利用原子力显微镜对肺组织进行微机械特性表征

以下实验的总体目标是通过使用原子力显微镜微压痕技术直接测量新鲜小鼠肺组织的局部弹性特性，从而在与定居细胞相关的空间尺度上表征肺实质的局部力学环境。该目标通过以下步骤实现：使用刀片或手术刀将琼脂糖灌注膨胀的小鼠肺组织切割，制备长宽各5毫米、厚度为400微米的肺实质条状样本。随后对未经固定和透化的肺组织条进行免疫染色，以识别原子力显微镜微压痕分析所需的感兴趣区域。

然后在室温下于 PBS 中对组织条进行原子力显微镜微压痕（FM microindentation）操作，以直接测量新鲜肺组织的局部弹性特性并获得结果。结果显示，正常与纤维化肺实质在组织硬度的范围和分布上存在显著差异，且硬度具有较大的空间变异性，尤其在纤维化肺组织样本中更为明显。

基于使用FM微压痕技术获得的强制位移曲线提取的刚度图谱。与现有的组织条带拉伸等测量方法相比，该技术的主要优势在于其提供了前所未有的空间分辨率，从而能够独特地揭示组织刚度在微尺度上的变化。该测量方法有助于回答一些关键科学问题，例如组织内刚度如何在空间上分布，以及在疾病过程中刚度变化的范围和空间尺度是什么。

导致组织重塑的过程，首先需要制备肺组织条带，开始时通过向离体小鼠肺部注入温热的、浓度为2%的低凝胶点琼脂糖（在PBS中配制）以每公斤体重50毫升的剂量经气管注入，结扎气管后，将充气的肺置于4摄氏度的PBS浴中冷却60分钟，使肺结构得到固定。琼脂糖将在气道腔隙中发生凝胶化并硬化，从而轻柔地稳定肺组织结构。在此期间，使用剃刀或手术刀将琼脂糖固定的肺组织切成长约5毫米、宽约5毫米、厚约400微米的组织条带。

随后在 37 摄氏度的 PBS 中洗涤组织条 5 分钟，以去除残留的 aros，排除大气道和大血管。若需成像大气道和大血管，则从靠近主支气管的肺组织区域切割组织条；若需进行原子力显微镜（AFM）微压痕分析以分离感兴趣区域，则从远离主支气管的胸膜下区域切割组织条。通过相差显微镜或免疫染色对组织进行观察，并通过荧光显微镜进行荧光成像。

请参见本方案的文字部分以了解具体操作步骤。在进行荧光显微镜表征之前，立即将组织条段附着于聚-L-赖氨酸包被的15毫米盖玻片上：从漂浮组织下方将盖玻片抬起，确保组织条段均匀铺展在盖玻片表面。如有必要，可用第二片洁净未包被的盖玻片与之夹合，并施加轻微压力，以促进组织条段与聚-L-赖氨酸包被盖玻片的黏附。

每次进行微压痕实验前，立即按照制造商的说明校准原子力显微镜（AFM）系统。为此，需确定两个关键参数：使用空气中的热波动法测定悬臂梁的弹簧常数，以及测定悬臂梁偏转灵敏度，后者是用于将光电二极管输出信号换算为实际悬臂梁偏转距离的参数。

通过在洁净的玻璃片上的 PBS 中获取标准的强制位移曲线来校准挠度灵敏度。然后计算强制位移曲线测量中强制位移曲线的斜率。在单一位置处，AFM 针尖向样品表面推进并随后撤回，同时监测悬臂挠度 delta D 随针尖位移 delta Z 的变化。建议使用氮化硅三角形悬臂，其末端带有直径为 5 µm 的硼硅酸盐球形针尖，AFM 探针的弹簧常数为 0.06 N/m。

我们已对剪切模量范围为100至50,000帕斯卡的软材料进行了力学表征。用纸巾擦拭样品盖玻片的底面，然后用真空脂将其固定在标准载玻片上。将载玻片安装到原子力显微镜样品台，并用500微升室温磷酸盐缓冲液覆盖组织。

然后将原子力显微镜扫描头置于样品上方。调节显微镜载物台，使目镜观察时原子力显微镜针尖位于视野中心。移动原子力显微镜样品台，选择组织上感兴趣的区域。

然后切换至CCD相机观察，根据需要记录组织的相差图像和/或荧光图像。缓慢向下移动原子力显微镜（AFM）针尖，直至其准确接触样品。对软样品进行AFM微压痕表征时，需采用较小的压痕深度，以避免产生较大的局部应变，从而防止破坏用于弹性模量计算的赫兹（Hertz）模型。为避免大应变，应通过将悬臂最大偏转设为500纳米，以触发模式进行压痕操作。

该偏转限值将最大压痕力限制在 30 纳牛以内。压痕速度应选择得足够慢，以探究软样品的弹性而非黏弹性特性。对于肺组织，在感兴趣区域进行单次测量时，应选择每秒 2 至 20 微米的速度范围。

将原子力显微镜探针移动至目标位置，并进行单次压痕以采集标准的力-位移曲线。探针仅在Z方向移动。如需对目标区域进行自动映射，请切换至力图模式，选择扫描尺寸及选定区域内的采样点。

原子力显微镜探针在压痕运动之间在样品表面进行扫描，并在预定义的样品网格内每个点采集单独的力-位移曲线。我们发现，使用16×16的样品网格来映射80微米×80微米的区域是较为可行的，压痕速率为每秒20微米，整个过程约需10分钟。为计算杨氏模量，可采用最小二乘法非线性曲线拟合，将力-位移曲线拟合至赫兹球形压痕模型，如公式所示：F等于K下标C乘以δD，其中F为使悬臂弯曲的力。

K sub C 为悬臂梁的弹簧常数。R 为球形探针尖端半径，δ = δZ - δD 表示压痕深度，ν 为样品的泊松比，对于肺组织其值为 0.4。为评估拟合质量，需在非线性曲线拟合过程中计算 SSR 值，即数据值与拟合值之差的平方和。

通过舍弃 SSR 值较大的无效曲线数据，剔除不可靠或无法解释的测量结果。如有需要，可根据关系式 E = 2(1 + ν)G 将弹性模量（E）转换为剪切模量（G）。为可视化力图模式下采集的刚度空间分布，可绘制模量数据及等高线图，例如覆盖 80 微米 × 80 微米区域的 16 × 16 网格图。

为了处理大量力-曲线数据，可编写自定义算法，以自动拟合力-位移曲线、提取模量，或绘制轮廓图或ELA图。采用上述相同步骤和参数，本图显示组织被正确切割并染色。通过免疫荧光染色检测基底膜组分层粘连蛋白，可观察到肺实质的肺泡微结构在未固定和未透化的条件下得到了良好保存。

这些图板显示了对胶原蛋白的免疫荧光染色结果，样本来自先前用 PBS 或博来霉素处理以诱导纤维化的小鼠的新鲜未固定肺组织。此处展示了在相同施加力条件下通过原子力显微镜微压痕实验获得的力-位移曲线。原子力显微镜探针在较软区域产生较大的压痕，形成相对平缓的蓝色力-位移曲线；而在较硬区域则产生较小压痕，对应陡峭的红色力-位移曲线。

为了在每次压痕后获得清晰的力曲线，原子力显微镜（AFM）针尖必须从样品表面完全回缩，并在下一次压痕前处于无接触状态。这种无接触状态对应于曲线中的平坦区域，即针尖移动但悬臂无偏转的阶段。本图显示了一条典型的错误曲线，其缺少平坦区域，这种情况通常发生在针尖未从样品表面完全回缩时，例如当柔软样品粘附在针尖上，导致针尖完全陷入软样品中，从而无法确定接触点。

该曲线可能看起来没有明显的偏转，但存在微小噪声。此图显示的是刚度。从强制位移曲线中提取的数据以空间分布的形式呈现为刚度图谱，称为ELAs移植图，其中颜色深浅对应刚度大小。ELAs移植图清晰地展示了正常与纤维化肺实质组织在刚度范围和分布上的显著差异，以及刚度在空间上的巨大变化，尤其是在纤维化肺样本中更为明显。

观看本视频后，您应能够很好地理解如何通过使用原子力显微镜直接测量新鲜肺组织的局部弹性特性，来表征肺实质的局部力学环境。