Infarto agudo de miocardio en ratas

1. Preparación del área de trabajo

1. La superficie de trabajo es el primero elaborado por la desinfección del área con el 70% de etanol.
2. Todos los instrumentos quirúrgicos deben esterilizarse con un esterilizador de calor de cuentas antes de la cirugía (y en medio de cirugías rata individual). Estos instrumentos son: tijeras quirúrgicas (2), fórceps (1), pinzas curvas (1), titular de la aguja (2), y un rectractor pecho.
3. Gasa de algodón y aplicadores deben estar disponibles para el manejo del sangrado.
4. Ajuste la temperatura de un sistema general homeotermos (paño caliente), que se utiliza para mantener la temperatura corporal de los animales a 37 ± 1 ° C, con el fin de evitar una caída dramática de la temperatura corporal, el tamaño del infarto depende de la la duración de la oclusión, así como la temperatura corporal (Tarnavski et al.).
5. Antes de la anestesia, cada animal recibirá una dosis de buprenorfina (0.1-2.5 mg / kg vía subcutánea) y tabletas orales carprofeno (Rimadyl, Bioserv tableta, una tableta) el día antes de la cirugía. En el momento inmediatamente anterior a la cirugía, cada animal volverá a recibir una dosis de buprenorfina (0,1 hasta 2,5 mg / kg vía subcutánea).
6. Nota: Para estudios que envuelve la evaluación de la función cardiaca y el remodelado cardíaco durante un período de tiempo (7 - a 28 días y más allá), una dosis de buprenorfina (0.1-2.5 mg / kg SC) será administrada cada 6 horas después de la cirugía durante 24-48 horas después de la cirugía y carprofeno tabletas orales se darán una vez al día (ver "recuperación post-operatoria").

2. Preparación y la intubación de las ratas

1. Antes de la inducción de la anestesia, los animales serán examinados para identificar las condiciones pre-existentes que pueden complicar el resultado quirúrgico, el examen físico incluirá la inspección visual y la medición de la frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria y la temperatura corporal y el peso corporal.
2. Si los animales están determinados a estar sano, 250-300 gramos de ratas macho (Sprague Dawley, por ejemplo) será pesado y características de identificación será grabada.
3. Las ratas se anestesiaron con 80 mg / kg de pentobarbital, el nivel correcto de la anestesia se verifica a través de la respuesta de retirada del miembro mediante la aplicación de la presión del lecho de la uña de rata (dedo del pie-una pizca de reflejos) y periódicamente durante todo el procedimiento.
4. La buprenorfina (0,1 a 2,5 mg / kg, SQ) se administra en el momento de la cirugía.
5. Una máquina de afeitar eléctrica se utiliza para afeitarse la forma de piel de la zona del cuello y el pecho. Nota: Para estudios que envuelve la evaluación de la función cardiaca y el remodelado cardíaco durante un período de tiempo (7 - a 28 días y más allá), la piel debe estar completamente afeitado de la zona quirúrgica para mantener la esterilidad.
6. Las áreas de afeitado deben ser lavados y desinfectados con una solución de betadine siguió limpiando la zona con alcohol al 70%, lo que betadine y fregar el alcohol y el procedimiento de desinfección se debe repetir tres veces.
7. El animal anestesiado se coloca en posición supina sobre un sistema general homeotermos (paño caliente) con el fin de mantener la temperatura corporal.
8. La intubación endotraqueal se realiza entonces por primera cuidadosamente la exposición de la tráquea, para mejorar la visualización de la intubación, haciendo una media de 5 mm del cuello la incisión y la retracción del tejido muscular, justo por encima de la tráquea.
9. Esto permite una mejor visualización de la inserción del tubo endotraqueal (tamaño de polietileno de 90, PE 90), donde se bisela el tubo en el borde para facilitar la entrada, a través de la laringe.
10. El tubo endotraqueal se inserta en la tráquea, con la visualización de la ayuda de un microscopio quirúrgico estéreo, por la manipulación cuidadosa de la lengua mientras se observa la tráquea y la entrada del tubo endotraqueal.
11. La ventilación mecánica es entonces logra conectando el tubo endotraqueal a Kent Científico ventilador (TOPO Modo Dual) en bicicleta a 80 respiraciones por minuto y un volumen corriente de 1,2 ml por cada 100 gramo de peso corporal.
12. Un campo estéril se coloca sobre la rata, dejando sólo el área quirúrgica expuesta, reduciendo así al mínimo la posible contaminación durante la operación.
13. El cirujano de los animales y los asistentes deben llevar mascarilla, bata y guantes, con guantes se cambia entre las cirugías rata individual.

3. Transitoria descendente anterior izquierda (LAD) Ligadura

1. Una vez que se establece la respiración constante, se abre el pecho a la izquierda del cuarto espacio intercostal, mediante el uso de pinzas hemostáticas y tijeras ronda final para abrir el espacio, pero sin cortar el tejido de manera que el riesgo de sangrado puede ser reducido.
2. Un retractor en el pecho se coloca entonces en el cuarto espacio intercostal, con el fin de separar las costillas para que el ventrículo izquierdo (VI) se expone, teniendo cuidado máximo de no dañar el pulmón.
3. El pericardio se abre entonces, pero deja en su lugar si es posible.
4. La descendente anterior izquierda proximal (LAD) se identificaron (Figura 1), con el uso de lomicroscopio estereoscópico urgical, y el muchacho luego se ligan de forma transitoria (o puede ser atado con un nudo corredizo), utilizando una sutura de prolene 6-0 para un período de isquemia de 30 minutos (Figura 1), pero sin exteriorización del corazón.
5. Para permitir la reperfusión cardiaca, tijeras de microcirugía se utiliza para cortar el nudo de la ligadura (o soltando el nudo corredizo), mediante la sutura de prolene 6-0, 30 minutos después de la ligadura de la DA.
6. En el simulacro de control de ratas, el procedimiento es idéntico, salvo el muchacho no está ligado de forma transitoria.
7. La salida se hizo una breve (1-2 segundos) pellizcan en el respirador para que vuelva a la inflación de los pulmones.
8. El retractor se retira del pecho y las costillas se unen con una sutura de prolene 2-0 con un patrón de sutura interrumpida.
9. Una vez que las costillas se cierran, la salida del ventilador es de nuevo brevemente (1-2 segundos) pellizcó para garantizar una respiración adecuada.
10. La piel se cierra con sutura de prolene 6-0 con un patrón de sutura continua.

4. La confirmación de la ligadura de éxito de la DA

1. La ligadura adecuada de la DA será confirmado por la observación de blanqueo de tejido de miocardio distal a la sutura, así como la disfunción de la pared anterior, como se observó durante la ligadura de LAD transitoria.
2. Reperfusión será verificada por el regreso de color rojo en el tejido del miocardio y la demostración de una cierta recuperación del movimiento de la pared anterior, como se observa inmediatamente después de la ligadura de LAD transitoria.
3. Nota: Para estudios que envuelve la evaluación de la función cardiaca y el remodelado cardíaco durante un período de tiempo (7 - a 28 días y más allá), un ecocardiograma se llevará a cabo 24 horas después de la ligadura de la DA, con el fin de determinar el alcance de la inducida infarto de miocardio. Todos los animales con un acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LV FS) <20%, determinado a partir de un ecocardiograma, así como la disfunción movimiento de la pared anterior de conformidad con el infarto, se identificarán y se utiliza para el seguimiento de la función cardiaca y estudios de remodelación. Sham ratas de control se espera que tengan un normal FS LV entre 40-45% (del Monte y otros).

5. Recuperación post-operatoria

1. Una vez terminada la cirugía, el campo estéril sobre el animal será eliminado. La temperatura del cuerpo (con un termómetro rectal), la frecuencia respiratoria (por inspección visual), la frecuencia cardíaca (por palpitaciones), y las señales anormales de dolor se deben controlar hasta que el animal se convierte en ambulatorios.
2. La rata se retira del ventilador y luego ser colocado en una jaula para animales y se les permite recuperarse de la anestesia. En esta jaula, uno de los extremos de la caja se calienta una compresa caliente para permitir la rata para buscar calor. Además, el agua estará a disposición de la rata durante el período de observación.
3. Si aparecen signos de deshidratación se observan después de la cirugía, 0,5 ml de solución salina estéril se inyecta por vía intraperitoneal (IP).
4. La buprenorfina (0,1 a 2,5 mg / kg, SQ) será administrada inmediatamente después de la cirugía, y durante la recuperación post-operatoria.
5. Nota: Para estudios que envuelve la evaluación de la función cardiaca y el remodelado cardíaco durante un período de tiempo (7 - a 28 días y más allá), una dosis de buprenorfina (0.1-2.5 mg / kg SC) será administrada cada 6 horas después de la cirugía durante 24-48 horas después de la cirugía. Tabletas orales de carprofeno (Rimadyl, Bioserv comprimido) también se proporcionará (1 comprimido al día) durante al menos 48 horas después de la cirugía.

6. La evaluación histológica de la isquemia reperfusión

1. Tras la finalización del período de reperfusión de 4 horas, las ratas se anestesiaron de nuevo con 80 mg / kg de pentobarbital y el muchacho se liga de nuevo (o el nudo corredizo se puede retied) (Huang et al y Kaiser et al).
2. 1 ml de Evan 5% de azul (en buffer fosfato salino) se inyecta en la cámara del ventrículo derecho y permitió que para la perfusión de 2 minutos.
3. Después de 2 minutos, 1 ml de solución saturada de cloruro de potasio se inyecta en la cámara del ventrículo derecho con el fin de dejar que el corazón lata.
4. El corazón es entonces rápidamente eliminado, incrustado en agarosa al 2% de buffer fosfato salino, y luego se cortaron en rodajas de 1-2 mm.
5. El miocardio viable es finalmente se tiñe con cloruro de tetrazolio 2% trifenil (TTC) por 20 minutos y las imágenes de cada rebanada es capturado. Las imágenes se cuantificó con el fin de identificar la cantidad de área de miocardio: (1) que no en situación de riesgo es (secciones azules), (2) la zona en situación de riesgo (AAR, rojo y blanco las secciones), y (3 ) zona que está infartada (blanco "sin mancha", las secciones) (Figura 2).

7. Resultados representante

Para estudios que envuelve la evaluación del tamaño del infarto y el área en riesgo (AAR), por el colorante azul de Evans y cloruro de trifenil tetrazolio (TTC), después de 4 horas de la reperfusión, la ligadura adecuada de la ADA se puede confirmarmediante la observación de blanqueo de tejido de miocardio distal a la sutura, así como la disfunción de la pared anterior, como se observó durante la ligadura de LAD transitoria. Reperfusión puede ser verificada por el regreso de color rojo en el tejido del miocardio y la demostración de una cierta recuperación del movimiento de la pared anterior, observa inmediatamente después de la ligadura de LAD transitoria. Para estudios que envuelve la evaluación de la función cardiaca y el remodelado cardíaco durante un período de tiempo (7 - a 28 - día y más allá), la ligadura adecuada de la isquemia seguida de reperfusión puede ser confirmado por el blanqueo del tejido, la disfunción de la pared anterior y el regreso de color rojo con una cierta recuperación del movimiento de la pared tras la reperfusión. Además, la función cardiaca puede ser determinada por un ecocardiograma que se realiza 24 horas después de la ligadura de la DA, con el fin de determinar el alcance de la inducida por infarto de miocardio. Todos los animales con un acortamiento fraccional del ventrículo izquierdo (LV FS) <20%, determinado a partir de un ecocardiograma, así como la disfunción movimiento de la pared anterior de conformidad con el infarto, se identificarán y se utiliza para el seguimiento de la función cardiaca y estudios de remodelación. Sham ratas de control se espera que tengan un normal FS LV entre 40-45% (del Monte).

Figura 1. Diagrama esquemático de un infarto de miocardio y la ligadura de LAD. Representación esquemática de (1) infarto de miocardio y (2) la ligadura de la anterior ventricular izquierda descendiente (LAD) con una sutura, que se utiliza para imitar el infarto de miocardio causado por la formación de la peste.

Figura 2. Imagen representativa de un corazón de rata tras el IAM. Imagen representativa del corazón de rata que muestra la zona en azul (no ocluido zona de perfusión coronaria), área en rojo (zona de perfusión coronaria ocluida, indicando el área en riesgo (AAR) para el infarto, y el área en blanco / amarillo (zona infartada dentro de la AAR).

Un infarto agudo de miocardio (IAM) en las ratas, también se conoce como isquemia-reperfusión (IR), es comúnmente utilizado para imitar el remodelado ventricular humanos que conducen a la insuficiencia cardíaca. La progresión de la disfunción ventricular izquierda e insuficiencia cardiaca en modelos animales (ratas y ratones) es similar a la observada en los seres humanos que sufren un infarto de miocardio, sobrevivir y posteriormente desarrolla insuficiencia cardiaca (Goldman). Este procedimiento que se describe una versión de esta técnica, y también contenía notas adicionales que describen las variaciones metodológicas. Adicional a tales variaciones con el infarto agudo de miocardio (IAM) procedimiento incluyen la duración de la isquemia y la duración de la reperfusión. Además, hay variaciones en cuanto al procedimiento quirúrgico utilizado para obtener acceso y ligar la DA. En lo que respecta a la duración del período de isquemia, el tiempo de la ligadura de LAD para inducir un infarto de miocardio puede ser restringido de forma aguda (de 30 minutos a 60 minutos; IAM), o bien, restringido crónica (permanente, MI). En lo que respecta a la duración de la reperfusión después de este período inicial de isquemia antes de la evaluación de miocardio (es decir, el período posterior reperfusión), puede ser corto (de 4 horas a 24 horas) con el fin de evaluar el tamaño del infarto y el área en riesgo (AAR ) por el colorante azul de Evans y cloruro de trifenil tetrazolio (TTC), o, alternativamente, prolongado (7 días a 28 días y más allá) con el fin de evaluar la función cardiaca y de remodelación. Esta remodelación patológica cardiaca (apoptosis, necrosis y disfunción ventricular izquierda) puede variar dependiendo de la duración elegida de isquemia y reperfusión. Como alternativa al procedimiento quirúrgico de mínima exposición del corazón con el fin de ligar la DA en el cuarto espacio intercostal y sin exteriorización del corazón (véase la Parte 3: transitorios descendente anterior (LAD) Ligadura de las arterias), una incisión a través del esternón , para crear un acceso más amplio y la vista del corazón, se puede realizar. En pocas palabras, se hace una incisión a través de la piel del tórax ventral a mediados de tórax después de que el tórax se abre a mediados de esternón. Este toracotomía parcial es seguida por la retracción de los bordes del esternón con un retractor. La DA proximal se identifica, con el uso de un microscopio quirúrgico, ya sea de forma transitoria y liga (o puede ser atado con un nudo corredizo), utilizando una sutura de 6-0-prolene para un período de isquemia de 30 minutos (IAM) o ligado de forma permanente usando una sutura de 6-0-prolene (MI). Para los procedimientos de AMI, tijeras de microcirugía se utiliza para cortar el nudo de la ligadura de 30 minutos después de la ligadura de LAD. La salida se hizo una breve (1-2 segundos) pellizcan en el respirador para que vuelva a la inflación de los pulmones. El retractor se elimina y las costillas se unen y se sutura con prolene 2-0 con un patrón de sutura interrumpida. Una vez que el pecho se cierra, la salida es una breve pellizcó de nuevo para garantizar una respiración adecuada y la piel se cierra con suturas de prolene 6-0 con un patrón de sutura continua. En general, el infarto agudo de miocardio (IAM) el modelo animal descrito en este protocolo imita la enfermedad isquémica del corazón humano y sirve como una herramienta importante para ayudar a dilucidar los mecanismos de señalización molecular involucrada en la remodelación cardíaca y la insuficiencia cardiaca.