Name: 微型机械的肺组织利用原子力显微镜表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 了解利用原子力显微镜微压痕技术表征小鼠肺组织局部机械特性的方法。该技术可测量正常与纤维化肺组织的弹性差异，为研究疾病机制提供高分辨率的空间刚度图谱。

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感谢 A. Tager 和 B. Shea 的持续合作，并提供了用于演示目的的肺组织。本工作由美国国立卫生研究院资助项目 HL-092961 支持。本研究部分在哈佛大学文理学院的纳米尺度系统中心（CNS）完成，CNS 是国家纳米技术基础设施网络（NNIN）的成员，由美国国家科学基金会根据 NSF 奖项 ECS-0335765 提供支持。

1. 肺组织条制备
<ol>
 <li>肺组织具有高度顺应性，难以切割成条状用于原子力显微镜（AFM）表征。为在切割过程中暂时稳定肺结构，可通过气管向离体小鼠肺内注入每公斤体重50 ml、预热至37°C的2%低凝胶点琼脂糖（用PBS配制）。结扎气管后，将充胀的肺置于4°C的PBS浴中冷却60分钟。在此期间，琼脂糖将在气道空间内凝胶化并硬化，从而轻柔地稳定肺组织结构5。若需进一步增强组织切割时的稳定性，可使用更高浓度的琼脂糖，例如3–4%。</li>
 <li>使用刀片或手术刀将经琼脂糖稳定的鼠肺组织切成5 mm × 5 mm大小、厚度为400 μm的组织条，随后将组织条置于预热至37°C的PBS浴中，在台式加热搅拌仪上的100 ml玻璃烧杯内洗涤5分钟，以去除残留琼脂糖。为排除大气道和大血管，应从远离主支气管的胸膜下区域取材。若需对气道或大血管成像，则应从靠近主支气管的肺组织区域切割组织条。</li>
</ol>
2. 原子力显微镜微压痕与荧光成像
<ol>
 <li>为进行原子力显微镜微压痕实验并确定感兴趣的区域，可通过相差显微镜观察组织，或对组织进行免疫染色后通过荧光显微镜观察。进行免疫染色时，在室温下用来源于合适二抗宿主的5%血清（溶于PBS）封闭组织条，封闭2小时，期间不进行固定或通透处理。</li>
 <li>将组织条置于12孔板的孔中，加入适当的一抗（例如：兔抗I型胶原抗体用于显示间质胶原，稀释比1:250；兔抗层粘连蛋白抗体用于显示基底膜，稀释比1:250），在摇床上轻柔振荡孵育1小时；用PBS洗涤样本3次，每次5分钟；随后加入相应荧光标记的二抗（例如：Alexa Fluor 546标记的山羊抗兔二抗，稀释比1:250），室温孵育1小时。</li>
 <li>用PBS充分洗涤组织条，并将其保存于4 °C的PBS中。</li>
 <li>在进行原子力显微镜表征前，立即通过以下方式将组织条固定于聚-L-赖氨酸包被的15 mm盖玻片上：从漂浮组织下方提起盖玻片，确保组织条均匀铺展在盖玻片表面；如有必要，可用第二个洁净未包被的盖玻片夹住组织条，并施加轻微压力以促进组织与聚-L-赖氨酸包被盖玻片的贴附。</li>
 <li>每次微压痕实验前，按照制造商说明校准原子力显微镜系统。确定两个关键参数：1）利用空气中的热波动法测定悬臂弹簧常数6；2）测定悬臂偏转灵敏度，该参数用于将光电探测器输出信号换算为实际的悬臂偏转距离Δd。通过在洁净玻片上的PBS中获取标准力-位移曲线，计算力-位移曲线的斜率来校准偏转灵敏度（图1B）。在力-位移曲线测量过程中，原子力显微镜探针在单一位置垂直靠近并远离样品表面（不进行X-Y方向扫描），同时监测悬臂偏转Δd随探针位移Δz的变化关系。</li>
</ol>
建议使用带有5-μm直径硼硅酸盐球形尖端的氮化硅三角悬臂梁（Novascan）。采用弹簧常数为0.06 N/m的原子力显微镜探针，我们对剪切模量范围在100至50,000 Pa之间的软材料进行了力学表征。
<ol start="6">
 <li>用擦镜纸擦拭样品盖玻片的底面，用真空脂将其固定在标准载玻片上，将载玻片安装到原子力显微镜（AFM）样品台，并在组织上覆盖500 μl磷酸盐缓冲液（PBS，室温）。 </li>
 <li>调整显微镜样品台，通过目镜观察将AFM探针置于视野中心。通过移动AFM样品台选择组织上的感兴趣区域，然后切换至CCD相机观察，按需记录组织的相差图像和/或荧光图像。 </li>
 <li>执行标准的AFM接触操作，缓慢向下移动AFM探针，直至其与样品接触。</li>
 <li>对软样品进行精确的AFM微压痕表征时，需采用较小的压入深度，以避免产生较大的局部应变，从而导致用于弹性模量计算的赫兹（Hertz）模型失效。为避免大应变，应以触发模式进行压痕实验，将悬臂梁的最大偏转（触发点）设定为500 nm。该偏转限制可使最大压痕力保持在30 nN以下（F = 悬臂梁弹簧常数 × 位移，即 Fmax = 0.06 nN/nm × 500 nm = 30 nN）。</li>
</ol>
压痕速度应选择得足够慢，以便探究软样品的弹性而非黏弹性特性。7 . 速度范围为 2-20 μm 每秒的速率适用于肺组织。 
<ol start="10">
 <li>对于感兴趣区域的单次测量，将原子力显微镜（AFM）探针移动至目标位置，并进行单次压痕以采集标准的力-位移曲线（探针仅在Z方向移动，不进行X-Y扫描）。</li>
 <li>对于感兴趣区域的自动映射，切换至力图（Force-Map）模式，选择扫描尺寸及选定区域内的采样点。在力图模式下，AFM针尖在压痕运动之间逐行扫描样品表面，并在定义的采样网格内每个点采集独立的力-位移曲线。采样点越多，空间分辨率越高，但映射所需时间也相应延长。我们发现，使用16×16的采样网格对80×80–μm区域进行映射，压痕速度为20 μm每秒，约需10分钟即可完成，具有较好的实用性。</li>
</ol>
3. 原子力显微镜数据提取
<ol>
 <li>为计算杨氏模量，使用最小二乘非线性曲线拟合方法将力-位移曲线拟合至赫兹球形压痕模型8（图1 A,C）： 
 <img src="/files/ftp_upload/2911/2911eq1.jpg" alt="弹性模量公式 E=3(1-v²)F/4R^(1/2)δ^(3/2)，应力-应变分析，方程。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 1"> 
 其中 F = kc * Δd 为使悬臂弯曲的力，kc 为悬臂弹簧常数，R 为球形探针半径，δ = Δz - Δd 为压入深度，υ 为样品的泊松比（肺组织的 υ = 0.49）。</li>
 <li>为评估拟合质量，在非线性曲线拟合过程中计算 SSR 值，即数据与拟合值之差的平方和。通过剔除 SSR 值较大的“不良”曲线数据，排除不可靠或无法解释的测量结果。</li>
 <li>如需要，可利用关系式 E = 2 × (1 + υ) × G 将弹性模量（E）转换为剪切模量（G）。为可视化力图模式下采集的刚度空间分布，可将模量数据绘制成等高线图（例如，在覆盖 80 × 80 μm 区域的 16 × 16 样品网格上）。</li>
 <li>为处理大量力曲线数据，可编写自定义算法，自动拟合力-位移曲线、提取模量和/或使用与 3.2 和 3.3 节所述相同的方法和参数绘制弹性图（例如使用 Matlab）。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig1.jpg" alt="原子力显微镜示意图：悬臂梁偏转；针尖位移与输出电压的关系图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1 （A）使用球形探针在刚性基底上的软样品进行原子力显微镜微压痕的示意图（经Dimitriadis E. 等人许可转载自2002年《生物物理杂志》8）。 （B）在PBS中从洁净的玻璃载片上采集的典型力-位移曲线，用于确定悬臂梁偏转灵敏度。 （C）从软性（蓝色）和刚性（红色）样品采集的典型力-位移曲线，显示了对应于（A）中的相关参数。
4. 典型结果：
图2A显示了在PBS中贴附于聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上的肺实质条带，原子力显微镜探针已定位在目标区域正上方，准备进行微压痕成像。图2B显示，在切片和染色操作得当的组织中，肺实质的肺泡微结构得以良好保存，通过针对基底膜组分层粘连蛋白的免疫荧光染色（无需固定或通透处理）可观察到该结构。图2C-D显示了从先前经PBS处理（图2C）或经博来霉素处理以诱导纤维化10的小鼠中获取的新鲜未固定肺组织中I型胶原的免疫荧光染色结果。
图3A展示了通过原子力显微镜微压痕（AFM microindentation）获得的典型力-位移曲线示例。在施加相同作用力的情况下，AFM探针在较软区域会产生较大的压入深度（蓝色曲线），从而形成相对“平坦”的力-位移曲线；而在较硬区域则产生较小的压入深度，对应“陡峭”的力-位移曲线（红色曲线）。为了获得清晰的力曲线，每次压痕后，AFM探针必须完全从样品表面回撤，并确保无任何接触，方可进行下一次压痕。这种无接触状态对应于图3A中曲线的平坦区域，此时探针移动但悬臂无偏转。图3B展示了一条典型的异常曲线，其缺少平坦区域，通常发生在探针未完全脱离样品表面时（例如软样品粘附在探针上），导致无法确定接触点。若探针完全陷入软样品中，曲线可能如图3C所示，无明显偏转信号，仅存在微小噪声。
图4显示了从力-位移曲线中提取的剪切模量数据，并以刚度图（弹性图）的形式进行空间展示，其中颜色深浅与剪切模量成正比。弹性图清晰地展示了正常（图4A）与纤维化（图4B）肺实质组织在剪切模量范围和分布上的显著差异，尤其在纤维化肺样本中表现出较大的空间异质性。
<img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig2.jpg" alt="细胞结构显微观察；相差显微镜与荧光显微镜；细胞形态学分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. （A）相差显微图像显示原子力显微镜探针位于小鼠肺实质条上方。比例尺，50 μm。（B）正常小鼠肺组织中层粘连蛋白的免疫染色，显示正常肺实质的肺泡微结构。白色框标示典型的 80×80 μm 弹性图区域。比例尺：20 μm。（C 和 D）经生理盐水（C）和博来霉素（D）处理的小鼠肺实质中Ⅰ型胶原的免疫染色。比例尺：100 μm。
<img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig3.jpg" alt="力-位移图、弹性测量、挠度图、生物力学分析" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. （A）分别从生理盐水处理（蓝色）和博来霉素处理（红色）的小鼠肺实质组织获得的具有代表性的可解析力-位移曲线。黑色线条为基于球形赫兹模型拟合的最佳曲线，并标注了相应计算得到的杨氏模量值。（B, C）具有代表性的不可解析力-位移曲线。
<img src="/files/ftp_upload/2911/2911fig4.jpg" alt="压力分布热图，kPa，颜色标尺，比较，示意图，研究中的数据分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 从小鼠肺实质采集的代表性弹性图，分别来自生理盐水处理（A）和博来霉素处理（B）。颜色条表示剪切模量，单位为千帕（kPa）。坐标轴标签表示空间尺度，单位为微米（μm）。比例尺：20 μm

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</ol>

无利益冲突声明。

利用原子力显微镜（AFM）微压痕技术对肺组织进行力学表征，可实现前所未有的空间分辨率（图4），为组织刚度在微米尺度上的变化提供了独特的观察视角。以该技术的应用为例，以往在正常和纤维化肺组织条带上进行的大尺度测量表明，纤维化导致弹性阻力大约增加2-3倍11,12。相比之下，AFM微压痕技术揭示组织硬化具有高度局部性，某些区域的剪切模量可高达正常肺组织中位值的约30倍10。鉴于基质刚度已被证实对细胞功能具有关键影响，这些局部力学参数为提升肺细胞体外培养研究的生物保真度提供了极为宝贵的依据。
使用肺组织薄条时会出现若干实际问题。组织条的表面并非完全平坦，其轮廓会跟随下方肺泡的结构而变化。当样品表面高度变化小于15 μm时，原子力显微镜（AFM）系统会在压痕过程中自动调节探针在Z方向的位置，以帮助克服这一挑战。测量在室温下进行，而非37°C，因此无法评估由此温度差异引起的力学性质变化，尽管预计这种影响较小。当前的光学显微镜设置难以确定底层肺泡壁结构对所观察到的力学性质的影响。例如，理想情况下应能判断在沿肺泡壁平面方向或垂直于该平面的方向进行压痕时，肺泡壁是否表现出各向异性及不同的力学特性。然而，目前的样本较厚，且成像系统不具备三维成像能力，因此无法确定每个接触点处局部肺泡壁的取向。最后，细胞成分对所测得的力学性质的影响仍有待进一步阐明。在本文详述的方法中，并未特别去除组织中的细胞成分。但由于组织获取后经过的时间以及为暴露肺泡而必须切割组织，可用于压痕的表面细胞很可能已失去活性。因此，开展专门实验以去除细胞，或用活细胞重新接种基质，并评估由此引起的组织刚度变化，似乎是必要的。
由于这些测量需要使用新鲜的未固定组织，因此应尽量缩短从组织取材到测量之间的时间，并将样品储存在 4 °C 以避免机械性能发生变化。在洗涤或染色过程中，当组织条在容器之间转移时，应特别注意，尽量减少形变或损伤。对于在液体中进行的原子力显微镜（AFM）应用，一个关键步骤是将组织切割得尽可能平整，并将样品固定在支撑盖玻片上。如有条件，可使用自动切片机（如振动切片机或组织切片机）来制备厚度高度均一的切片。组织条应在AFM测量前立即固定，并尽量缩短AFM测量时间，因为样品最终会从盖玻片上脱落。一个有用的经验是，较大的组织条似乎比小的组织条更稳定地附着在盖玻片上，并且在磷酸盐缓冲液（PBS）中能保持更长时间的固定状态。
当使用标准的 0.06 N/m 悬臂梁和直径为 5 μm 的球形探针时，原子力显微镜（AFM）微压痕技术可用于表征剪切模量范围在 100 Pa 至 50 kPa 之间的样品。通过使用具有不同弹簧常数的探针，该范围可进一步扩展；市面上可购得带有直径范围为 0.6 至 12 μm 的球形玻璃探针、弹簧常数范围为 0.01 至 0.58 N/m 的 AFM 探针（例如 Novascan），并被广泛使用3。使用 5 μm 球形探针时，在 400–700 nm 压入深度下，探针与组织之间的理论接触面积约为 5–9 μm2（图 1A）。可通过使用更小或更大的探针来实现更高或更低的空间分辨率。此外，四面体探针也已被用于 AFM 微压痕实验13-16，其可提供更小的接触面积，从而在映射中提高空间分辨率，但该探针几何形状的数据拟合更为复杂。
该方法存在若干局限性，需加以说明。传统上，肺组织通常通过无创方式对其进行力学表征，例如采用压力-容积分析17或对完整肺组织进行冲孔压痕测试19,20。而诸如本文所述的侵入性方法，则会因失去充气肺内正常存在的气-液界面以及呼吸肌松弛时维持肺部分膨胀的预应力，从而在重要方面改变肺的结构。这些局限性普遍存在于所有肺组织条带的测量中18。然而值得注意的是，正常肺实质测得的中位刚度（剪切模量约0.5 kPa）与在静息容积下通过对完整肺组织进行冲孔压痕所估算的结果并无显著差异19,20。尽管已知肺组织在变形增加时表现出非线性硬化特性，但目前尚无法严格验证该特性是否在微米尺度下依然存在，而本研究所采用的方法无法实现此类验证。赫兹（Hertz）模型假设样品具有均质性，但大多数生物材料（包括肺实质）在空间尺度减小时异质性逐渐增强。样品的异质性可能导致诸如杨氏模量随压痕深度变化的人为假象，即模量值取决于发生变形的组织层或组分。在xy平面内的异质性可通过根据生物材料的微结构谨慎选择合适的球形探针尺寸来加以限制，如Dimitriadis EK et al.8所提出的方法。然而，由于材料在z方向上的异质性所导致的赫兹模型误差则更难预测或校正。Azeloglu等人最近提出了一种混合计算模型，用于表征含有离散嵌入相的异质基底的弹性特性21。这一新技术为计算异质材料中嵌入相的力学性质提供了可能途径，有望克服赫兹分析的局限性。
赫兹模型还假设材料具有完全的弹性行为，而生物材料通常表现出与时间相关的黏弹性行为。通过改变压痕速度，可以获得组织的完整黏弹性特征。重要的是，先前对正常和纤维化肺组织的宏观力学测试表明，肺组织的力学特性对频率的依赖性较弱，并且在所有测试频率下，正常组织与纤维化组织之间的力学特性差异均得以保留11。这些发现强烈提示，使用原子力显微镜（AFM）在单一压痕速度下测量力学特性，能够捕捉到伴随纤维化发生的组织力学性质变化的关键方面。
本研究中使用的肺组织泊松比为0.4，该数值来源于宏观测量9。遗憾的是，目前文献中尚无关于微尺度下肺组织的泊松比，以及在疾病状态下其可能变化的数据。当泊松比未知时，可采用AFM微压痕法计算并报告E、E/(1-υ2)或(1-υ2)/πE（记为弹性常数k）作为替代参数22。由于大多数生物材料含水量较高，其泊松比通常在0.4至0.5之间。在0.3至0.5的范围内，因子1/(1-υ2)仅在1.10至1.33之间变化，因此泊松比的合理变动对所报告的模量影响较小。我们所报告的纤维化组织相对于正常组织剪切模量的增加幅度达数倍之多，表明由泊松比变化引起的误差与所观察到的力学性能变化相比可忽略不计。
用于分析力-位移数据的实际算法和代码取决于具体的应用条件以及力-位移曲线不同群体的后续特征。如果需要更复杂的分析，可参考Lin等人的工作23。作者将一系列协同策略整合成一种算法，克服了以往在实现压痕数据赫兹模型自动拟合过程中遇到的诸多难题。
该方法尚有多个其他领域可供进一步开发和利用。在无需抗体标记而仅需观察肺泡壁的情况下，可通过弹性蛋白和胶原蛋白在绿色光谱范围内的自发荧光信号对其进行成像。另一方面，通过使用更薄的组织切片、三维成像技术或二者结合，有望实现更优的成像效果，从而增强组织结构与潜在力学特性之间的关联分析能力。尽管现有方法已可对胶原蛋白和层粘连蛋白等细胞外基质成分进行染色和可视化，但未来可进一步致力于对细胞表面标志物进行染色，以识别特定细胞群体，并表征这些细胞群体周围所处的力学微环境。或者，也可从表达荧光标记谱系标志物或细胞特异性蛋白的小鼠中获取组织，以实现相同目标。最后，本文详述的方法似乎非常适用于表征肺部其他解剖结构，例如在肺动脉高压中发生重塑的血管，以及在哮喘中发生重塑的气道。鉴于该方法目前的发展状态及其进一步优化的潜力，原子力显微镜微压痕技术（AFM microindentation）有望为揭示肺部疾病进展过程中组织刚度的变化提供重要见解，并无疑将在表征多种其他软组织刚度的时空变化方面发挥重要价值。

<table><tbody><tr><td>原子力显微镜探针</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td>PT.GS</td><td>5 微米硼硅酸盐微球，0.06 N/m</td></tr><tr><td>多聚-L-赖氨酸盖玻片</td><td>VWR international</td><td>354085</td><td>BD BioCoat 12 mm 圆形 No.1 玻璃</td></tr><tr><td>低凝胶温度琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>兔抗胶原蛋白 I 抗体（Rb pAb）</td><td>Abcam</td><td>ab34710-100</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 山羊抗兔抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>兔抗层粘连蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr></tbody></table>

利用原子力显微镜对肺组织进行微机械特性表征

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

基质刚度显著影响黏附性细胞的生长、分化和功能1-3。在宏观尺度上，人体内组织和器官的刚度跨越多个数量级4。然而，关于刚度在组织内部如何空间分布，以及在导致组织重塑的疾病过程中刚度变化的范围和空间尺度，目前所知甚少。为了更好地理解基质刚度的变化如何影响细胞在健康与疾病状态下的生理功能，亟需在与定居细胞相关的空间尺度上测量组织刚度。这一点对于肺组织尤为关键，肺是一种高度顺应性和弹性的组织，其基质重塑是哮喘、肺气肿、高血压和纤维化等疾病中的显著特征。为了在与定居细胞相关的空间尺度上表征肺实质的局部力学环境，我们已开发出利用原子力显微镜（AFM）微压痕技术直接测量新鲜小鼠肺组织局部弹性特性的方法。通过合理选择AFM压头、悬臂梁和压入深度，该方法可在进行相位对比和荧光成像目标区域的同时，平行测量局部组织的剪切模量。对组织条带进行系统性取样，可获得组织力学特性的图谱，揭示剪切模量的局部空间变异。力学特性与潜在解剖及病理特征之间的相关性，阐明了在纤维化过程中刚度如何随基质沉积而变化。这些方法可推广至其他软组织和疾病过程，以揭示局部组织力学特性在空间分布和疾病进展中的变化规律。

细胞外基质的刚度显著影响黏附细胞的多种行为。基质刚度在组织内存在空间上的差异，并在多种疾病状态下发生改变。本文中，我们建立了利用原子力显微镜微压痕技术来表征正常及纤维化小鼠肺组织中刚度空间变化的方法。

基质刚度强烈影响黏附细胞的生长、分化和功能1-3。在宏观尺度上，组织和器官的刚度……

以下实验的总体目标是通过使用原子力显微镜微压痕技术直接测量新鲜小鼠肺组织的局部弹性特性，从而在与定居细胞相关的空间尺度上表征肺实质的局部力学环境。该目标通过以下步骤实现：使用刀片或手术刀将琼脂糖灌注膨胀的小鼠肺组织切割，制备长宽各5毫米、厚度为400微米的肺实质条状样本。随后对未经固定和透化的肺组织条进行免疫染色，以识别原子力显微镜微压痕分析所需的感兴趣区域。然后在室温下于 PBS 中对组织条进行原子力显微镜微压痕（FM microindentation）操作，以直接测量新鲜肺组织的局部弹性特性并获得结果。结果显示，正常与纤维化肺实质在组织硬度的范围和分布上存在显著差异，且硬度具有较大的空间变异性，尤其在纤维化肺组织样本中更为明显。基于使用FM微压痕技术获得的强制位移曲线提取的刚度图谱。与现有的组织条带拉伸等测量方法相比，该技术的主要优势在于其提供了前所未有的空间分辨率，从而能够独特地揭示组织刚度在微尺度上的变化。该测量方法有助于回答一些关键科学问题，例如组织内刚度如何在空间上分布，以及在疾病过程中刚度变化的范围和空间尺度是什么。导致组织重塑的过程，首先需要制备肺组织条带，开始时通过向离体小鼠肺部注入温热的、浓度为2%的低凝胶点琼脂糖（在PBS中配制）以每公斤体重50毫升的剂量经气管注入，结扎气管后，将充气的肺置于4摄氏度的PBS浴中冷却60分钟，使肺结构得到固定。琼脂糖将在气道腔隙中发生凝胶化并硬化，从而轻柔地稳定肺组织结构。在此期间，使用剃刀或手术刀将琼脂糖固定的肺组织切成长约5毫米、宽约5毫米、厚约400微米的组织条带。随后在 37 摄氏度的 PBS 中洗涤组织条 5 分钟，以去除残留的 aros，排除大气道和大血管。若需成像大气道和大血管，则从靠近主支气管的肺组织区域切割组织条；若需进行原子力显微镜（AFM）微压痕分析以分离感兴趣区域，则从远离主支气管的胸膜下区域切割组织条。通过相差显微镜或免疫染色对组织进行观察，并通过荧光显微镜进行荧光成像。请参见本方案的文字部分以了解具体操作步骤。在进行荧光显微镜表征之前，立即将组织条段附着于聚-L-赖氨酸包被的15毫米盖玻片上：从漂浮组织下方将盖玻片抬起，确保组织条段均匀铺展在盖玻片表面。如有必要，可用第二片洁净未包被的盖玻片与之夹合，并施加轻微压力，以促进组织条段与聚-L-赖氨酸包被盖玻片的黏附。每次进行微压痕实验前，立即按照制造商的说明校准原子力显微镜（AFM）系统。为此，需确定两个关键参数：使用空气中的热波动法测定悬臂梁的弹簧常数，以及测定悬臂梁偏转灵敏度，后者是用于将光电二极管输出信号换算为实际悬臂梁偏转距离的参数。通过在洁净的玻璃片上的 PBS 中获取标准的强制位移曲线来校准挠度灵敏度。然后计算强制位移曲线测量中强制位移曲线的斜率。在单一位置处，AFM 针尖向样品表面推进并随后撤回，同时监测悬臂挠度 delta D 随针尖位移 delta Z 的变化。建议使用氮化硅三角形悬臂，其末端带有直径为 5 µm 的硼硅酸盐球形针尖，AFM 探针的弹簧常数为 0.06 N/m。我们已对剪切模量范围为100至50,000帕斯卡的软材料进行了力学表征。用纸巾擦拭样品盖玻片的底面，然后用真空脂将其固定在标准载玻片上。将载玻片安装到原子力显微镜样品台，并用500微升室温磷酸盐缓冲液覆盖组织。然后将原子力显微镜扫描头置于样品上方。调节显微镜载物台，使目镜观察时原子力显微镜针尖位于视野中心。移动原子力显微镜样品台，选择组织上感兴趣的区域。然后切换至CCD相机观察，根据需要记录组织的相差图像和/或荧光图像。缓慢向下移动原子力显微镜（AFM）针尖，直至其准确接触样品。对软样品进行AFM微压痕表征时，需采用较小的压痕深度，以避免产生较大的局部应变，从而防止破坏用于弹性模量计算的赫兹（Hertz）模型。为避免大应变，应通过将悬臂最大偏转设为500纳米，以触发模式进行压痕操作。该偏转限值将最大压痕力限制在 30 纳牛以内。压痕速度应选择得足够慢，以探究软样品的弹性而非黏弹性特性。对于肺组织，在感兴趣区域进行单次测量时，应选择每秒 2 至 20 微米的速度范围。将原子力显微镜探针移动至目标位置，并进行单次压痕以采集标准的力-位移曲线。探针仅在Z方向移动。如需对目标区域进行自动映射，请切换至力图模式，选择扫描尺寸及选定区域内的采样点。原子力显微镜探针在压痕运动之间在样品表面进行扫描，并在预定义的样品网格内每个点采集单独的力-位移曲线。我们发现，使用16×16的样品网格来映射80微米×80微米的区域是较为可行的，压痕速率为每秒20微米，整个过程约需10分钟。为计算杨氏模量，可采用最小二乘法非线性曲线拟合，将力-位移曲线拟合至赫兹球形压痕模型，如公式所示：F等于K下标C乘以δD，其中F为使悬臂弯曲的力。K sub C 为悬臂梁的弹簧常数。R 为球形探针尖端半径，δ = δZ - δD 表示压痕深度，ν 为样品的泊松比，对于肺组织其值为 0.4。为评估拟合质量，需在非线性曲线拟合过程中计算 SSR 值，即数据值与拟合值之差的平方和。通过舍弃 SSR 值较大的无效曲线数据，剔除不可靠或无法解释的测量结果。如有需要，可根据关系式 E = 2(1 + ν)G 将弹性模量（E）转换为剪切模量（G）。为可视化力图模式下采集的刚度空间分布，可绘制模量数据及等高线图，例如覆盖 80 微米 × 80 微米区域的 16 × 16 网格图。为了处理大量力-曲线数据，可编写自定义算法，以自动拟合力-位移曲线、提取模量，或绘制轮廓图或ELA图。采用上述相同步骤和参数，本图显示组织被正确切割并染色。通过免疫荧光染色检测基底膜组分层粘连蛋白，可观察到肺实质的肺泡微结构在未固定和未透化的条件下得到了良好保存。这些图板显示了对胶原蛋白的免疫荧光染色结果，样本来自先前用 PBS 或博来霉素处理以诱导纤维化的小鼠的新鲜未固定肺组织。此处展示了在相同施加力条件下通过原子力显微镜微压痕实验获得的力-位移曲线。原子力显微镜探针在较软区域产生较大的压痕，形成相对平缓的蓝色力-位移曲线；而在较硬区域则产生较小压痕，对应陡峭的红色力-位移曲线。为了在每次压痕后获得清晰的力曲线，原子力显微镜（AFM）针尖必须从样品表面完全回缩，并在下一次压痕前处于无接触状态。这种无接触状态对应于曲线中的平坦区域，即针尖移动但悬臂无偏转的阶段。本图显示了一条典型的错误曲线，其缺少平坦区域，这种情况通常发生在针尖未从样品表面完全回缩时，例如当柔软样品粘附在针尖上，导致针尖完全陷入软样品中，从而无法确定接触点。该曲线可能看起来没有明显的偏转，但存在微小噪声。此图显示的是刚度。从强制位移曲线中提取的数据以空间分布的形式呈现为刚度图谱，称为ELAs移植图，其中颜色深浅对应刚度大小。ELAs移植图清晰地展示了正常与纤维化肺实质组织在刚度范围和分布上的显著差异，以及刚度在空间上的巨大变化，尤其是在纤维化肺样本中更为明显。观看本视频后，您应能够很好地理解如何通过使用原子力显微镜直接测量新鲜肺组织的局部弹性特性，来表征肺实质的局部力学环境。

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生物学

微型机械的肺组织利用原子力显微镜表征

来源：Canovic, E. P., et al. 利用原子力显微镜、冲击压痕和流变学表征脑组织的多尺度力学特性。J. Vis. Exp.

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