JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

מיקרו מכונות אפיון רקמת הריאה באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

1, 1

1Molecular and Integrative Physiological Sciences, Department of Environmental Health, Harvard School of Public Health

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    הנוקשות של מטריקס תאיים משפיעה התנהגויות רבות של תאים חסיד. קשיחות מטריקס משתנה מרחבית ברחבי רקמה, ועוברת שינוי בתנאי מחלה שונים. כאן אנו לפתח שיטות כדי לאפיין שינויים מרחביים קשיחות ברקמה נורמלית fibrotic ריאות עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי microindentation.

    Date Published: 8/28/2011, Issue 54; doi: 10.3791/2911

    Cite this Article

    Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (54), e2911, doi:10.3791/2911 (2011).

    Abstract

    מטריקס קשיחות מאוד משפיע, צמיחה בידול ותפקוד של תאים חסיד 1-3. בסולם המאקרו את הנוקשות של רקמות ואיברים בגוף האדם תוחלת צווים שונים של גודל 4. הרבה פחות ידוע על כמה קשיחות משתנה מרחבית בתוך רקמות, ומה היקף בקנה מידה נוקשות של שינויים מרחביים הם תהליכי מחלה כי התוצאה שיפוץ רקמות. כדי להבין טוב יותר כיצד שינויים נוקשות מטריקס לתרום הפיזיולוגיה הסלולר מחלה ובריאות, מדידות של רקמות נוקשות שהושגו בקנה מידה מרחבי רלוונטי תאים תושב נדרשים. זה נכון במיוחד עבור הריאות, רקמה תואם מאוד אלסטי בו שיפוץ מטריצה ​​היא תכונה בולטת במחלות כגון יתר לחץ דם אסטמה, אמפיזמה פיברוזיס. כדי לאפיין את הסביבה מכני מקומי של הריאות parenchyma בקנה מידה מרחבי רלוונטי תאים תושב, פיתחנו שיטות כדי למדוד ישירות את המאפיינים אלסטי מקומית של רקמת הריאה טרי Murine באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) microindentation. עם הבחירה המתאימה של AFM Indentor, שלוחה, ועומק הכניסה, שיטות אלה מאפשרים מדידות של מודולוס גזירה מקומית ברקמת במקביל בניגוד שלב ו דימות פלואורסצנטי האזור של עניין. דגימה שיטתית של רצועות ורקמות מספק מפות של מאפייני רקמת מכני החושפים שינויים מרחביים המקומית מודולוס גזירה. מתאמים בין תכונות מכניות תכונות אנטומיות ופתולוגיים הבסיסית להמחיש כיצד קשיחות משתנה עם מטריקס ב סיסטיק בתצהיר. שיטות אלה ניתן להרחיב את רקמות רכות אחרות תהליכי מחלה לחשוף כמה תכונות מכניות רקמות מקומיות שונות ברחבי החלל התקדמות המחלה.

    Protocol

    1. רקמת הריאה ברצועת הכנה

    1. רקמת ריאות הוא תואם מאוד קשה לחתוך לרצועות לאפיון AFM. Transiently כדי לייצב את מבנה הריאות לחיתוך, לנפח את הריאות עכבר מבודד intratracheally עם משקל 50 מ"ל / ק"ג גוף נמוך של 2% ג'ל נקודת agarose (שהוכנו PBS) חימם עד 37 ° C. עניבה את קנה הנשימה מגניב לריאות מנופח באמבט של PBS על 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. Agarose יהיה ג'ל מתקשח airspaces בעדינות כדי לייצב את מבנה הריאות במהלך ההפסקה הזו 5. ריכוזים גבוהים יותר agarose, 3-4%, כלומר ניתן להשתמש כדי לשפר עוד יותר את ייצוב לחיתוך רקמות.
    2. חותכים את agarose מיוצב רקמת הריאה עכבר עם סכין או להב סכין המנתחים לרצועות של 5 מ"מ 5 x באורך ורוחב של 400 מיקרומטר עובי, ולאחר מכן לשטוף את רצועות באמבטיה PBS מראש לחמם 37 ° C באמצעות 100 מ"ל כוס זכוכית על צלחת ספסל העליונה מחומם ומערבבים במשך 5 דקות להסיר agarose שיורית. כדי לא לכלול דרכי הנשימה וכלי גדול, חתוך לרצועות subpleural מאזורים רחוקים העיקרית גזע הסמפונות. אם דרכי הנשימה וכלי גדולים להיות צילמו, לחתוך רצועות של רקמת הריאה הפרוקסימלי יותר העיקרית גזע הסמפונות.

    2. AFM Microindentation ו דימות פלואורסצנטי

    1. כדי לבודד תחומי עניין microindentation AFM, רקמה ניתן דמיינו ידי מיקרוסקופ לעומת שלב, או immunostained ו דמיינו ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור immunostaining, לחסום רצועות רקמה עם 5% נסיוב ממקור של הנוגדן משני הרצויה (PBS) עבור 2 שעות ללא קיבוע permeabilization או בטמפרטורת החדר.
    2. דגירה רצועת רקמת עם נוגדן ראשוני מתאים (למשל ארנב נגד קולגן אני לדמיין קולגן ביניים (1:250 דילול), ארנבת אנטי laminin (1:250 דילול) כדי להמחיש קרום במרתף) בבאר צלחת 12-באר על הנדנדה עם רעד עדין במשך שעה 1, לשטוף מדגם 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם PBS, ואחריו נוגדנים משני המתאים מצומדות לתייג ניאון (למשל אלקסה פלואוריד 546 נגד ארנב עז נוגדנים משני (דילול 1:250)) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    3. לשטוף רצועות רקמה נרחב עם PBS ולאחסן PBS ב -4 ° C
    4. מיד לפני אפיון AFM, לצרף את רצועת רקמות coverslip 15 מ"מ פולי-L-ליזין מצופה על ידי הרמת coverslip מלמטה הרקמה צף, מוודא את רצועת רקמת מתפשט באופן שווה על פני השטח coverslip, במידת הצורך, כריך את הרצועה עם נקי שנייה, ללא ציפוי coverslip ולהפעיל לחץ מתון כדי לסייע עם קובץ מצורף רקמות coverslip poly-L-ליזין מצופה.
    5. כיול מערכת AFM הבאים ההוראה של ייצור מיד לפני כל סיבוב של ניסויים microindentation. קבע שני פרמטרים קריטיים: 1) האביב שלוחה קבוע בשיטה תרמית תנודות באוויר 6; ו, 2) את הרגישות סטיה שלוחה, המהווה פרמטר המשמש הסולם אות פלט photodiode אל המרחק בפועל שלוחה סטיה, Δd. כיול רגישות סטיה ידי השגת עקומת תקן כוח תזוזה ב PBS בשקופית זכוכית נקי ואז לחשב את השיפוע של עקומת כוח העקירה (Fig.1B). במדידה עקירה בכוח את העיקול, קצה AFM מורחב לקראת ואסף מפני השטח מדגם במיקום יחיד (ללא rastering בכיוונים XY), עם סטיה של שלוחה, Δd, פיקוח כפונקציה של עקירה קצה, Δz .

    אנו ממליצים להשתמש סיליקון ניטריד שלוחה משולש עם 5 מיקרומטר קוטר בורוסיליקט כדורי קצה (Novascan). באמצעות בדיקות AFM עם קפיץ קבוע של 0.06 N / m, יש לנו מאופיין מכנית חומרים רכים עם moduli גזירה פורש 100 עד 50,000 אבא.

    1. נגבו את המשטח התחתון של coverslip המדגם בנייר טישו, להדק אותו להחליק כוס שמן רגיל עם ואקום, הר שקופיות הזכוכית על הבמה מדגם AFM, לכסות את הרקמה עם 500 μl PBS (טמפרטורת החדר).
    2. הגדר את המיקרוסקופ לצפייה עין חלקים ליישר את קצה AFM במרכז שדה הראייה באמצעות התאמת הבמה מדגם מיקרוסקופ. בחר שטח של הריבית על הרקמה ידי הזזת הבמה מדגם AFM, ולאחר מכן לעבור מצלמת CCD צופה לרשום בניגוד לשלב תמונה ו / או תמונות פלואורסצנציה של הרקמה, כרצונכם.
    3. בצעו פעולה סטנדרטי AFM האירוסין ידי הזזת קצה AFM לאט כלפי מטה עד שהוא נמצא בקשר עם המדגם.
    4. אפיון מדויק AFM microindentation של דגימות רך דורש בעומק הזחה קטנים, כדי למנוע זנים מקומיים גדולים לפסול את המודל הרץ המשמשים לחישוב מודולוס אלסטיות. כדי למנוע זנים גדולים, לבצע הזחה במצב ההדק ידי קביעת מקסימום שלוחה סטיה (נקודת ההדק) עד 500 ננומטר. זה גבול הסטייה יהיה לרסן אתכוח הכניסה המקסימלי פחות מ -30 NN (F = אביב * שלוחה תזוזה מתמדת, או מקסימום F = 0.06 NN / ננומטר * 500 ננומטר = 30 NN).

    מהירות הכניסה יש לבחור להיות איטי מספיק כדי לחקור אלסטי ולא מאפיינים viscoelastic המדגם רכה 7. טווח מהירות 2-20 מיקרומטר לשניה מתאים רקמת הריאה.

    1. עבור מדידה אחת מתוך שטח של עניין, הזיזו את החללית AFM למיקום עניין לבצע הזחה אחת לאסוף עקומת תקן כוח תזוזה (החללית נעה רק בכיוון-Z בלי סריקה XY).
    2. למיפוי אוטומטי של אזור של עניין, לעבור למצב כוח-Map, בחר את גודל סריקה נקודות דגימה בתוך האזור הנבחר. במצב כוח, מפה, rasters קצה AFM פני השטח מדגם בין תנועות הכניסה, וגובה הפרט בכוח עקירה עקומות בכל נקודה בתוך רשת מדגם מוגדר. נקודות דיגום עוד יספק רזולוציה מרחבית גבוהה אבל להאריך את משך הזמן הנדרש למיפוי. מצאנו את זה מעשי להשתמש 16 x 16 רשת מדגם למפות 80 x 80 מיקרומטר האזור במהירות הכניסה של 20 מיקרומטר לשניה, כך ניתן להשלים ~ 10 דקות.

    3. AFM הפקת נתונים

    1. כדי לחשב את מודול יאנג, להתאים את עקומת כוח תזוזה מודל הכניסה הרץ כדורית באמצעות הריבועים הפחותים שאינו ליניארי הולם מתעקל 8 (תמונה 1, ג):
      משוואה 1
      היכן F = k ג * Δ ד, הוא הכוח לכופף את שלוחה, k c הוא האביב שלוחה קבועה, R הוא קצה רדיוס כדור, δ = Δ z - Δ ד היא הכניסה ואת υ הוא פואסון של מדגם תפעוליות (υ = 0.4 על רקמת הריאה 9).
    2. כדי להעריך את איכות התאים, לחשב את הערך SSR, או סכום של ריבועים של ההבדל בין הנתונים לבין ערכים מתאימים, במהלך הולם שאינו ליניארי את העיקול. ביטול מדידות אמין או בלתי לפירוש על ידי השלכת נתונים מ עקומות "רע" עם ערכים SSR גדול.
    3. אם תרצה, להמיר אלסטי מודול (E) כדי גזירה מודולוס (G), באמצעות הקשר E = 2 x (1 + υ) x ג'כדי להמחיש דפוסי המרחבי של נוקשות שנאספו במצב כוח, מפה, העלילה נתונים מודול בתוך קונטור מפות (לדוגמא ברשת 16 x 16 מדגם המשתרע על 80 x 80 מיקרומטר שטח).
    4. כדי לעבד כמות גדולה של נתונים עקומת כוח, אלגוריתם מנהג עשוי להיות כתובה באופן אוטומטי להתאים בכוח עקירה עקומות, תמצית moduli, ו / או elastographs העלילה באמצעות אותם הליכים ופרמטרים כפי שמתואר 3.2 ו -3.3 (כגון Matlab).

    איור 1
    איור 1 (א) סכמטי של microindentation AFM מדגם רך על מצע קשיח באמצעות בדיקה כדורית (מחדש עם אישור Dimitriadis א, et al. 2002 Biophys J 8). (ב) נציג בכוח עקירה עקומת שנאספו זכוכית שקופית נקי PBS לקבוע סטיה רגישות שלוחה. (ג) כוח תזוזה עקומות נציג שנאספו (אדום) דגימות רך (כחול) ונוקשה מראה את הפרמטרים המתאימים של (A).

    4. נציג תוצאות:

    איור 2 א מראה parenchyma הריאה מחוברת רצועה על coverslip poly-L-ליזין מצופה PBS עם בדיקה AFM במקום ישירות מעל אזור של אינטרס ומוכן מיפוי microindentation. איור 2B מראה כי ברקמות לחתוך כראוי מוכתם, ארכיטקטורה מכתשיים של הריאה parenchyma נשמר היטב, כפי שנצפה על ידי צביעת immunofluorescent עבור laminin קרום מרכיב במרתף ללא קיבוע או permeabilization. איור 2 CD להראות מכתים immunofluorescent עבור קולגן אני מבולבל בריאות טריים שנקטפו מן העכברים שטופלו בעבר עם PBS (איור 2 ג), או שטופלו bleomycin (איור 2 ד) כדי לגרום סיסטיק 10.

    איור 3A מראה כוח תזוזה מדגם מגרשים המתקבל microindentation AFM. עם הכוח ליישם אותו, AFM הטיפ יוצרת הזחה גדולה על אזור רך (קו כחול), וכתוצאה מכך יחסית עקומה "שטוח" עקירה בכוח לעומת חריץ קטן "תלול" עקירה בכוח עקומת עבור אזור נוקשה ( הקו האדום). על מנת לקבל את עקומות הכוח נקי, לאחר הכניסה לכל קצה AFM צריך להיות חזר בו לחלוטין מפני השטח מדגם ללא קשר לפני הכניסה הבאה. זו מדינה חופשית מגע מתאים באזור השטוח של העקומה ב איור 3A, שם בקצה מתרגמת ללא סטיה שלוחה. איור 3 ב מציג את עקומת שקר טיפוסי ללא באזור שטוח אשר מתרחשת כאשר קצה לא חזר בו לחלוטין מפני השטח מדגם (מדגם רך לדוגמאttaches אל קצה) כך שלא ניתן לקבוע את נקודת מגע. אם קצה לכוד לגמרי מדגם רך, העקום עשוי להיראות כפי שמוצג באיור 3C, ללא הטיה ברורה אבל רעש קטן.

    איור 4 מראה נתונים מודולוס גזירה מופק בכוח עקירה עקומות מוצג מרחבית כמו מפות נוקשות (elastographs), שם קשקשים בצבע עם מודולוס גזירה. Elastographs להדגים הבדלים ניכרים בטווח והפצה של מודולוס גזירה רקמה נורמלית (איור 4 א) ו fibrotic (איור 4B) ריאות parenchyma, ווריאציות מרחבית גדולה מודולוס גזירה, במיוחד בתוך המדגם ריאות fibrotic.

    איור 2
    איור 2.) A (לעומת שלב מיקרוסקופ מראה בדיקה AFM מעל רצועת ריאות עכבר parenchyma. סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. (ב) Immunostaining של laminin ברקמת הריאה עכבר נורמלי מראה את ארכיטקטורה מכתשיים של parenchyma ריאות נורמליים. קופסה לבנה מציין מיפוי טיפוסי 80-by-80μm אזור אלסטיות. בר קנה מידה: 20 מיקרומטר. (C ו-D) Immunostaining של קולגן אני בתוך מלוחים (C) bleomycin (ד ') שטופלו ריאות עכבר parenchyma. סולם ברים, 100 מיקרומטר.

    איור 3
    איור 3. (א) נציג לפירוש בכוח עקירה עקומות שנאספו מלוחים (כחול) bleomycin שטופלו (אדום) עכבר ריאות parenchyma, בהתאמה. הקווים השחורים הם בכושר הטוב ביותר הנובע המודל הרץ כדורי מסומנים עם המקביל שלהם מחושב של יאנג moduli. (B, C) נציג האו"ם לפירוש בכוח עקירה עקומות.

    איור 4
    איור 4. Elastographs נציג שנאספו מלוחים (א) ו bleomycin שטופלו (ב) ריאות parenchyma העכבר. ברים צבע מצביעים מודולוס גזירה kilopascals. תוויות ציר עולה בקנה מידה מרחבי מיקרומטר. בר קנה מידה: 20 מיקרומטר

    Discussion

    אפיון מכני של רקמת הריאה באמצעות AFM microindentation מציע ברזולוציה מרחבית חסרת תקדים (איור 4), המספק נקודת מבט ייחודית על וריאציות microscale ב קשיחות הרקמה. כדוגמה השירות שלה, הקודם מאקרו בקנה מידה מדידות רצועות רקמה נורמלית fibrotic ריאות הצביעו על עלייה משוער 2-3 של פי elastance עם סיסטיק 11,12. לעומת זאת, microindentation AFM מגלה כי התקשות רקמות הוא מקומי מאוד, עם אזורים מסוימים מציג עד ~ מגדיל פי 30 ב מודולוס גזירה מעל החציון שנצפתה רקמת הריאה נורמלי 10. כמו נוקשות מטריצה ​​כיום ידוע באופן ביקורתי להשפיע על תפקוד התאים, המדידות הללו המקומית לספק פרמטרים שלא יסולא בפז כדי לשפר את biofidelity המחקר התא התרבות של תאים הריאות.

    כמה עולות סוגיות מעשיות לשימוש רצועות דקות של רקמת הריאות. משטחים של רצועות אינם שטוח לחלוטין, כמו פרופיל רקמות בעקבות הארכיטקטורה של alveoli הבסיסית. מערכת AFM באופן אוטומטי את מיקום קצה בכיוון-Z במהלך הכניסה כאשר פני השטח מדגם וריאציה גובה קטן מ -15 מיקרומטר כדי לסייע להתגבר על האתגר הזה. המדידות נעשות בטמפרטורת החדר, לא 37 ° C, ולכן סטיות של תכונות מכניות הנגרמת על ידי וריאציה זו בטמפרטורה לא ניתן להעריך, אם כי הם יהיו צפויים להיות קלים. השפעת הארכיטקטורה שבבסיס קיר מכתשיים על תכונות מכניות נצפתה קשה לקבוע עם ההגדרה הנוכחית במיקרוסקופ אור. למשל, רצוי לקבוע אם הקירות מכתשיים התערוכה אנאיזוטרופיה תכונות מכניות שונות כאשר מסוכסך בכיוונים מיושר עם או רוחבי למישור הקיר. עם זאת, דגימות הנוכחי עבים מערכת הדמיה אין יכולות 3D, ולכן לא ניתן לקבוע את הכיוון המקומית קיר מכתשיים בכל נקודת מגע. לבסוף, את השפעתם של מרכיבים הסלולר על תכונות מכניות נמדד עדיין לא הובהר באופן מלא. בכל השיטות המפורטות כאן, המאמצים לא נעשים במפורש להסיר מרכיבים הסלולר של הרקמה. עם זאת, התאים את ההווה על פני השטח זמין עבור הכניסה צפויים להיות בת קיימא לנוכח הזמן שחלף מאז הקציר רקמות הצורך חיתוך הרקמה כדי לקבל גישה alveoli. ניסויים ספציפיים כדי להסיר תאים או לאכלס מחדש מטריצות עם תאים קיימא, ולהעריך את השינויים וכתוצאה מכך קשיחות הרקמה יופיע מוצדקת.

    מכיוון רקמת מבולבל טרי דרוש מדידות אלה, הזמן שחלף מן הקציר רקמות מדידה צריך להיות ממוזער דגימות צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע שינויים תכונות מכניות. תשומת לב מיוחדת צריך להיות משולם בכל פעם רצועות ורקמות מועברים בין המכולות במהלך הכביסה או מכתים כך עיוות נזק מינימלי או מופק. עבור יישום AFM בנוזל, היא צעד חיוני כדי לחתוך את הרקמה כפי שטוחה ככל האפשר לשתק את המדגם על coverslip התומכת. אם זמין, מכונת חתך אוטומטי כגון vibratome או מבצעה רקמה ניתן להשתמש כדי לחתוך פרוסות בעובי אחיד מאוד. חשוב לצרף רצועות רקמה מיד לפני מדידות AFM ולמזער את הזמן שחלף עבור מדידות AFM כמו המדגם יהיה בסופו של דבר להתנתק coverslips. תצפית אחת שימושית כי רצועות גדול להופיע לצרף ביציבות יותר כדי לכסות את תלושי להישאר במקום משכי זמן של PBS מאשר רצועות קטנות יותר.

    Microindentation AFM ניתן לאפיין דגימות פורש מגוון רחב של אבא 100 עד kPa 50 (גזירה מודולוס) בעת שימוש 0.06 תקן N / שלוחה מ 'עם טיפ 5 מיקרומטר קוטר כדורית. טווח זה ניתן להרחיב באמצעות בדיקות עם קבועי קפיץ שונים; בדיקות AFM עם טיפים זכוכית כדורית החל 0.6-12 מיקרומטר קבועים בקוטר האביב החל 0.01-0.58 N / m זמינים מסחרית (לדוגמה Novascan) ו נפוץ 3. עם קצה כדורי 5 מיקרומטר, האזור קשר תיאורטי בין עצה לבין רקמות היא כ 5-9 מיקרומטר 2 עבור הכניסה 400-700 ננומטר (איור 1A). טיפים קטנים יותר או גדול יותר יכול לשמש כדי לספק סולמות קטן או גדול של רזולוציה מרחבית. טיפים פירמידה יש גם בשימוש microindentation AFM 13-16, מתן מגע באזורים קטנים יותר ובכך להגדיל רזולוציה מרחבית במיפוי, אם כי ראוי נתונים מורכב יותר עבור הגיאומטריה טיפ זה.

    מספר מגבלות לשיטה זו יש לציין. הריאות באופן מסורתי מאופיין מכנית הלא פולשני, למשל באמצעות הלחץ בנפח 17 או ניתוח פונץ הכניסה של הריאות כל 19,20. שיטות פולשנית כמו זה המתואר כאן לשנות את הארכיטקטורה ריאות במובנים חשובים דרך אובדן int אוויר הנוזלerface כי בדרך כלל קיימת הריאות אוויר מילאו את ואובדן להדגיש מראש כי האינפלציה שומרת ריאות חלקית על הרפיה של שרירי הנשימה. מגבלות אלה משותפת לכל המדידות שנעשו רקמת הריאות 18 רצועות. יש לציין, עם זאת, נוקשות החציוני הנמדד parenchyma של רקמת הריאה נורמלי (מודולוס גזירה ~ 0.5kPa) לא שונות באופן מהותי מן אומדנים המבוססים על הכניסה-אגרוף של הריאות שלם בעוצמות מנוחה 19,20. בעוד רקמת הריאה ידוע התערוכה שאינו ליניארי התקשות עם העיוות גדל, לא ניתן לבדוק באופן קפדני אם נכס זה נמשכת עד בקנה מידה מיקרו עם השיטות הננקטות כאן. המודל מניח הרץ ההומוגניות של המדגם. עם זאת, חומרים ביולוגיים ביותר, כולל ריאות parenchyma, הם הטרוגניים יותר ויותר ירידה קשקשים מרחבית. ההטרוגניות של המדגם יכול לגרום חפצים כמו וריאציה של מודול של יאנג, תלוי בעומק הכניסה, כלומר בהתאם השכבה או רכיב זה עיוות. ההטרוגניות במישור xy, יכול להיות מוגבל על ידי בחירה מדוקדקת בגודל המתאים קצה כדוריים בהתאם מיקרו של ביולוגי כפי שהוצע על ידי Dimitriadis EK et al. 8 זה הרבה יותר קשה לחזות או לתקן את השגיאה מודל הרץ בשל חומר ההטרוגניות בכיוון-z. Azeloglu et al. לאחרונה הציע מודל חישובי היברידית לאפיין את תכונות אלסטיות של המצע הטרוגנית עם תכלילים מוטבע בדידים 21. הטכניקה החדשה שלהם מספק פוטנציאל אמצעי כדי לחשב תכונות הכללתם של חומרים הטרוגניים להתגבר על המגבלות של ניתוח Hertzian.

    המודל מניח הרץ גם התנהגות אלסטית מוחלטת, בעוד חומרים ביולוגיים בדרך כלל להציג תלוי זמן התנהגויות viscoelastic. אפיון viscoelastic מלא של רקמה ניתן להשיג על ידי שינוי מהירויות הכניסה בשימוש. חשוב לציין, בדיקות קודמות מאקרו בקנה מידה מכנית של רקמת הריאה נורמלי fibrotic מדגים תלות תדר חלש של רקמת הריאה תכונות מכניות, ושמירה על ההבדלים בין מאפייני רקמת נורמלי fibrotic מכני על פני תדרים כל נבדק 11. ממצאים אלו ממליצים כי מדידת תכונות מכניות באמצעות מהירות הכניסה יחיד עם AFM לוכדת היבט חיוני של שינויים במאפייני הרקמה מכני שמלווים פיברוזיס.

    היחס של פואסון של 0.4 עבור רקמת הריאה המשמש עבודה זו היא מן מדידה מאקרוסקופי 9. למרבה הצער, יחס של פואסון על מיקרו בקנה מידה שינויים בתנאי המחלה אינם זמינים בספרות. כפי חלופות E, E / (1-υ 2) או (1-υ 2) / πE (סימלה את k קבוע אלסטי) 22 ניתן לחשב microindentation AFM ודיווח כאשר היחס של פואסון אינו ידוע. עבור רוב biomaterials היחס של פואסון הוא בטווח של 0.4-0.5 בגלל תכולת המים הגבוהה שלהם. בטווח 0.3-0.5, הגורם 1 / (1-υ 2) משתנה רק 1.10-1.33, כך וריאציות סביר ביחס של פואסון להפעיל רק תופעות צנוע על מודול דיווח. הגידול מודולוס גזירה שאנחנו הדוח היחסית רקמות fibrotic אל הרקמות הוא פי כמה גודל, רומז כי השגיאות המשויכות וריאציות של יחס פואסון הם קלים יחסית לשינויים שנצפו תכונות מכניות.

    האלגוריתם קוד בפועל שיכול לשמש לניתוח נתונים עקירה בכוח כפוף לתנאי היישום הספציפי ואת המאפיינים הבאים של אוכלוסיות מגוונות של עקירה בכוח עקומות. אם ניתוח מתוחכם יותר מעניין, אפשר להתייעץ העבודה של Lin et al. 23. החוקרים ערכו סדרה של אסטרטגיות סינרגיסטי לתוך אלגוריתם מתגבר רבים של סיבוכים אשר מנע בעבר מאמצים כדי להפוך את הרץ הולם של מודלים של נתונים הכניסה.

    בתחומים אחרים קיימות מספר לפיתוח ניצול נוסף של שיטה זו. במקרים שבהם אחד הוא מעוניין לדמיין את קירות מכתשיים ללא תיוג נוגדן, הן קולגן ואלסטין ו ניתן דמיינו מן האות autofluorescent שלהם בספקטרום הירוק. מצד שני, הדמיה טובה יותר, או באמצעות קטעי רקמה רזה, שיטות הדמיה 3D, או שניהם, יכול לשפר את היכולת לקשר בין הארכיטקטורה הבסיסית רקמות עם תכונות מכניות. בעוד השיטות הקיימות ולאפשר מכתים ויזואליזציה של מרכיבי תאי מטריקס כגון קולגן laminin, מאמצים נוסף יכול להיות מכוון מכתים פני התא סמנים לזיהוי אוכלוסיות תאים ספציפיים כדי לאפיין את microenvironments מכני בקרבת אוכלוסיות כאלה. Alternatively, רקמה ניתן לקצור מעכברים להביע fluorescently-tagged השושלת סמנים או חלבונים ספציפיים בתא להמשיך את אותה המטרה. לבסוף, השיטה המפורטת כאן מופיע גם מתאים לאפיון תכונות אנטומיות אחרות בריאה, כגון כלי אשר לשפץ ב יתר לחץ דם, ואת דרכי הנשימה אשר לשפץ באסתמה. בהתבסס על המצב הנוכחי של פיתוח פוטנציאל שיפור נוסף, microindentation AFM מופיע צפוי להניב תובנות רבות ערך את השינויים רקמות נוקשות שמלווים התקדמות המחלה בריאה, יהיה ללא ספק להיות בעל ערך באפיון שינויים במרחב ובזמן ב קשיחות של מגוון רחב של רקמות רכות אחרות.

    Disclosures

    אין ניגודי אינטרסים הכריז.

    Acknowledgements

    אנו מודים תג'ר א 'וב' שיאה של שיתוף הפעולה המתמשך שלהם, לצורך מתן רקמת הריאה למטרות הדגמה כאן. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק HL-092961. עבודה זו בוצעה כחלק במרכז מערכות ננומטריות (CNS), חבר של רשת ננוטכנולוגיה התשתיות הלאומיות, אשר נתמך על ידי קרן המדע הלאומית תחת הפרס NSF ECS-0335765. CNS היא חלק מהפקולטה למדעים ואמנויות באוניברסיטת הרווארד.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    AFM tip Novascan Technologies, Inc. PT.GS 5 micron Borosilicate bead, 0.06 N/m
    Poly-L-Lysine coverslips VWR international 354085 BD BioCoat 12 mm round No.1 glass
    Agarose, Low Gelling Temperature Sigma-Aldrich A0701
    Rabbit anti-Collagen I (Rb pAb) antibody Abcam ab34710-100
    Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit antibody Invitrogen A11010
    Rabbit anti-Laminin Sigma-Aldrich L9393

    References

    1. Wang, H.B., Dembo, M., & Wang, Y.L. Substrate flexibility regulates growth and apoptosis of normal but not transformed cells. Am J Physiol Cell Physiol. 279, C1345-1350 (2000).
    2. Paszek, M.J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
    3. Klein, E.A., et al. Cell-cycle control by physiological matrix elasticity and in vivo tissue stiffening. Curr. Biol. 19, 1511-1518 (2009).
    4. Discher, D.E., Janmey, P., & Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
    5. Bergner, A. & Sanderson, M.J. Airway contractility and smooth muscle Ca(2+) signaling in lung slices from different mouse strains. J Appl Physiol. 95, 1325-1332 (2003).
    6. Thundat, T., Warmack, R.J., Chen, G.Y., & Allison, D.P. Thermal and ambient-induced deflections of scanning force microscope cantilevers. Appl Phys Lett. 64, 2894-2896 (1994).
    7. Mahaffy, R.E., Shih, C.K., MacKintosh, F.C., & Kas, J. Scanning probe-based frequency-dependent microrheology of polymer gels and biological cells. Phys Rev Lett. 85, 880-883 (2000).
    8. Dimitriadis, E.K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., & Chadwick, R.S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophys. J. 82, 2798-2810 (2002).
    9. Butler, J.P., Nakamura, M., Sasaki, H., Sasaki, T., & Takishima, T. Poissons' ratio of lung parenchyma and parenchymal interaction with bronchi. Jap. J. Physiol. 36, 91-106 (1986).
    10. Liu, F., et al. Feedback amplification of fibrosis through matrix stiffening and COX-2 suppression. J Cell Biol. 190, 693-706 (2010).
    11. Ebihara, T., Venkatesan, N., Tanaka, R., & Ludwig, M.S. Changes in extracellular matrix and tissue viscoelasticity in bleomycin-induced lung fibrosis. Temporal aspects. Am J Respir Crit Care Med. 162, 1569-1576 (2000).
    12. Dolhnikoff, M., Mauad, T., & Ludwig, M.S. Extracellular matrix and oscillatory mechanics of rat lung parenchyma in bleomycin-induced fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 160, 1750-1757 (1999).
    13. Rehfeldt, F., Engler, A.J., Eckhardt, A., Ahmed, F., & Discher, D.E. Cell responses to the mechanochemical microenvironment--implications for regenerative medicine and drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 59, 1329-1339 (2007).
    14. Berry, M.F., et al. Mesenchymal stem cell injection after myocardial infarction improves myocardial compliance. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290, H2196-2203 (2006).
    15. Azeloglu, E.U., Bhattacharya, J., & Costa, K.D. Atomic force microscope elastography reveals phenotypic differences in alveolar cell stiffness. J Appl Physiol. 105, 652-661 (2008).
    16. Wagh, A.A., et al. Localized elasticity measured in epithelial cells migrating at a wound edge using atomic force microscopy. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, L54-60 (2008).
    17. Martinez, F.J. & Flaherty, K. Pulmonary function testing in idiopathic interstitial pneumonias. Proc Am Thorac Soc. 3, 315-321 (2006).
    18. Cavalcante, F.S., et al. Mechanical interactions between collagen and proteoglycans: implications for the stability of lung tissue. J Appl Physiol. 98, 672-679 (2005).
    19. Hajji, M.A., Wilson, T.A., & Lai-Fook, S.J. Improved measurements of shear modulus and pleural membrane tension of the lung. J Appl Physiol. 47, 175-181 (1979).
    20. Lai-Fook, S.J., Wilson, T.A., Hyatt, R.E., & Rodarte, J.R. Elastic constants of inflated lobes of dog lungs. J Appl Physiol. 40, 508-513 (1976).
    21. Azeloglu, E.U., Kaushik, G., & Costa, K.D. Developing a hybrid computational model of AFM indentation for analysis of mechanically heterogeneous samples. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc., 4273-4276 (2009).
    22. A-Hassan, E., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophys J. 74, 1564-1578 (1998).
    23. Lin, D.C., Dimitriadis, E.K., & Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. J. Biomech. Eng. 129, 430-440 (2007).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter