10 5 hücreleri / Jurkat kültür medya (RPMI 1640,% 10 fetal sığır serumu ml arasında konsantrasyonda hücreleri koruyarak insan CD4 + T hücre hattı Jurkat (ATCC, Manassas, VA) hazırlayın . 100 ünite / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin). Başarının Anahtarı: 8 x 10 5 hücre / mL aşan konsantrasyonlarda Jurkat hücreleri Kültür transfeksiyon verimliliğinde bir azalmaya neden olacaktır.

      Not: aşağıda açıklandığı gibi HIV Gag-iGFP proviral DNA T hücrelerine, bir çoğaltma yetkin insan immün yetmezlik virüsü üretim sonuçları transfeksiyon. Bunun gibi, bütün işlemleri sertifikalı biyogüvenlik düzeyi 2 + veya biyogüvenlik seviye 3 (BL2 + / BL3) doku kültürü odası, sadece eğitimli laboratuar personel tarafından yapılmalıdır. İş görüntüleme tesislerinde bulaşıcı HIV ile yerel kurumsal biyogüvenlik ofisi tarafından onaylanması gerekir.
    2. Amaxa nucleofection yöntemi (Lonza, Walkersville, MD) kullanarak viral plazmid, HIV Gag-iGFP Jurkats Transfect. 150 10 dakika süreyle santrifüj yoluyla Pelet 5 x 10 6 hücre x g. Süpernatant aspire ve steril fosfat hücrelerin yıkayın tamponlu salin (PBS). Hücreler santrifüj ve üreticinin ek içeren, önceden ısıtılmış nucleofector çözüm V 97 mcL pelet tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonu plazmid endotoksin ücretsiz HIV Gag-iGFP (1 mcg / ml) üç mcL ekleyin ve hafifçe karıştırın. G-18 programı kullanarak, bir küvet ve nucleofect hücre süspansiyonu aktarın. Hemen antibiyotik olmadan prewarmed Jurkat kültür ortamı 3 mL hücrelere aktarın.
    3. CD4 + hedef hücreleri virolojik sinaps için hazırlamak için, standart bir Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, İsveç) protokolünü kullanarak buffy kat insan periferik kan mononükleer hücreleri edinin. CD4 + T hücreleri, daha sonra olumsuz bir manyetik boncuk izolasyon kiti (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) kullanılarak seçilir. Bu cryogenically donma medya 5 x 10 6 cells/500 mcL (% 90 fetal sığır serum/10% DMSO) hacimde sıvı N2 saklanabilir. Çözülmüş birincil CD4 + T hücrelerinin IL-2 10 adet / ml ile desteklenmiş RPMI% 10 FBS, kültür.

    (2. Gün)

    3. HIV Gag-iGFP ve Floresan Boyalar ile Hedef Hücreler boyanması ile transfekte Jurkats Canlı Hücreler Kurtarma

    1. Jurkat hücreleri gecede transfeksiyon kurtarmak için izin verin. Sonra bir Ficoll hypaque yoğunluk gradiyenti malzeme üzerinde santrifüj hücresel enkaz kaldırmak. 1.5 ml, 15 ml konik bir tüp alt Ficoll-Paque koyun. Yavaşça RPMI bir 5 ml hacminde transfekte Jurkats bu degrade malzeme kaplaması. Fren kapalı olarak oda sıcaklığında, 20 dakika boyunca 400 xg'de hücreler santrifüjleyin. Dikkatle bir pipet kullanarak medya / Ficoll arayüzü hücreleri kaldırmak. Yeni bir 15 ml konik tüp aktarabilirsiniz. 10 dakika için 300 xg'de toplam hacmi 15 ml ve santrifüj RMPI ile hücreler sulandırınız. Iyi bir 2 cm (6 sıra plaka) 3 mL Jurkat kültür ortamı pelletini tekrar ve hücrelerin doku kültürü inkübatör dönün.
    2. Donör hücreleri hedef hücreleri, hücre-hücre transferi deneyleri ayırt etmek için prelabel CD4 + floresan boya ile hedef hücreler. İlköğretim CD4 + T hücreleri bile etiketliKullanmadan önce ing. Biz CellTracker ve CellTrace boyalar (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile mükemmel bir başarı etiketleme T hücreleri oldu. Boya konsantrasyonu ve inkübasyon süreleri, özellikle kullanılan boya ve hücre tipine bağlı olarak optimize edilmesi gerekir iken, bir temsilci protokolü izlemektedir. Pelet 4 x 10 6 birincil CD4 + T 10 dakika için 400 xg'de iplik hücreleri. 2 mL PBS 5 ml PBS ve tekrar süspansiyon hücreleri yıkayın. Nihai konsantrasyonu 1.5 mcM CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin. 8 mL komple Jurkat medya ekleyin ve 10 dakika için 400 xg'de santrifüj. 3 ml, 10 adet / ml, IL-2 ve geceleme doku kültürü inkübatörde ile desteklenmiş tam medya hücrelerin tekrar

    (Gün 3)

    4. Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak HIV İzleme Hücre-hücre Transfer Gag-iGFP

    Biz rutin HIV Gag-iGFP transfekte Jurkat hücreler 48 saat sonrası transfeksiyon kullanabilirsiniz. Ancak, 24 saat gibi erken bir sürede başarıyla hücreleri kullanılır, ve 72 saat sonrası transfeksiyon gibi geç.

    1. Yaklaşık 48 saat sonrası transfeksiyon, HIV Gag iGFP ifade Jurkats CO ile yıkanmış sayılır 2 bağımsız medya (Invitrogen, Carlsbad, CA), ve canlı hücre görüntüleme medya (CO 2 bağımsız medya,% 10 fetal sığır serumu, yeniden süspanse 1-3 x 10 7 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon az 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin, 10 adet / ml, IL-2).
    2. Benzer bir şekilde, yıkama ve 1-3 x 10 7 hücre / ml canlı hücre görüntüleme medyada bir konsantrasyon etiketli birincil CD4 + T hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin.
    3. Mix HIV Gag-iGFP-transfekte Jurkats birincil CD4 + T hücreleri tedavi doku kültürü, gaz geçirgen, microchamber (Ibidi, Verona, WI) bir 1:2 veya 1:03 oranında ve yük. Örneğin, HIV Gag-iGFP transfekte Jurkats etiketli birincil CD4 + T hücrelerinin yüzde 40 mcL ile 20 mcL karıştırın. Bu karışımı 50 mcL Ibidi odasına yerleştirin ve fişler ile donatıldı mühür. Fişleri, fiş / Ibidi odasına arayüzü ile parafilm sararak sabitleyin.

    5. Mikroskopi platformlarda dikkat edilmesi gereken noktalar: dönen disk konfokal görüntüleme

    Hücreleri ile bir Ibidi görüntüleme odasına yerleştirdikten sonra, derhal cihazı ters bir optik mikroskop (iX71 Olympus, Merkez Vadisi, PA) üzerine monte edin. Ibidi odasında sadece uygun güvenlik kıyafetler giyiyor BL2 + eğitilmiş laboratuvar personeli tarafından mikroskop transfer edilmelidir. Canlı hücre görüntüleme genellikle istikrarlı bir 37 ° C çevre korumak için pahalı inkübasyon odaları kullanmasına rağmen, bu bir T-tipi termokupl ucu ile birlikte basit ve ekonomik bir termostatik ısıtıcı (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA) kullanılarak elde edildi yanına monte Uygun sıcaklık geri bildirim için örnek. CO 2-bağımsız medya CO 2 odasının kullanımı kaçınarak, yüksek hücre canlılığı korumak sağlar bulduk . Oda sıcaklığı dalgalanmalara karşı platformu tampon ve arka plan oda ışığı engellemek için, büyük bir siyah kefen sistemi etrafında yalıtımlı bir hava cebi oluşturarak tüm mikroskop / ısıtıcı kurulum üzerinde bol dökümlü. Bu, sıcaklık değişimi ve ilişkili sıcaklık ile ilgili örnek sürüklenme büyük ölçüde azaltır, ama 30 dakika boyunca örnek montaj önce ön ısıtma gerektirir.

    6. Veri Toplama, Transfer ve Görüntü İşleme

    Görüntüler yüksek sayısal açıklık (NA) büyük ölçüde çözünürlüğünü artırır olarak bir 60x 1.42 NA immersiyon yağı amacı (UPlanApo N, Olympus) kullanılarak alınır. 3D konfokal görüntüler oluşturmak için, tarama aynı anda tarama hızını önemli ölçüde artırmak için> 800 konfokal noktalar kullanan dönen bir disk konfokal birimi (CSU-10, Yokagawa, Japonya) tarafından yapılır. Hızı, CSU-10 photobleaching ve fototoksisite azaltır hızlı, düşük ışık koşullarında görüntüleme izin için çok hassas bir elektron çarparak ücret çiftli cihazı (EMCCD, IXON + 897, Andor Technologies, İrlanda) kamera ile eşleştirilmiş. Iltifat için Floresan ışık kaynağı bir tarafından seçilen istenen dalga boyunda (488 nm) ve lazer güç mikroskop objektif (<1 mW) hemen önce ölçülen dalga boyu çok ArKr iyon gaz lazer (Innova 70C, Tutarlı, Santa Clara) acousto optik ayarlanabilir filtre (AOTF), (Andor Teknolojileri). Daha photobleaching azaltmak ve toplam görüntüleme süresini uzatmak için, hızla AOTF (mikrosaniye) yeni elde edilen bir görüntüyü CCD (15-30 ms maruz) teslim ederken kamera (10-20 ms) devre dışı lazer ışını her zaman kapanır. bilgisayara. Lazer ışığı 405/488/568/647 dört bant dikroik ayna (Semrock, Rochester, NY) ile dönen disk sistemi birleştirilmiştir. Floresans emisyon 525/50 bant geçiren bir filtre tekerlek (Ludl Elektronik Ürünler, Hawthorne, NY) içinde bir filtre (Semrock) süzülür monte bEMCCD kamera ve konfokal dönen disk ünitesi etween. Z-evre (Mad City Labs, Madison, WI) dahil olmak üzere tüm donanım ve satın alma, Andor iQ v1.8 yazılımı tarafından kontrol edilir. 1,2-1,9 etrafında ikinci 3D görüntü yığınlarının satın alma hızını en üst düzeye çıkarmak için, hücre çifti hemen alan EMCCD kamera kayıt bölgesi kırpmak. Ayrıca, bazı bilgiler z pahasına, 0,45-0,75 mikron arasında büyük bir z adım satın alma hızlandırmak için kullanılır. Bu koşullar altında Görüntüleme 6 saate kadar sürebilir sürekli 20-60 dakika segmentleri kullanarak minimum photobleaching. Toplamda, her bir veri parçası genellikle 5-20 GB, on binlerce görüntü alınır alanı kaplar. Büyük veri dosyaları taşıma ve analizi kolaylaştırmak için, her bir satın alma seti Andor iQ v1.8 yazılımı kullanarak 1 Gb TIFF görüntü dosyası kesimleri olarak parçalanır ve ihraç edilmesi gerekiyor. Burada, birçok mükemmel yazılım paketleri Metamorph, Volocity ve ImageJ (biz onun varyasyon Fiji öneririz) gibi görüntü analizi için kullanılabilir.

    Iki floresan belirteçlerinin izlenebilir zaman, biz aynı anda bir satın alma düşürmeden her ikisi de rekor "split screen modu." Her iki işaretleri, bir seferde iki farklı ArKr lazer çizgileri (genellikle 488 ve 568 nm) heyecan duyuyoruz. EMCCD kamera iki farklı görüntü ayıran bir görüntü splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK) önce doğrudan yerleştirilebilir. Her görüntü daha sonra bağımsız bir kez "bölünmüş ekran" etkisi yaratmak kamera floresan filtreleri (Semrock) ve öngörülen yan yana süzülür. Bu daha sonra manuel kırpma ve daha sonra görüntü işleme görüntü hizalayarak gerektirecektir.

    7. Görüntü İşleme ve Veri Analizi dikkat edilmesi gereken noktalar

    Biz genellikle Volocity (Perkin Elmer, Waltham, MA), Macintosh bilgisayarlarda (Apple, Inc.) Görüntü analizi gerçekleştirmek. Dönen disk lazer konfokal mikroskobu görüntüleri ilk sonra Volocity ile deconvolved, photobleaching için doğru yoğunluğu ayarlanır. Gag puncta yoğunluğu ölçüm ve izleme Volocity Niceleme modülü ile yapılır. Önceden oluşmuş bir sinaps göre hareket hesaplanması gereken görüntü setleri için, otomatik bir izleme algoritması, tüm dizi boyunca sinaptik düğmesine izler istihdam edilmektedir. Otomatik parça seçme yazılımı tarafından tanımlanan faiz bölgelerin Elle muayene, yazılım, istenilen nesneyi doğru takip doğrulamak için yapılmalıdır. Çevredeki nesnelerin kontrastı çok zayıf nesneler için, manuel izleme-kare bir çerçeve temelinde yapılabilir. Volocity yazılım paketi, istenilen nesneleri içinde XYZ konumu, hacmi ve entegre sinyal ihracat sağlar. Sinaptik düğmeye merkezine hareketleri normalleştirilmesi izlenen nesnenin sinaps ve hız mesafe hesaplanır.

    8. Temsilcisi Sonuçlar

    Karıştırma 10 ila 15 dakika içinde bir birincil CD4 kalarak HIV Gag-iGFP ifade Jurkat hücreleri + T hücreleri görselleştirmek mümkün olmalıdır. Görüntüleme bu konjugatları, bir synaspe sonra hedef hücreleri enfekte hücrelerin yanı sıra Gag puncta hareketlerini değerlendirmek. Sinaps oluşur birinin kısa bir süre sonra hedef hücre içine Gag iGFP puncta hareket gözlemleyebiliriz.

    Discussion

    Biz burada, hücre-hücre HIV transferi görselleştirmek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Laboratuar ve diğerleri 'tarafından yapılan son araştırma, HIV baskın modu T hücreleri arasında yayılmış olabileceğini düşündürmektedir. Burada anlatılan yöntemi HIV rekombinant formu istihdam temel yapısal protein, Gag genetik olarak kodlanmış olan yeşil floresan protein etiketi taşıyan Gag iGFP, HIV adı verilen. Çünkü her virüs parçacık üretilen GFP yüksek düzeyde, HIV Bu çoğaltma yetkili klonu, gerçek zamanlı olarak bireysel virüs partikülleri takip etmek için araştırmacılar sağlar. Bu virüs, HIV montaj ve hücre-hücre transferi ile ilgili çalışmalarda özellikle yararlı olacaktır.

    HIV hücre-hücre transferi ile transferi oldukça verimlidir. Üç saat boyunca ko-kültür, biz rutin akış sitometri ile değerlendirilen virüs birincil T hücrelerinin% 20-30 transfer bakın. Benzer verimliliği niteliksel canlı hücre görüntüleme sırasında görülür. Viral bulaşmış T hücrelerinin hemen eş-kültür başladıktan sonra bulaşmamış birincil T hücreleri ile sinaps oluşturarak başlar. İlginç, değil tüm ilköğretim T hücreleri lazer cımbız (yayınlanmamış gözlemler, GM) ile zorla etkileşimleri rağmen, HIV ile enfekte Jurkat hücreleri ile etkileşim yeteneğine sahiptir. HIV Gag-iGFP şüphesiz hücre-hücre transferi, in vitro ve in vivo hem de en duyarlı T hücre alt grupları belirlemek için yararlı olacaktır.

    Disclosures

    Çıkar çatışması ilan etti.

    Acknowledgements

    Bu derlemede, Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri, AI074420-02, Burroughs Wellcome Araştırmacı Ödülü, BKC için Hirschl'ın Kariyer Bilim Adamı Ödülü ve NSF Biophotonics Bilim ve Teknoloji Merkezi, Kooperatif Sözleşmesi PHY012099, TH UCD Sağlık Sistemi Araştırma Ödülü tarafından desteklenen UCD CTSC NCRR ULRR024146.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Jurkat T Cells ATCC
    Leukocyte buffy coats from whole blood New York Blood Center
    RPMI Sigma-Aldrich
    Fetal Bovine Serum Hyclone
    Penicillin/Streptomycin Invitrogen
    Nucleofector System and Solution V Lonza Inc.
    EndoFree Maxi Prep Kits Qiagen
    HIV Gag-iGFP plasmid Chen Laboratory
    CD4+ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec
    Ficoll-Paque GE Healthcare
    Celltracker/CellTrace Dyes Invitrogen
    CO2-Independent Media Invitrogen
    Imaging Chambers Ibidi
    Olympus IX-71 Inverted Microscope Olympus Corporation
    PlanApo N 1.42NA 60X oil objective Olympus Corporation
    Innova 70C ArKr ion gas laser Coherent Inc.
    CSU-10 Nipkow-type spinning disk confocal unit Yokogawa
    Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dichroic beamsplitter Semrock
    525/50 bandpass filter Semrock
    iXon+ 897 electron-multiplied charged coupled devise camera Andor
    ASI 400 Thermostatic Heater Nevtek

    References

    1. Blanco, J. et al. High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells. J Biol Chem 279, 51305-51314 (2004).
    2. Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F. & Schwartz, O. Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes. J Virol 81, 1000-1012 (2007).
    3. Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M. & Sattentau, Q. J. HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse. J Exp Med 199, 283-293, (2004).
    4. Hubner, W. et al. Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1. J Virol 81, 12596-12607 (2007).
    5. Hubner, W. et al. Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses. Science 323, 1743-1747 (2009).

    Comments

    2 Comments

    Have you considered adapting this approach to study cell-free transmission?
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 22, 2010, 11:06 AM

    What happens after 30 minutes? DŒs the synapse break? Do the cells fuse? Where do the GFP-gag localize?
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 22, 2012, 1:33 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter