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 JoVE Biology

रोकनेवाला प्रयोगशाला तकनीक: चढ़ाना तरीके

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1Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

Article
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    Summary

    जब मीडिया और संस्कृति सूक्ष्मजीवों के लिए इस्तेमाल किया अभिकर्मकों के साथ काम कर रहे हैं, सड़न रोकनेवाला तकनीक संदूषण है कम से कम करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए अभ्यास किया जाना चाहिए. चढ़ाना तरीकों में से एक किस्म को नियमित करने के लिए अलग, प्रचार, या गिनना बैक्टीरिया और फेज, जिनमें से सभी प्रक्रियाओं है कि प्रयोगात्मक सामग्री की बाँझपन बनाए रखने को शामिल किया जाता है.

    Date Published: 5/11/2012, Issue 63; doi: 10.3791/3064

    Cite this Article

    Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. J. Vis. Exp. (63), e3064, doi:10.3791/3064 (2012).

    Protocol

    1. एक सुरक्षित और बाँझ कार्यस्थान तैयार

    1. सभी प्रयोगशाला नियमों और सुरक्षा सावधानियों जब सूक्ष्मजीवों के साथ काम लिया जा के साथ परिचित हो. Biohazard वर्गीकरण के बावजूद, सभी सामग्री है कि सूक्ष्मजीवों के साथ संपर्क में आते हैं संक्रामक अपशिष्ट माना जाता है और निपटान करने के लिए पहले decontaminated किया जाना चाहिए. संस्थागत पर्यावरण, स्वास्थ्य और सुरक्षा विभाग द्वारा प्रदान की जाती है, उन संभावित दूषित सामग्री की तत्काल और उचित निपटान (biohazards) के लिए उपयुक्त बर्बाद receptacles की स्थापना के साथ अनुसार सुरक्षा निर्देशों का पालन करें.
    2. सभी उपकरणों, समाधान, और उन्हें चढ़ाना प्रक्रियाओं के लिए उपयोग करने से पहले मीडिया जीवाणुरहित.
    3. दूर साफ़ सभी प्रयोगशाला बेंच पर अपने कार्य क्षेत्र cluttering सामग्री.
    4. निस्संक्रामक के साथ संभव संदूषण को कम करने के लिए कार्य क्षेत्र को साफ करने के लिए.
    5. एक लैम्प बर्नर सेट और धीरे धीरे काम करते हैं, ध्यान से, और जानबूझकर बाँझ क्षेत्र updra द्वारा निर्मित क्षेत्र के भीतरलौ के फुट.
      • यदि BSL-2 जीवों के साथ काम कर रहा है, एक जैवसुरक्षा कैबिनेट में अपने काम की जगह निर्धारित किया है. एक लैम्प बर्नर कैबिनेट के अंदर नहीं किया क्योंकि लौ से गर्मी हवा का प्रवाह बाधित अपनी कार्यक्षमता के लिए आवश्यक हो सकता है.
    6. बाँझ क्षेत्र के पास प्रयोगशाला बेंच पर प्रक्रिया के लिए सभी आवश्यक आपूर्ति व्यवस्थित. सुनिश्चित करें कि सभी सामग्री को ठीक से लेबल कर रहे हैं. आयोजन काम करने के लिए काम की क्षमता को अधिकतम करने के लिए और अनावश्यक आंदोलनों से बचने क्षेत्र हवाई contaminants के लिए प्रयोगात्मक सामग्री के समय जोखिम को कम कर देंगे.
      • Bunsen बर्नर अपने अधिकार के लिए बेंच पर जगह.
      • प्लेस अगर प्लेटें अपनी बाईं करने के लिए या पेट्री डिश.
      • व्यवस्था सेल संस्कृतियों, ट्यूब, बोतल और पीठ के केंद्र में बोतलें.
      • ढीला ट्यूब, बोतल, और बोतलों की टोपियां ताकि वे आसानी से बाद जोड़तोड़ के दौरान किया जा सकता है एक हाथ से खोला.
    7. एंटीसेप्टिक साबुन और गर्मजोशी के साथ हाथ अच्छी तरह धोसूक्ष्मजीवों को संभालने से पहले पानी.

    2. स्ट्रीक प्लेट प्रक्रिया: बैक्टीरियल क्वाड्रांट विधि का उपयोग कर कालोनियों के अलगाव

    लकीर प्लेट प्रक्रिया सरल यांत्रिक जुदाई से मिश्रित आबादी से बैक्टीरिया का शुद्ध संस्कृतियों, या कालोनियों को अलग करने के लिए बनाया गया है. एकल कालोनियों या एक अगर प्लेट के भीतर (1 चित्रा) एक क्लस्टर में बढ़ कोशिकाओं के लाखों लोगों के शामिल हैं. एक कॉलोनी, एक एकल कक्ष के विपरीत, नग्न आंखों को दिखाई है. सिद्धांत रूप में, एक कॉलोनी में सभी कोशिकाओं को शुरू में एक एकल थाली पर जमा जीवाणु से प्राप्त कर रहे हैं और इस तरह एक क्लोन, या आनुवंशिक समान कोशिकाओं के समूह के रूप में करने के लिए भेजा जाता है.

    • जीवाणु आकृति और आकार के एक किस्म में मौजूद हैं. उदाहरण के लिए, व्यक्तिगत Escherichia कोलाई कोशिकाओं 2 सुक्ष्ममापी और 0.5 सुक्ष्ममापी की चौड़ाई के एक औसत लंबाई के साथ छड़ी के आकार के हैं जबकि स्ट्रैपटोकोकस कोशिकाओं 1 सुक्ष्ममापी की एक औसत व्यास के साथ गोलाकार हैं. कुछ बैक्टीरिया (सुई. के रूप में चर्चा ) कोलाई एकल कक्षों के रूप में मौजूद हैं जबकि दूसरों को संघ के विशिष्ट पैटर्न के रूप में, उदाहरण के लिए, स्ट्रैपटोकोकस जोड़े या फार्म चेन या कोशिकाओं के समूहों में वृद्धि. आमतौर पर यह माना जाता है कि एक ही कॉलोनी में एक एकल द्वियंगी विखंडन के दौर से गुजर सेल से उठता है, लेकिन, इस धारणा उन बैक्टीरिया है कि स्वाभाविक रूप से जोड़े, चेन, या समूहों या अन्य तंत्र है कि इस विभाजन के रूप में मौजूद है के लिए सच नहीं है. वैकल्पिक रूप से, अगर बहुत सारे बैक्टीरिया चढ़ाया जाता है, तो कोशिकाओं के ओवरलैप हो सकता है और क्या करने के लिए एक एकल कॉलोनी प्रतीत होता है को जन्म देने के दो या दो से अधिक जीवाणुओं की संभावना में वृद्धि हो सकती है. इन जटिलताओं से बचने के लिए जब वर्णन या enumerating बैक्टीरियल एक ठोस माध्यम पर बढ़ती संस्कृतियों, कालोनियों कॉलोनी के गठन इकाइयों (CFU) के रूप में भेजा जाता है.

    लकीर प्लेट प्रक्रिया के साथ कोशिकाओं के एक मिश्रण एक पेट्री डिश में है कि इस तरह के बैक्टीरिया और कम से कम एक अर्द्ध ठोस, अगर आधारित पोषक माध्यम की सतह पर फैल रहा हैकोशिकाओं के माध्यम की सतह पर व्यापक रूप से अलग बिंदुओं पर जमा कर रहे हैं और, ऊष्मायन के बाद, कालोनियों में विकसित. वृत्त का चतुर्थ भाग विधि कोशिकाओं का एक मिश्रण से एकल कालोनियों को अलग करने के लिए यहाँ वर्णित किया जाएगा.

    1. स्ट्रीक चढ़ाना विभिन्न उपकरणों की संख्या (2 चित्रा) के साथ पूरा किया जा सकता है. एक धातु पाश कई बार किया जा सकता है फिर से इस्तेमाल किया और लकीर चढ़ाना नियमित प्रयोगशाला उपभेदों के लिए उपयोग किया है. डिस्पोजेबल प्लास्टिक loops व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और और आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं जब एक जैवसुरक्षा कैबिनेट में BSL-2 उपभेदों के साथ काम कर रहा है. कई शोध वैज्ञानिकों लकीर चढ़ाना के लिए प्रयोज्य, पूर्व निष्फल लकड़िया या फ्लैट toothpicks का उपयोग पसंद करते हैं. इन डिस्पोजेबल प्लास्टिक loops के लिए एक सस्ता विकल्प है और विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब मिट्टी के रूप में इस तरह के एक पर्यावरण नमूना है कि संभावना बीजाणु के गठन बैक्टीरिया होते हैं के साथ काम कर सकते हैं.
      • डिस्पोजेबल पूर्व निष्फल लाठी और toothpicks लैम्प बर्नर गुरु के साथ की जरूरत नहीं flamedबीजाणु के गठन बैक्टीरिया और प्रयोगशाला सतहों spores के साथ या अगर प्लेटों के पार संदूषण की अनावश्यक aerosolization रोकने.
    2. कम से कम अपना नाम, तारीख, मध्यम विकास के प्रकार, और जीव के प्रकार के माध्यम पर चढ़ाया जा के साथ एक अगर प्लेट के नीचे नहीं है (ढक्कन) के किनारे के आसपास लेबल.
      • प्लेटें ढक्कन और कमरे के तापमान पर लकीर चढ़ाना करने से पहले पूर्व गर्म पर संक्षेपण के बिना पूरी तरह से सूखा होना चाहिए. यदि प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है, उन्हें कई घंटे या पहले भी दिन हटा दें. कोई 2-3 से अधिक प्लेटों के छोटे, कंपित ढेर में उन्हें बाहर फैल और उन्हें शुष्क करने की अनुमति.
    3. नमूना से जो लकीर प्लेट inoculated किया जाएगा या तो शोरबा में कोशिकाओं के निलंबन या एक और अगर थाली से एक मौजूदा कॉलोनी हो सकता है. शुरू करने के लिए, यह सिफारिश की है कि केवल एक नमूने के लिए एक ही थाली टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा. समय और सामग्री को बचाने के लिए, एक एकल थाली कई samp के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैles लेकिन केवल एक बार आप एक थाली पर एक नमूना streaking में कुशल हो जाते हैं.
    4. वृत्त का चतुर्थ भाग के लिए 1, नमूना उठाया है और (3 चित्रा एक पैनल) एक तेजी से, चिकनी, पीछे और आगे गति का उपयोग करते हुए मध्यम की सतह के एक चौथाई के बारे में फैल. बेंच से एक औंधा प्लेट के नीचे आधा लिफ्ट. पाश, छड़ी, या दन्तखुदनी आगे और पीछे ले कई बार अगर सतह भर में रिम ​​से थाली के केन्द्र.
      • यदि inoculum एक सेल निलंबन है, एक धातु या एक micropipettor के साथ 5 से 10 μl पाश के साथ एक loopful प्राप्त. ज़ुल्फ़ या भंवर चढ़ाना के लिए एक नि: शेष भाजक हटाने से पहले सेल निलंबन के लिए सुनिश्चित करें. सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करते हुए इस कदम प्रदर्शन, पहले और inoculum हटाने के बाद न केवल पाश लेकिन यह भी बोतल या ट्यूब के रिम ज्वलंत. इसके अलावा, ट्यूब या बोतल के पक्ष पाश या micropipettor के साथ बैरल पर नहीं टिकते. अगर inoculum pipetting, approp पर सेल निलंबन बांटनाथाली पर जगह riate तो एक पाश छड़ी, या दन्तखुदनी का उपयोग करने के लिए यह थाली का पहला वृत्त का चतुर्थ भाग पर फैल.
      • यदि inoculum अन्य प्लेट से एक कॉलोनी है, धीरे पाश के साथ कॉलोनी को छूने, छड़ी या दन्तखुदनी तो यह थाली के पहले वृत्त का चतुर्थ भाग में फैला है. सुनिश्चित करें कि धातु पाश कॉलोनी को छूने से पहले ठंडा किया जाता है. यह सुनिश्चित करने के लिए पाश बहुत गर्म नहीं है, इसे हल्के ढंग से छू अगर प्लेट पर एक नामित क्षेत्र है जहाँ कोई streaking घटित होगा. केवल कुछ कोशिकाओं, पूरी कॉलोनी कॉलोनी से नहीं की जरूरत है.
      • यदि एक धातु पाश का उपयोग कर, यह लौ प्लेट (3 चित्रा पैनल बी) के लिए inoculum प्राप्त करने से पहले एक लैम्प बर्नर का उपयोग कर. पाश से 3-4 इंच के बारे में नीले कोन, लौ के सबसे भाग की टिप में तार के साथ शुरू करो. धातु लाल गर्म हो जाना चाहिए. तार ले जाएँ तो लौ पाश दृष्टिकोण. इस हेरफेर पिछले उपयोग से पाश पर छोड़ा बैक्टीरिया के aerosolization रोकता है.
      • ज्वलंत मारता(हालांकि नहीं spores) और गर्म हवा से बैक्टीरिया संवहन धाराओं बाद जोड़तोड़ के दौरान धातु के तार पर बसने से अन्य हवाई contaminants को रोकने के लिए.
      • एक बाँझ फ्लैट दन्तखुदनी का उपयोग अगर, संकीर्ण अंत धीरे अपने अंगूठे और अनामिका के बीच एक 10 से 20 ° मध्यम कोण पर पकड़ है, और quadrants लकीर के व्यापक अंत का उपयोग करें. एक पाश या लकड़ी की छड़ी का उपयोग अगर, यह उसी कोण पर एक पेंसिल की तरह पकड़. अगर में कि पाश, छड़ी, या दन्तखुदनी खोदता प्रेस मत करो इतनी मेहनत.
    5. पलटना 1 वृत्त का चतुर्थ भाग को पूरा करने के बाद, और नीचे बेंच पर थाली ढक्कन में वापस सेट. छड़ी या दन्तखुदनी या फिर से लौ धातु पाश निपटाने # 4 कदम में वर्णित के रूप में.
    6. पेट्री डिश 90 2 वृत्त का चतुर्थ भाग लकीर ° मुड़ें. बेंच से एक औंधा प्लेट के नीचे आधा लिफ्ट तो पाश, छड़ी, या पिछले लकीर के अंत के पास पहला वृत्त का चतुर्थ भाग दन्तखुदनी छुओ. पीछे और आगे पैटर्न का प्रयोग, लास क्रॉस ओवरपहले चक्र में धारियाँ टी आधे तो खाली 2 वृत्त का चतुर्थ भाग में स्थानांतरित. पलटना और नीचे ढक्कन में बेंच पर थाली वापस स्थापित एक बार 2 वृत्त का चतुर्थ भाग भरा है.
      • पाश, छड़ी या दन्तखुदनी पहली वृत्त का चतुर्थ भाग जहां मूल inoculum का सबसे जमा किया गया था धारियाँ की पहली छमाही में वापस कभी नहीं जाना चाहिए.
      • एक नया प्लास्टिक पाश, लकड़ी की छड़ी या दन्तखुदनी प्रत्येक वृत्त का चतुर्थ भाग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    7. तीसरे और चौथे quadrants के लिए कदम # दो बार 6 दोहराएँ.
      • छड़ी या दन्तखुदनी या फिर लौ प्रत्येक वृत्त का चतुर्थ भाग के बीच धातु पाश के निपटान सुनिश्चित.
      • 1 वृत्त का चतुर्थ भाग में जा रहा है जब 4 वृत्त का चतुर्थ भाग streaking से बचें.
    8. थाली उल्टा सेते इतना संक्षेपण है कि ढक्कन पर जम कालोनियों पर ड्रिप नहीं करता है.

    3. प्लेट प्रक्रिया डालो: एक मिश्रित नमूना में बैक्टीरियल कोशिकाओं के गणन

    इस विधि अक्सर का उपयोग करेंएक मिश्रित नमूना में सूक्ष्मजीवों की संख्या गिनती घ, जो एक पिघला हुआ अगर मध्यम अपने solidification से पहले करने के लिए जोड़ा है. समान रूप से ठोस माध्यम है जब उपयुक्त मन्दन नमूना चढ़ाया हुआ है भर में वितरित कालोनियों में प्रक्रिया का परिणाम है. इस तकनीक के लिए व्यवहार्य प्लेट मायने रखता है, जो अगर भीतर और अगर एक ही थाली पर सतह पर कॉलोनी के गठन इकाइयों की कुल संख्या इन्युमरेट प्रदर्शन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. व्यवहार्य प्लेट गिनती वैज्ञानिकों घटता उत्पन्न विकास, ट्यूब से जो नमूना चढ़ाया गया था में कोशिकाओं की एकाग्रता की गणना करने के लिए, और विभिन्न बैक्टीरियल सेल अस्तित्व या विकास दर पर या वातावरण के विकास की स्थिति के प्रभाव की जांच के लिए एक मानकीकृत साधन प्रदान करते हैं.

    1. एक बाँझ लेकिन कम से कम अपना नाम, तारीख, मध्यम विकास के प्रकार, और जीव के प्रकार पिघल अगर मध्यम जोड़ा जा के साथ खाली पेट्री डिश के नीचे नहीं है (ढक्कन) के किनारे के आसपास लेबल.
      • अगर बेनी कमजोर पड़ने कारक शामिलधारावाहिक, dilutions, या दोहराया dilutions, कक्षों की एकाग्रता में नमूने में एक व्यवस्थित कमी में जो परिणाम की एक श्रृंखला आईएनजी. धारावाहिक dilutions की तैयारी के लिए आवश्यक है, अगर नमूने में कोशिकाओं की संख्या अगर प्लेट, जो सांख्यिकीय महत्वपूर्ण रेंज 30 से 300 CFU की क्षमता से अधिक है. अगर वहाँ एक थाली पर 300 से अधिक CFU हैं, तो कालोनियों भीड़ और अतिव्यापी होगा.
    2. पिघल अगर माध्यम की 18 मिलीलीटर युक्त ट्यूब प्राप्त.
      • अगर मध्यम परीक्षण नलियों में समाप्त किया जाना चाहिए और पूर्व एक autoclave में निष्फल. उसी दिन यह एक प्रयोग के लिए आवश्यक है, अगर 30 मिनट के लिए फिर 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान को हस्तांतरित एक स्टीमर में पिघल जाना चाहिए. केवल अगर के रूप में ज्यादा के रूप में प्रयोग के लिए आवश्यक है, के रूप में यह हो सकता है नहीं फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है पिघल जाना चाहिए.
      • प्लेटों डालने का कार्य करने से पहले दस मिनट, ट्यूब पिघल अगर की एक गर्मी ब्लॉक 55 डिग्री सेल्सियस पानी से स्नान किया जाना चाहिए श्रम पर स्थानांतरितatory 48 पर सेट बेंच ° सी. एक बार अगर इस तापमान तक पहुँचता है, यह डाल करने के लिए तैयार है. यदि अगर बहुत गर्म है, नमूने में बैक्टीरिया को मार डाला जा सकता है. यदि अगर बहुत शांत है, एक बार जम ढेलेदार माध्यम हो सकता है.
    3. अपने नमूना प्राप्त करने के लिए, जो या तो एक शोरबा संस्कृति या बफर या खारा में एक कॉलोनी से मिश्रण कोशिकाओं द्वारा उत्पादित कोशिकाओं का एक निलंबन होना चाहिए.
      • नमूने एक नमूना के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला से प्राप्त किया जा सकता है.
      • मढ़वाया जा नमूना मात्रा 0.1 और 1.0 मिलीग्राम के बीच होना चाहिए.
    4. खाली पेट्री डिश के ढक्कन को खोलें और अपने नमूना प्लेट (पैनल चित्रा 4) के बीच में बांटना. ढक्कन बंद करें.
      • इस प्रक्रिया के दौरान सड़न रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग करें.
      • या तो एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक या micropipettor प्रयोग थाली करने के लिए अपने नमूना हस्तांतरण. नमूना के प्रवाह को नियंत्रित तो यह थाली के बाहर छप नहीं करता है.
    5. टब से टोपी निकालेंपिघल अगर की ई, और लैम्प बर्नर की लौ के माध्यम से खुले ट्यूब के रिम के पास.
    6. अपने नमूना युक्त पेट्री डिश के ढक्कन को खोलें और अगर ध्यान से (4 चित्रा पैनल बी) में डालना. ढक्कन बंद तो अगर साथ धीरे थाली घूमता द्वारा नमूना मिश्रण.
    7. अगर ऊष्मायन के लिए inverting थाली से पहले अच्छी तरह से जमना करने की अनुमति दें.

    4. फैलाओ प्लेट प्रक्रिया: प्लेट गिनता है, संवर्धन, चयन, या स्क्रीनिंग के लिए अलहदा बैक्टीरियल कालोनियों के गठन

    इस तकनीक को आम तौर पर अलग से एक छोटा सा नमूना मात्रा, जो एक अगर प्लेट की सतह पर फैल रहा है, अगर सतह भर में समान रूप से वितरित जब कोशिकाओं के उचित एकाग्रता चढ़ाया हुआ है असतत कालोनियों के गठन में जिसके परिणामस्वरूप के भीतर निहित सूक्ष्मजीवों के लिए प्रयोग किया जाता है. जो व्यवहार्य प्लेट की गिनती के लिए इस तकनीक का उपयोग करने के लिए इसके अलावा में कॉलोनी की कुल संख्या एक गाना पर इकाइयों के गठनले प्लेट enumerated और ट्यूब से जो नमूना चढ़ाया गया था में कोशिकाओं की एकाग्रता की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है, प्रसार चढ़ाना नियमित संवर्धन, चयन, और स्क्रीनिंग प्रयोगों में किया जाता है. इन तीन प्रयोगों के लिए वांछित परिणाम आम तौर पर प्लेट मायने रखता है, जो असतत कालोनियों के एक वितरण में अगर की सतह भर रूपों के लिए के रूप में एक ही है. हालांकि, लक्ष्य सुनिश्चित करने के लिए सभी व्यवहार्य कोशिकाओं कालोनियों फार्म नहीं है. इसके बजाय, केवल एक जनसंख्या के भीतर उन कोशिकाओं है कि एक विशेष जीनोटाइप हो जाना चाहिए. प्रसार प्लेट प्रक्रिया एक गणना के प्रयोग के लिए डाल थाली तकनीक पर नियोजित किया जा सकता है अगर अंत लक्ष्य के लिए आगे के विश्लेषण के लिए कालोनियों को अलग है क्योंकि कालोनियों अगर सतह पर accessibly हो जाना, जबकि वे डाल प्लेट प्रक्रिया के साथ अगर में एम्बेडेड हो.

    वहाँ दो प्रसार प्लेट प्रक्रिया के लिए यहाँ वर्णित रणनीतियों रहे हैं. 1 (विधि) के उपयोग के एक turntable और शीशे या धातु ro शामिलएक हॉकी स्टिक की तरह आकार का है. (विधि बी) 2, "Copacabana विधि" के रूप में जाना जाता है, मिलाते हुए पूर्व निष्फल ग्लास मनकों शामिल है. दोनों भी अगर सतह भर में कोशिकाओं के प्रसार की सुविधा.

    विधि: एक turntable और गिलास या धातु की छड़ के साथ फैलाओ चढ़ाना

    1. कम से कम अपना नाम, तारीख, मध्यम विकास के प्रकार, और जीव के प्रकार के माध्यम पर चढ़ाया जा के साथ एक अगर प्लेट के नीचे नहीं है (ढक्कन) के किनारे के आसपास लेबल.
      • अगर धारावाहिक dilutions चढ़ाना कमजोर पड़ने कारक शामिल हैं.
      • प्लेटें ढक्कन और कमरे के तापमान पर फैल चढ़ाना पहले पूर्व गर्म पर संक्षेपण के बिना पूरी तरह से सूखा होना चाहिए. यदि प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है, उन्हें कई घंटे या पहले भी दिन हटा दें. कोई 2-3 से अधिक प्लेटों के छोटे, कंपित ढेर में उन्हें बाहर फैल और उन्हें शुष्क करने की अनुमति.
    2. केंद्र turntable पर प्लेट (5 चित्रा).
    3. आप प्राप्तr नमूना है, जो एक शोरबा संस्कृति या बफर या खारा में एक कॉलोनी से मिश्रण कोशिकाओं द्वारा उत्पादित कोशिकाओं का एक निलंबन होना चाहिए.
      • नमूने एक नमूना के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला से प्राप्त किया जा सकता है.
      • मढ़वाया जा नमूना मात्रा 0.1 और 0.2 मिलीग्राम के बीच होना चाहिए.
    4. पेट्री डिश के ढक्कन खोलो, और अगर की केन्द्र पर अपनी नमूना बांटना. ढक्कन बंद करें.
      • इस प्रक्रिया के दौरान सड़न रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग करें.
      • थाली करने के लिए अपने नमूना हस्तांतरण एक micropipettor का प्रयोग करें. नमूना के प्रवाह को नियंत्रित तो यह थाली के बाहर छप नहीं करता है.
    5. गिलास छड़ी या धातु की छड़ (एक फैलानेवाला भी कहा जाता है) को 70% (v / v) इथेनॉल की एक बीकर में डुबकी.
      • चेतावनी: शराब की एक बीकर में एक गर्म स्प्रेडर कभी डुबकी.
      • इथेनॉल केवल स्प्रेडर के निचले हिस्से और तने की 1 इंच संपर्क करना चाहिए.
    6. नाली और यह एक बन्स की लौ से गुजर द्वारा अतिरिक्त इथेनॉल आग लगनाएन बर्नर.
      • लौ स्प्रेडर और स्टेम कि फिर जल्दी बुझाने इथेनॉल के साथ संपर्क में आया की लंबाई यात्रा करनी चाहिए.
      • इथेनॉल पकड़ आग की बीकर दहशत, नहीं करना चाहिए! बीकर पर एक कांच के कवर, जो जल्दी आग बुझाने होगा रखें.
    7. अगर प्लेट के ढक्कन खोलो, अपने बाएँ हाथ में अपने अंगूठे और तर्जनी के साथ ढक्कन धारण. अगर यह रिम के पास बढ़त के साथ छू द्वारा स्प्रेडर शांत.
      • जहां कोशिकाओं को जोड़ा गया था अगर नहीं छू. गर्म स्प्रेडर कोशिकाओं को मारने करेंगे.
    8. (जबकि अभी भी अगर प्लेट के ढक्कन धारण) अपने बाएँ हाथ के साथ, turntable धीरे स्पिन.
      • हालांकि सबसे अच्छा बचा है, यदि आप ढक्कन लगा नीचे जगह चाहिए, यह एक कीटाणुरहित सतह पर नीचे लैम्प बर्नर की बाँझ क्षेत्र के भीतर चेहरा. एक ढक्कन कि चेहरे के साथ, वहाँ वस्तुओं या हाथ के आंदोलनों से संदूषण का एक बड़ा मौका है, कारण है कि हवा धाराओं बनानेसूक्ष्मजीवों और धूल कणों ढक्कन के अंदर सतह के लिए उतर.
    9. अपने दाहिने हाथ के साथ, स्प्रेडर धीरे और अगर की सतह पर पकड़ धीरे - धीरे पूरी थाली पर नमूना समान रूप से फैला. स्प्रेडर थाली भर में आगे और पीछे के रूप में turntable कताई है हटो.
    10. नमूना अच्छी तरह से अवशोषित करने के लिए ऊष्मायन के लिए inverting थाली से पहले (कम से कम 5 मिनट) की अनुमति दें.

    विधि बी: कांच के मनकों के साथ फैलाओ चढ़ाना: "Copacabana विधि"

    1. कम से कम अपना नाम, तारीख, मध्यम विकास के प्रकार, और जीव के प्रकार के माध्यम पर चढ़ाया जा के साथ एक अगर प्लेट के नीचे नहीं है (ढक्कन) के किनारे के आसपास लेबल.
      • अगर धारावाहिक dilutions चढ़ाना कमजोर पड़ने कारक शामिल हैं.
    2. अगर प्लेट के ढक्कन खोलो, अपने बाएँ हाथ में अपने अंगूठे और तर्जनी के साथ ढक्कन धारण. फिर ग्लास ट्यूब या बोतल पूर्व निष्फल जीएल युक्त खुलागधा मोती. अपने दाहिने हाथ की लौ के साथ ट्यूब या बोतल के रिम तो ध्यान 10-12 एक अगर थाली पर बाँझ ग्लास मनकों (6 चित्रा) के बग़ैर. थाली के ढक्कन, और ट्यूब या बोतल के रिम लौ टोपी की जगह और इसे स्थापित तरफ से पहले एक बार फिर बंद.
      • धीरे ट्यूब या बोतल अगर ऊपर कुछ सेंटीमीटर के बाहर मोती डालना तो मोती पेट्री डिश से बाहर उछाल नहीं है.
      • ग्लास मनकों कि व्यास में 4 मिमी का प्रयोग करें. उन्हें कांच या बोतलों आटोक्लेव परीक्षण नलियों में 121 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सूखी चक्र (गुरुत्वाकर्षण सेटिंग) पर जीवाणुरहित.
      • एक स्प्रेडर के बजाय मोती का उपयोग करने का एक फायदा यह है कि इथेनॉल का कोई खुला कंटेनर दोहराया ज्वलंत के लिए आवश्यक हैं.
    3. अगर प्लेट के ढक्कन खोलो, और अगर की केन्द्र पर अपनी नमूना बांटना. ढक्कन बंद करें.
      • इस प्रक्रिया के दौरान सड़न रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग करें.
      • अशेष भाजक प्लेट प्रति नमूना के 100 से 150 μl. यहमात्रा भी कोशिकाओं के प्रसार की सुविधा होगी. थाली करने के लिए अपने नमूना हस्तांतरण एक micropipettor का प्रयोग करें. नमूना के प्रवाह को नियंत्रित तो यह थाली के बाहर छप नहीं करता है.
    4. धीरे अगर 6 से 7 बार की सतह भर में मोती झटकों से नमूना बिखरा हुआ है. यह सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं समान रूप से फैला, एक क्षैतिज मिलाते हुए प्रस्ताव का उपयोग करें.
      • मोती ज़ुल्फ़ या और सभी कोशिकाओं को थाली के किनारे पर खत्म हो जाएगा मत करो.
      • सुझाव: अगर ठीक से किया है, प्रक्रिया "मिलाते maracas" की तरह लगता है.
    5. 60 प्लेट घुमाएँ ° क्षैतिज तो फिर 6 से 7 बार हिला.
    6. 60 प्लेट ° एक दूसरी बार घुमाएँ और क्षैतिज फिर हिला. अब तक, तुम भी अगर सतह भर में कोशिकाओं के प्रसार को प्राप्त करना चाहिए.
    7. जब फैल चढ़ाना समाप्त, नमूना और अवशोषित किया जाना चाहिए अगर की सतह सूखी होना चाहिए. एक उल्लेखनीय संग्रह 10% क्लोरीन ब्लीच युक्त बीकर में दूषित मोती डालो.
      • मतकचरे में मोतियों त्यागने! प्रयोग किया जाता मोती और rinsed जाएगा autoclaved, फिर से स्टरलाइज़ उन्हें फिर से उपयोग के लिए.
      • नोट: यदि अगर सतह अभी भी तीन बार मिलाने के बाद भी गीला है, थाली में कई मिनट के लिए बैठने के लिए तरल करने की अनुमति अगर द्वारा अवशोषित फिर दोहराने कदम 4-6 # जब तक थाली सतह शुष्क प्रकट होता है की अनुमति.
    8. ऊष्मायन के लिए थाली उलटें.

    5. शीतल अग्रवाल ओवरले प्रक्रिया: अलगाव और फेज की गणना के लिए सजीले गठन (फलक परख)

    इस तकनीक सामान्यतः पता लगाने के लिए और (फेज) जीवाणुभोजी या बैक्टीरिया वायरस यों के लिए प्रयोग किया जाता है कि 100 से 200 एनएम से आकार में सीमा. एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के लिए अलग - अलग फेज कणों को देखने की जरूरत है. हालांकि, एक अगर प्लेट पर सजीले टुकड़े (चित्रा 7A) के रूप में संक्रामक फेज कणों की उपस्थिति का पता लगाया जा सकता है. Phages अपने मेजबान बैक्टीरियल कोशिकाओं के बाहर नकल नहीं कर सकते, तो एक प्रचारघ पता लगाने मिश्रण phages और मेजबान के साथ कोशिकाओं चढ़ाना को पहले की आवश्यकता है. मुलायम अगर उपरिशायी प्रक्रिया के लिए है, 50 μl से 200 μl रेंज में आम तौर पर एक छोटी मात्रा, एक फेज निलंबन के बारे में 10 8 (मेजबान कोशिकाओं) बैक्टीरिया है जो समान रूप से 2.5-3.0 मिलीलीटर में छितरी हुई है युक्त ट्यूब में तिरस्कृत नरम (0.5 से 0.7% [w / v]), पिघल गए पोषक अगर. परिणामस्वरूप मिश्रण एक कठिन पोषक तत्व अगर प्लेट (1.5 से 1.9 [w / वी]%) की सतह पर डाला जाता है. प्लेट पर्याप्त हिलाकर रख दिया है करने के लिए सुनिश्चित करें कि मुलायम अगर हार्ड अगर की पूरी सतह को शामिल किया गया है. फिर थाली एक स्तर की सतह पर रखा गया है जब तक ऊपर अगर परत कठियाना करने के लिए समय दिया गया है और बाद में इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है.

    समय के साथ, बैक्टीरियल कोशिकाओं का एक बादल निलंबन, एक लॉन के रूप में भेजा, नरम अगर मध्यम (चित्रा 7B) के दौरान दृष्टिगोचर हो जाता है. सजीले टुकड़े फार्म अगर एक फेज बैक्टीरियल कोशिकाओं को संक्रमित, वें भीतर replicatesई सेल, तो सेल के रूप में कई के रूप में 100 संतान phages (उर्फ, फट आकार) जारी lyses. नए फेज कणों नरम अगर में फैलाना, lysed बैक्टीरियल सेल के आसपास के क्षेत्र में बैक्टीरिया को संक्रमित करने. संक्रमण और lysis के कई चक्र के बाद, बादल नरम अगर में बैक्टीरिया सेल निलंबन गायब हो जाता है, समाशोधन के एक क्षेत्र में एक पट्टिका बुलाया जा रहा है. प्रत्येक पट्टिका 9 से अधिक 10 फेज कणों, सभी आनुवंशिक मूल संक्रामक फेज कण के समान होते हैं. क्योंकि एक पट्टिका एक सिंगल फेज कण से उठता है, पट्टिका गठन इकाइयों के परिणामस्वरूप संख्या (pfu) और गिना जा सकता है मूल एकाग्रता, या फेज निलंबन के अनुमापांक गणना की जा सकती है. प्रयोग, एक पट्टिका परख कहा जाता है, इस प्रकार का भी वैज्ञानिकों ने एक मानकीकृत उत्पन्न करने के लिए एक कदम विकास घटता, मेजबान रेंज विशिष्टता की जांच, और आनुवंशिक प्रयोगों के लिए बैक्टीरियल कोशिकाओं transduce साधन प्रदान करता है.

    1. <strong> सूचक बैक्टीरिया तैयार: बैक्टीरियल मेजबान तनाव की एक तेजी से बढ़ संस्कृति नरम अगर उपरिशायी प्रयोग के लिए तैयार रहने की जरूरत है. प्रत्येक मेजबान अपने विकास आवश्यकताओं है. 0.3 मिलीग्राम और सूचक बैक्टीरिया के निलंबन के 0.5 मिलीलीटर के बीच एक थाली के लिए आवश्यक है. यदि सूचक बैक्टीरिया के एक फ्लास्क तैयार किया जाता है (उदाहरण के लिए, 25 मिलीलीटर), संस्कृति छोटे (उदाहरण के लिए, 5 मिलीलीटर aliquots बाँझ पेंच छाया ट्यूबों में तिरस्कृत) aliquots पार संदूषण की संभावना को कम करने में विभाजित किया जाना चाहिए. ट्यूब बर्फ (4 डिग्री सेल्सियस) पर रखा जा सकता है जब तक करने के लिए प्रयोग में उपयोग करने के लिए तैयार. सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करने के लिए बाँझ पोषक तत्व शोरबा टीका लगाना तो बैक्टीरियल तनाव के विनिर्देशों के अनुसार सेते हैं. अंतिमांश संस्कृतियों दिन के अंत में खारिज किया जाना चाहिए.
    2. सोखना ट्यूबों तैयार: एक रैक में दो बाँझ microcentrifuge ट्यूबों रखें. पहली ट्यूब "फेज" और दूसरी ट्यूब "नियंत्रण" के ढक्कन के ढक्कन लेबल.
      • ठेठफेज lysates ly धारावाहिक dilutions तैयार कर रहे हैं और मढ़वाया जो मामले में अतिरिक्त microcentrifuge ट्यूब रैक जोड़ा जा होगा और कमजोर पड़ने कारक के साथ लेबल.
      • फेज स्टॉक एकल सजीले टुकड़े से ताजा किया जाना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत फेज कणों विसमूहन, स्टॉक परिवेश के तापमान चाहिए पहले गरम एक प्रयोग का प्रदर्शन करने के लिए.
      • फेज शेयरों धीरे नियंत्रित किया जाना चाहिए - भंवर या pipet सख्ती नहीं करते.
    3. पहली ट्यूब अपने फेज नमूना के 50 μl जोड़ें तो दूसरी ट्यूब, जो पट्टिका परख के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेंगे फेज बफर के 50 μl जोड़ने.
      • फेज और बैक्टीरिया के सभी जोड़तोड़ के दौरान सड़न रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग करें.
    4. अगले प्रत्येक सोखना ट्यूब सूचक बैक्टीरिया के 500 μl जोड़ें.
      • बैक्टीरियल कोशिकाओं को एक ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित अगर समय की लंबी अवधि के लिए बर्फ या बेंच पर बैठे. यदि संस्कृति मिश्रण नहीं हैपूर्व के प्रयोग के लिए एक नि: शेष भाजक हटाने, नहीं पर्याप्त बैक्टीरियल कोशिकाओं सोखना ट्यूब को हस्तांतरित किया जाएगा एड. वहाँ जीवाणु नरम सजीले टुकड़े का पता लगाने के लिए अगर (यानी, एक लॉन) में गठित कालोनियों की पर्याप्त संख्या होना चाहिए. एक भंवर मिश्रक का उपयोग करने के लिए धीरे सोखना ट्यूबों aliquots स्थानांतरित करने से पहले एक सजातीय निलंबन में सूचक बैक्टीरिया पुनः को निलंबित करने के लिए.
    5. धीरे ट्यूबों flicking द्वारा बैक्टीरियल कोशिकाओं और फेज मिलाएं.
    6. फेज / 15-20 मिनट के लिए जीवाणु मिश्रण (नहीं अब की तुलना में 30 मिनट) एक सूचक तनाव के लिए उचित तापमान पर सेते हैं.
    7. पोषक तत्व नरम और अगर कठिन अगर प्लेट तैयार: जबकि सोखना होने वाली है, जगह दो अपने प्रयोगशाला बेंच पर एक हीटिंग ब्लॉक में नरम अगर ट्यूब (पहले पिघल गए और 55 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) 46-48 पर सेट डिग्री सेल्सियस
      • पिघल नरम अगर 10-15 मिनट के लिए ब्लॉक के हीटिंग तापमान equilibrated होना चाहिए. यदि पिघल नरमअगर 15 मिनट से अधिक बैठता है, यह जमना शुरू और फार्म clumps जब कठिन अगर पर डाला जाएगा. यदि पिघल नरम अगर 10 मिनट से भी कम बैठता है, यह बहुत गर्म है जब फेज / जीवाणु मिश्रण में जोड़ा हो, चढ़ाना पहले मेजबान कोशिकाओं की हत्या जाएगा. नतीजतन, लॉन बनाने और कुछ या कोई नहीं सजीले टुकड़े detectable हो सकता है हो सकता है.
      • फेज lysate के धारावाहिक dilutions चढ़ाना अगर अतिरिक्त नरम अगर ट्यूबों तैयार.
    8. दो पोषक तत्व कम से कम अपना नाम, तारीख, मध्यम विकास के प्रकार, और "फेज" या "नियंत्रण" सोखना ट्यूब के लिए इसी के साथ हार्ड अगर प्लेटों प्लेट के नीचे नहीं है (ढक्कन) के किनारे के आसपास लेबल.
      • शामिल अतिरिक्त अगर धारावाहिक dilutions चढ़ाना कमजोर पड़ने कारक के साथ लेबल प्लेटें.
      • कठिन अगर प्लेट ढक्कन और कमरे के तापमान पर नरम अगर जोड़ने के लिए पहले पूर्व गर्म पर संक्षेपण के बिना पूरी तरह से सूखा होना चाहिए. यदि प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत हैं, उन्हें कई घंटे हटाने या भी दापहले वाई. कोई 2-3 से अधिक प्लेटों के छोटे, कंपित ढेर में उन्हें बाहर फैल और उन्हें शुष्क करने की अनुमति. हार्ड अगर परत में अत्यधिक नमी नरम अगर के कमजोर पड़ने के कारण, फेज अधिक आसानी से मुलायम अगर माध्यम से पट्टिका गठन के दौरान फैलाना की अनुमति होगी. नतीजतन, पट्टिका का आकार बढ़ जाएगा.
    9. प्लेट सोखना ट्यूबों के रूप में एक समय में एक प्रकार है: एक P1000 micropipettor प्रयोग aseptically एक नरम अगर ट्यूब के फेज / जीवाणु मिश्रण (लगभग 550 μl होना चाहिए) हस्तांतरण तो तेजी से इसे अपने हाथों की हथेलियों के बीच बारी बारी से करने के लिए सामग्री मिश्रण. हिला इतना है कि हवा के बुलबुले शुरू कर रहे हैं ट्यूब. अपने बाएँ हाथ में ट्यूब होल्डिंग, अपने दाहिने हाथ के साथ एक कठिन अगर प्लेट के ढक्कन खोलने के लिए और तुरंत एक हार्ड अगर प्लेट की सतह पर ट्यूब की संपूर्ण सामग्री डाल. ढक्कन बंद करने से पहले, थाली धीरे रॉक, लेकिन तेजी से थाली की पूरी सतह पर पिघलाया नरम अगर फैलपहले यह जमना है. पेट्री डिश के पक्षों पर पिघलाया नरम अगर splashing से बचें. ढक्कन बंद करें.
    10. # 9 सभी सोखना ट्यूबों के लिए कदम, एक समय में एक ट्यूब दोहराएँ.
    11. एक स्तर की सतह पर प्लेटें प्लेस और उन्हें undisturbed खड़ा करने के लिए जब तक नरम अगर जम जाता है की अनुमति देते हैं.
      • आमतौर पर 30 मिनट के लिए पर्याप्त है.
    12. ऊष्मायन के लिए प्लेटें उलटें.
      • एकाधिक प्लेटें और खड़ी हो सकती है तो एक साथ टेप ऊष्मायन के लिए उलटा.

    ऊष्मायन के बाद, प्लेटें सजीले टुकड़े के लिए निरीक्षण किया जा सकता है. नकारात्मक नियंत्रण केवल जीवाणुओं की एक लॉन (सजीले टुकड़े के कोई संकेत छेद) होना चाहिए. सजीले टुकड़े आकार, आकार और समग्र उपस्थिति के मामले में भिन्न है. एक दिया फेज प्रकार ध्यान से एक बाँझ दंर्तखोदनी के साथ एक पट्टिका का केंद्र छिद्रण और एक बाँझ microcentrifuge टी inoculum स्थानांतरित सजीले टुकड़े के एक विषम मिश्रण से अलग किया जा सकता हैयूबे शोरबा या फेज बफर के 100 से 1000 μl युक्त. यह lysate ही ऊपर वर्णित प्रक्रिया का उपयोग कर चढ़ाया जा सकता है. कम से कम 3 से 6 लगातार एकल पट्टिका isolations करने के लिए सुनिश्चित करें कि एक शुद्ध फेज प्राप्त किया गया है के लिए आवश्यक हैं. अक्सर lysate एक बड़े (10 -1 10 -10) श्रृंखला के लिए एक अनुमापांक है कि एक थाली पर गैर अतिव्यापी सजीले टुकड़े का उत्पादन मिल पर पतला होना चाहिए. संख्या पट्टिका के आकार पर निर्भर करता है.

    6. प्रतिकृति प्लेट प्रक्रिया: कक्षों की स्क्रीनिंग म्यूटेंट और Auxotrophs के लिए स्थानांतरण

    इस तकनीक माध्यमिक प्लेटों को एक प्राथमिक प्लेट पर सेल के विकास की तुलना परमिट, एक चयन phenotype के लिए स्क्रीन की कोशिकाओं के लिए एक साधन पैदा करने. पहले एक प्राथमिक या मास्टर, प्लेट कोशिकाओं के साथ एक कमजोर पड़ने कि एकल कालोनियों का उत्पादन फैल चढ़ाना या तो उन्हें एक स्थानिक ग्रिड निशान से निर्धारित पैटर्न में एक थाली में स्थानांतरित inoculated है. माध्यमिक विकास inhib के साथ मीडिया से युक्त प्लेटेंitors या मीडिया है कि एक विशेष पोषक तत्वों का अभाव प्राथमिक प्लेट पर कालोनियों से कोशिकाओं के साथ inoculated हैं. कालोनियों के स्थानिक पैटर्न 1 प्राथमिक प्लेट मखमल का एक टुकड़ा दबाकर reproduced है. बैक्टीरियल कोशिकाओं मखमल का पालन करने के लिए है क्योंकि वे अगर के लिए की तुलना में मखमल के लिए बड़ा आकर्षण है. मखमल पर कोशिकाओं की छाप तो सेल विकास को दर्शाती है कि प्राथमिक थाली के रूप में एक ही कॉलोनी पैटर्न के साथ कई माध्यमिक प्लेटों को स्थानांतरित किया है. दूसरे शब्दों में, यह एक रबर स्टांप होने की तरह है, एक थाली से दूसरे विकास पैटर्न नकल. इस तकनीक के लिए फायदेमंद है क्योंकि यह कालोनियों के एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या में एक ही प्रयोग में कई phenotypes के लिए करने के लिए एक साथ जांच की अनुमति देता है.

    1. कम से कम अपना नाम, तारीख, और विकास के माध्यम के प्रकार के साथ एक अगर प्लेट के नीचे नहीं है (ढक्कन) के किनारे के आसपास लेबल: प्राथमिक थाली तैयार.
    2. बंद मार्क थाली के साथ तल पर एक ग्रिडकम से कम दो समान रूप से स्थान ऊर्ध्वाधर लाइनों और कम से कम दो समान रूप से स्थान क्षैतिज लाइनों. जिसके परिणामस्वरूप वर्गों संख्या.
    3. एक पूर्व निष्फल दन्तखुदनी का उपयोग करने के लिए एक सेल नमूना के साथ प्रत्येक वर्ग टीका लगाना. प्रत्येक नमूने लिए, थपका वर्ग के केंद्र. कवर या कोशिकाओं के साथ पूरे वर्ग (8 चित्रा) और नमूना है जब incubated बढ़ना और आसपास के वर्गों दूषित होगा.
      • प्रत्येक वर्ग एक अलग नमूना है, या तो शोरबा संस्कृतियों या अन्य प्लेट पर कालोनियों से व्युत्पन्न साथ inoculated किया जाएगा.
    4. उलटें और प्राथमिक थाली सेते हैं, जो विभिन्न माध्यमिक मीडिया को टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    5. माध्यमिक प्लेटें टीका लगाना: प्राथमिक प्लेट और सभी माध्यमिक प्लेटें ढेर. एक मार्कर के साथ, प्लेटों के पक्ष पर एक अभिविन्यास चिह्न. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक, ढक्कन नहीं प्लेट के नीचे की ओर के निशान पर है.
    6. लिए एक बाँझ velveteen कपड़ा प्राप्त और बेलनाकार (एफ ब्लॉक पर जगहigure 9). धारक के साथ जगह में velveteen कपड़ा लॉक. ब्लॉक पर उन्मुखीकरण निशान नोट.
      • ब्लॉक एक पेट्री डिश के नीचे (10.2 सेमी व्यास) के रूप में एक ही आकार का होना चाहिए. यह एक बंद की अंगूठी के साथ आना चाहिए कि clamps ब्लॉक जबकि प्रतिकृति चढ़ाना velveteen कपड़ा.
      • velveteen कपड़ा (15.2 x 15.2 सेमी वर्ग) पूर्व निष्फल चाहिए. 10 या 12 साफ वर्गों तो उन्हें एल्यूमीनियम पन्नी में लपेट तो उन्हें आटोक्लेव में 121 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए जगह सूखी चक्र (गुरुत्वाकर्षण सेटिंग) पर हो चुकी है. उन्हें एक प्रतिकृति चढ़ाना प्रयोग में उपयोग करने से पहले, यकीन है कि वे पूरी तरह से सूख रहे हैं उन्हें कई घंटे के लिए एक गर्म ओवन में रखकर बनाते हैं. ध्यान दें कि velveteen वर्गों de-नसबंदी करने से पहले टेप masking के साथ linted की आवश्यकता हो सकती है.
      • Velveteen वर्गों फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है. के बाद इस्तेमाल किया, velveteen चौकों आटोक्लेव decontaminated है, वे सादे पानी में rinsed होना चाहिए और फिर से निष्फल ऊपर वर्णित के रूप में.
      • बेलनाकार गुटकश्मीर और 70% में एक संक्षिप्त कुल्ला (v / v) इथेनॉल या 10% क्लोरीन ब्लीच के साथ उपयोग के बीच क्लैंप कीटाणुरहित किया जाना चाहिए.
    7. ढक्कन निकालें और प्राथमिक प्लेट पलटना. ब्लॉक पर निशान के साथ थाली पर अभिविन्यास निशान में रेखा. कम प्लेट तो यह है कि अगर के सतह बेलनाकार खंड पर velveteen कपड़े से संपर्क में है. हल्के लेकिन प्राथमिक प्लेट की पीठ पर अपनी उंगलियों के साथ समान रूप से नीचे प्रेस और फिर ध्यान से ब्लॉक से प्राथमिक प्लेट दूर उठा. थाली पर ढक्कन की जगह.
      • प्राथमिक थाली से कोशिकाओं की मखमल छाप के लिए एक नया मखमल किए जाने की जरूरत के साथ एक छाप पहले लगभग 7-8 माध्यमिक प्लेटें टीका लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    8. प्रत्येक माध्यमिक प्लेटों के साथ # 7 कदम दोहराएँ.
      • एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, श्रृंखला में पिछले प्लेट एक अगर मध्यम जिसमें सभी परीक्षण उपभेदों जाना चाहिए होना चाहिए. इस तरह आप है कि कोशिकाओं की पुष्टि कर सकते हैं सभी माध्यमिक pl के लिए स्थानांतरित कर दिया गयाश्रृंखला में ates. अन्यथा, एक विशेष परीक्षण मध्यम पर विकास की कमी अपर्याप्त सेल के बजाय तनाव का एक phenotype हस्तांतरण के लिए जिम्मेदार माना जा सकता है.
      • झूठी सकारात्मक से बचने के लिए, माध्यमिक प्लेटें सबसे अनुकूल सब्सट्रेट से कम से कम करने के लिए आदेश दिया जाना चाहिए. अन्यथा, पोषक तत्वों की कोशिकाओं एक प्रतिकूल मध्यम पर विकसित करने की अनुमति प्लेटों के बीच स्थानांतरित किया जा सकता है.
    9. प्लेटें और सेते उलटें.
      • नोट: जब विकास के लिए माध्यमिक प्लेटों का निरीक्षण, विकास और एक छाप के बीच भेद करने के लिए सुनिश्चित हो. बाद एक नकारात्मक परिणाम है.

    7. काम की जगह की सफाई

    1. लैम्प बर्नर बंद तो दूर प्लेटों पर या ट्यूब, अतिरिक्त मीडिया, और अन्य अभिकर्मकों में संस्कृतियों सहित सभी सामग्री डाल.
      • प्लेटों पर या ट्यूबों में पुराने संस्कृतियों, प्रयोगशाला बेंच पर या भंडारण क्षेत्रों में जमा की अनुमति नहीं देते. ये नमूने, जो संदूषण के कुख्यात स्रोत हैंmolds और अवांछित बैक्टीरियल प्रजातियों के रूप में, जैसे ही वे अब जरूरत है खारिज किया जाना चाहिए.
    2. प्लेस उचित निपटान गोदाम में दूषित (दस्ताने, विंदुक युक्तियाँ kimwipes) labware, कांच के बने पदार्थ (ट्यूब, बोतल, बोतलों), और खतरनाक अपशिष्ट (बैक्टीरियल संस्कृतियों या फेज समाधान, प्लेटें). जब एक गैर रोगजनक ई. के साथ काम कर रहे हैं कोलाई तनाव (BSL-1), केवल गैर संक्रामक खतरनाक अपशिष्ट उत्पन्न होता है. जब रोगजनक जीवों (BSL-2 या ऊपर) के साथ ही इन प्रक्रियाओं के प्रदर्शन, संक्रामक खतरनाक अपशिष्ट उत्पन्न होता है. Biohazard वर्गीकरण के बावजूद, खतरनाक अपशिष्ट या autoclaved किया जाना चाहिए कीटाणुरहित पहले इसे खारिज कर दिया है. BMBL में वर्णित दिशा निर्देशों (5 वें एड.) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक प्रयोग के दौरान उत्पन्न biohazards की तत्काल और उचित निपटान के लिए अपने संस्थागत पर्यावरणीय स्वास्थ्य और सुरक्षा विभाग द्वारा उपलब्ध कराए गए उन का पालन करें.
    3. निस्संक्रामक के साथ कार्य क्षेत्र को साफ.
    4. हाथ धो लेंअच्छी तरह से एंटीसेप्टिक साबुन और प्रयोगशाला छोड़ने से पहले गर्म पानी के साथ.

    8. प्रतिनिधि परिणाम

    स्ट्रीक प्लेट तकनीक लकीर चढ़ाना के लिए एक नमूना अनुप्रयोग चित्र 1 में दिखाया गया है. इस प्रक्रिया मिश्रित सेल संस्कृतियों से अलग जीवाणु कॉलोनियों के लिए प्रयोग किया जाता है और अब तक एक सूक्ष्म जीव विज्ञान और आणविक आनुवंशिकी में मास्टर करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण तकनीकों का. प्रत्येक कॉलोनी कोशिकाओं है कि आनुवंशिक रूप से समान हैं की एक आबादी का प्रतिनिधित्व करता है. कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए यह या तो एक कॉलोनी या एक शुद्ध जीवाणु एक ही कॉलोनी से कोशिकाओं के साथ मीडिया inoculating द्वारा उत्पन्न संस्कृति के साथ शुरू करने के लिए जरूरी है. उदाहरण के लिए, एक कॉलोनी के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं के morphology एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर निरीक्षण किया जा सकता है. जेनेटिक पहचान जीनोमिक डीएनए एक सेल संस्कृति एक ही कॉलोनी के साथ शुरू से अलग से छोटे सबयूनिट राइबोसोमल आरएनए जीन अनुक्रमण द्वारा सौंपा जा सकता है.और चयापचय विशेषताओं विभिन्न जैव रासायनिक और शारीरिक assays के लिए कोशिकाओं को subjecting द्वारा वर्णित किया जा सकता है. केवल शुद्ध संस्कृतियों के साथ इस तरह के प्रयोगों का प्रदर्शन द्वारा एक एक विशेष सूक्ष्मजीव को जिम्मेदार माना संपत्तियों के कुछ हो सकता है. संभावना है कि संस्कृति दूषित परिणाम नहीं छिप कर रहे हैं. तकनीकी त्रुटियों अगर थाली भर कोशिकाओं लकीर करने के लिए प्रयोग किया जाता है साधन के बाँझपन प्रक्रिया के दौरान बनाए रखा नहीं है हो सकता है. एक पाश लौ को भूलकर या एक ताजा दन्तखुदनी प्राप्त के बीच यह quadrants मुश्किल एकल कालोनियों प्राप्त करने के लिए. कुछ बैक्टीरियल प्रजातियों शुद्ध संस्कृति में अलग नहीं किया जा के रूप में वे कुछ विकास आवश्यकताओं के लिए एक और बैक्टीरियल प्रजातियों के साथ एक सहकारी संघ पर निर्भर कर सकते हैं. Syntrophs के रूप में कहा जाता है, इन जीवों केवल सह संस्कृति शर्तों के तहत विकसित किया जा सकता है, तो कालोनियों (यदि का गठन) हमेशा दो या दो से अधिक प्रजातियों को शामिल किया जाएगा. एक और चुनौती प्रयोगशाला में सामना करना पड़ा जब प्रदर्शनपर्यावरणीय नमूनों से प्राप्त बैक्टीरिया के साथ लकीर प्लेट प्रक्रिया है कि कोशिकाओं के विकास विशेषताओं है कि ई. जैसे पारंपरिक प्रयोगशाला उपभेदों से विचलित प्रदर्शन कोलाई. केल्सीकृत ऐसे जीवाणु उपभेदों कालोनियों कि filamentous शाखाओं कि अगर प्लेट के एक बड़े वर्ग में फैला है के साथ (के रूप में कोशिकाओं के तंग समूहों का विरोध कर रहे हैं) का उत्पादन हो सकता है, और इस प्रकार एक लकीर प्लेट साधन के द्वारा प्रवेश के लिए आग रोक, या एक चिपचिपा कैप्सूल से घिरा ताकि व्यक्ति कालोनियों discerned किया जा नहीं कर सकते हैं. इन विशेषताओं यह लकीर प्लेट तकनीक द्वारा एकल कालोनियों को शुद्ध करने के लिए मुश्किल बनाते हैं.

    डालो प्लेट तकनीक डाल प्लेट तकनीक के साथ, कालोनियों के रूप में अच्छी तरह के रूप में इस प्रकार अगर मध्यम एक नमूना में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए एक सुविधाजनक साधन उपलब्ध कराने की सतह पर अगर भीतर फार्म. इस प्रक्रिया औद्योगिक अनुप्रयोगों की एक किस्म में प्रयोग किया जाता है. उदाहरण के लिए, यह एक अपशिष्ट tre के लिए महत्वपूर्ण हैatment संयंत्र, जो तरल कचरे की सफाई (जैसे, मल, रन दूर तूफान से नालियों) घरेलू, वाणिज्यिक, औद्योगिक और गुणों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कृषि पद्धतियों द्वारा उत्पन्न व्यापक शुद्धिकरण प्रक्रिया के बाद पानी के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए जिम्मेदार है. व्यवहार अपशिष्ट जल (गैर - पीने का पानी) तरीकों की एक किस्म में reused किया है - कृषि में गैर खाद्य फसलों की सिंचाई के लिए, घरों में सेनेटरी निस्तब्धता के लिए, और औद्योगिक कूलिंग टॉवर्स में - तो यह रासायनिक और माइक्रोबियल संदूषण का मुक्त होना चाहिए. पीने का पानी (पीने योग्य पानी) EPA मानकों के हिसाब से शुद्ध किया जाना चाहिए और सूक्ष्मजीवविज्ञानी चढ़ाना तरीकों कि विशिष्ट मानव रोगजनकों की गणना की अनुमति का उपयोग कर परीक्षण किया है. 10 चित्र में दिखाया गया बैक्टीरिया बैक्टीरिया कोशिकाओं से उत्पन्न कालोनियों एक पानी एक सार्वजनिक पीने के फव्वारे से एकत्र नमूना में मौजूद हैं. यह संभावना नहीं बैक्टीरियल रोगज़नक़ों उत्पादित इन कालोनियों में पीने के पानी के लिए शुद्धि के उपाय दिए है, लेकिन, रोगाणुओं हरजहां और भी गैर रोगजनक उपभेदों द्वारा संक्रमण केवल कम से कम किया जा सकता है समाप्त पूरी तरह से नहीं. एक और उदाहरण के रूप में, एक दवा कंपनी माइक्रोबियल संदूषण, या उत्पादन, भंडारण और परिवहन के दौरान एक नई दवा की bioburden की डिग्री का आकलन करने की जरूरत है. प्रक्रिया और चढ़ाना डाल प्लेट प्रक्रिया का उपयोग कर नमूने के विभिन्न चरणों के दौरान दवा नमूने, माइक्रोबियल लोड, या contaminating जीवाणुओं की संख्या है, आसानी से निर्धारित किया जा सकता है. एहतियाती उपाय तो कम से कम करने के लिए या माइक्रोबियल संदूषण को समाप्त करने के लिए तैयार किया जा सकता है. सबसे आम तकनीकी त्रुटियों की है कि तब होता है जब डालना प्लेट तकनीक प्रदर्शन पिघल अगर पेड़ों का झुरमुट के कारण कालोनियों के साथ जिससे प्लेट मायने रखता गलत बनाने के साथ नमूना के मिश्रण अपर्याप्त है. एक और लगातार त्रुटि पिघल अगर डालने का कार्य कर रहा है जब यह बहुत गर्म है, नमूने में बैक्टीरिया की कोशिकाओं के कई की हत्या. इस गलती को भी संख्या के तहत प्रतिनिधित्व करते हैं कि वें देने प्लेट गिनती की सटीकता को प्रभावित करेगाई नमूने में कॉलोनी बनाने इकाइयों की कुल संख्या.

    फैलाओ प्लेट तकनीक प्रसार प्लेट तकनीक व्यवहार्य प्लेट गिनती करने के लिए एक साधन के रूप में इसकी उपयोगिता में डाल प्लेट प्रक्रिया अनुरूप है. हालांकि, है क्योंकि प्रसार प्लेट तकनीक का उपयोग कर प्रपत्र कालोनियों कि समान रूप से अगर माध्यम की सतह भर में वितरित कर रहे हैं, अलग - अलग कालोनियों से कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है इस्तेमाल बाद में प्रयोगात्मक अभिव्यक्ती में (उदाहरण के लिए, एक लकीर थाली या एक के लिए inoculum संस्कृति शोरबा). तीन आम अनुप्रयोगों जो फैल प्लेट तकनीक में एक महत्वपूर्ण घटक है संवर्धन चयन, और स्क्रीनिंग प्रयोग कर रहे हैं. सभी तीन अनुप्रयोगों में वांछित कोशिका प्रकार के मिश्रण से अलग किया जा सकता है और बाद में जैव रासायनिक, शारीरिक, या आनुवंशिक परीक्षण के किसी भी संख्या के लिए अधीन.

    संवर्धन प्रयोग एक मध्यम पर एक मिश्रित संस्कृति चढ़ाना या ई में प्लेटें incubating शामिलnvironmental स्थिति है कि नमूना भीतर उन सूक्ष्मजीवों कि वांछित चयापचय गुण, विकास विशेषताओं, या व्यवहार प्रदर्शित की विकास एहसान. इस रणनीति वांछित संस्कृति में दूसरों की तुलना में सूक्ष्मजीवों की संख्या में वृद्धि हुई है में अन्य जीवों लेकिन परिणाम के विकास को रोकना नहीं करता है. इस प्रकार, कालोनियों कि एक संवर्धन प्लेट पर फार्म की संभावना प्ररूपी गुण है कि वांछित जीनोटाइप को प्रतिबिंबित दिखा रहे हैं. उदाहरण के लिए, यदि आपका लक्ष्य के लिए 1000 से अधिक विभिन्न प्रजातियों के जीवाणु का एक मिश्रण से युक्त एक पर्यावरण नमूना से नाइट्रोजन फिक्सिंग जीवाणु खेती, फिर एक मध्यम नाइट्रोजन की कमी पर नमूना चढ़ाना है उन बैक्टीरिया है कि से इस परिसर का उत्पादन कर सकते हैं के लिए समृद्ध करेंगे चयापचय नाइट्रोजन फिक्सिंग के लिए आवश्यक जीन का एक सूट द्वारा प्रदान की क्षमताओं का उपयोग वातावरण.

    चयन प्रयोग एक माध्यम है कि चुनाव की अनुमति देता है कि केवल उन कोशिकाओं पर एक मिश्रित संस्कृति चढ़ाना शामिलएक विशेष या विकसित करने के लिए जीन के जीन सेट टाइन. आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में प्रयोग के इस प्रकार के आम है जब एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन युक्त plasmids के साथ जीवाणु उपभेदों को बदलने. यदि आपका लक्ष्य केवल रीकॉम्बीनैंट कोशिकाओं, या उन है कि सफलतापूर्वक प्लाज्मिड ले लिया, तो एक माध्यम है कि एंटीबायोटिक का एक उपयुक्त एकाग्रता के साथ पूरक है पर नमूना चढ़ाना उन कोशिकाओं है कि इस विशेष दवा के लिए विरोध प्रदर्शन करने के लिए चयन करेंगे खेती है.

    स्क्रीनिंग प्रयोग एक मध्यम कि सभी व्यवहार्य कोशिकाओं को विकसित करने के लिए अनुमति देता है पर एक मिश्रित संस्कृति चढ़ाना शामिल है, तथापि, वांछित जीनोटाइप के साथ कोशिकाओं उनके phenotype के आधार पर अन्य कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. फिर, इस प्रकार के आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में आम है जब plasmids में mutagenesis assays या क्लोनिंग जीन प्रदर्शन. एक क्लासिक उदाहरण lacZ जीन enco का उपयोग करता है, के रूप में 11 चित्र में दिखाया गया है,β galactosidase डिंग, इस एंजाइम के लिए कोशिकाओं एक्स लड़की metabolize (5-ब्रोमो 4 - क्लोरो 3 indolyl-β-D galactopyranoside), अपने प्राकृतिक सब्सट्रेट, लैक्टोज के एक सब्सट्रेट अनुरूप अनुमति देता है. एक्स - लड़की के एक अघुलनशील नीले उत्पाद में β galactosidase परिणाम द्वारा विखंडन. इस प्रकार, यदि एक मध्यम एक्स - लड़की हैं, और एक या तो एक जंगली प्रकार (कार्य) या उत्परिवर्ती (गैर कार्यात्मक) lacZ जीन के साथ कोशिकाओं से युक्त नमूना इस माध्यम पर चढ़ाया जाता है, तो जंगली प्रकार ऊष्मायन एक कार्यात्मक lacZ को शरण देने की कोशिकाओं का पालन जीन नीले pigmented कालोनियों के रूप में दिखाई देते हैं, जबकि एक गैर कार्यात्मक lacZ जीन के साथ उत्परिवर्ती कोशिकाओं unpigmented कालोनियों ("" सफेद) के रूप में दिखाई देगा.

    एक तकनीकी समस्या सबसे अक्सर सामना करना पड़ा जब पहली सीखने कैसे फैल प्लेट तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए असमान कोशिकाओं की अगर सतह भर में फैल रहा है. जब एक turntable और कांच रॉड का उपयोग, नमूना भी ऐसी जल्दी है कि कालोनियों थाली के केंद्र के पास ही के रूप में अवशोषित किया जा सकता है. डब्ल्यूमुर्गी "Copacabana विधि" कर रही है, कांच के मनकों के बजाय swirled हैं अगर सतह भर में हिल. नतीजतन, कई कालोनियों थाली के बाहरी रिम के साथ बढ़ता है. या तो मामले में लाभ पूरी सतह उपलब्ध क्षेत्र की कालोनियों के परिणामस्वरूप वितरण नहीं ले करता है तो कोशिकाओं पेड़ों का झुरमुट एक साथ और अतिव्यापी प्लेट गलत मायने रखता है या सेल unfeasible प्रकार के भेद कालोनियों में बढ़ती.

    शीतल अग्रवाल ओवरले तकनीक. एक प्रसार प्लेट बैक्टीरियल कालोनियों की गिनती करने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया जैसा प्रक्रिया फेज की संख्या मिलान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जबकि 30 और 300 के बीच बैक्टीरियल कोशिकाओं प्लेट मायने रखता है (CFU / मिलीलीटर) के लिए अगर सतह पर फैले हुए हैं, 100 और 400 के बीच संक्रामक फेज कणों 10 8 10 9 पट्टिका की गिनती के लिए मेजबान कोशिकाओं (pfu / मिलीलीटर) के साथ एक परत के भीतर मिश्रित कर रहे हैं नरम अगर मुश्किल पोषक तत्व अगर की सतह भर में फैले. जब तक अन्यथा का प्रदर्शन है, यह आम तौर पर माना जाता हैटोपी एक एकल जीवाणु सेल बांटता है और जम एक एकल एक कॉलोनी बुलाया क्लस्टर में आनुवंशिक रूप से समान कोशिकाओं की बड़ी संख्या है. जैसा कि पहले चर्चा की, इस धारणा वैध है जब कोशिकाओं (यानी, जोड़े, tetrads, चेन, या समूहों) bunches में वृद्धि या कैप्सूल कि एकल कॉलोनी के गठन में बाधा के रूप में विकास विशेषताओं को प्रदर्शित नहीं है. एक इसी तरह की धारणा पट्टिका गठन के लिए किया जाता है, कि प्रत्येक पट्टिका एक सिंगल फेज की गतिविधि का प्रतिनिधित्व करता है. यह बयान सही है तो केवल एक फेज एक जीवाणु को संक्रमित है. क्या होता है अगर कई फेज कणों एक जीवाणु को संक्रमित? संक्रमण की बहुलता (MOI) - संक्रामक फेज कणों के एक नमूने में मेजबान कोशिकाओं की संख्या अनुपात का वर्णन इस समस्या को एक महत्वपूर्ण सांख्यिकीय पैरामीटर है कि विचार किया जाना चाहिए जब फेज प्रयोगों के साथ प्रदर्शन से संबंधित है. क्योंकि एक से अधिक कुछ कोशिकाओं सोखना फेज जबकि अन्य कोशिकाओं सोखना केवल एक या कोई फेज, मेजबान कोशिकाओं की आबादी के एक कम MOI (1 ≤) टी में संक्रमित किया जाना चाहिए* कम से कम संभावना है कि एक सेल एक फेज कण की तुलना में अधिक से संक्रमित हो जाएगा. एक कार्यात्मक परिभाषा के रूप में पट्टिका गठन इकाई (pfu) रोजगार इन जटिलताओं से बचा जाता है जब पट्टिका मायने रखता प्रदर्शन एक फेज स्टॉक की अनुमापांक की गणना करने के लिए.

    12 चित्र में दिखाया गया है, पट्टिका morphology अलग फेज के लिए बदलता रहता है. कुछ फेज छोटे सजीले टुकड़े (एक पैनल) उत्पन्न जबकि दूसरों को बड़ी सजीले टुकड़े (पैनल बी) को जन्म दे. चर के एक नंबर पट्टिका आकार को प्रभावित करते हैं. वहाँ तकनीकी कारणों कि इस परिवर्तनशीलता योगदान कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, पूरा मीडिया और मोटी बड़े सजीले टुकड़े के हार्ड अगर समर्थन विकास क्योंकि मेजबान कोशिकाओं फेज विकास समय की एक लंबी अवधि के लिए बनाए रखने कर सकते हैं. मेजबान कोशिकाओं के एक उच्च चढ़ाना घनत्व (> 10 प्लेट प्रति 9 CFU) पट्टिका आकार में कमी का कारण होगा. नरम अगर की कम सांद्रता का प्रयोग नरम अगर में फेज कण प्रसार की दर को बढ़ाने के लिए और इस तरह सजीले टुकड़े के आकार में वृद्धि होगी. वें स्मरण करोइस वृद्धि की प्रसार दर पर अनजाने में होते हैं तो कठिन अगर प्लेट को पूरी तरह से थाली में ऐसा है कि संक्षेपण या अतिरिक्त नमी उपरिशायी में नरम अगर dilutes सूखी नहीं कर रहे हैं कर सकते हैं. इस तकनीकी निरीक्षण एक विशेष फेज के लिए पट्टिका आकार के लिए सम्मान के साथ असंगत परिणाम देगा.

    फलक आकार भी सोखना की दक्षता, अव्यक्त अवधि (फेज सोखना से समय मेजबान सेल की lysis अवधि) की अवधि, और फट आकार (संतान की संख्या से जारी सहित मेजबान सेल की घटनाओं की एक संख्या से संबंधित है एक एकल संक्रमण). पट्टिका आकार के एक विषम मिश्रण अगर फेज कणों बैक्टीरियल विकास के विभिन्न चरणों में मेजबान कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए मनाया जा सकता है. उदाहरण के लिए, जल्दी घातीय चरण के दौरान कि सोखना उन अधिक संतान फेज के साथ उन लोगों की तुलना में बड़ा सजीले टुकड़े करना है कि देर से घातीय चरण में सोखना. एक सामान्य नियम के रूप में, lytic फेज lysogenic फेज फॉर्म पंकिल सजीले टुकड़े जबकि स्पष्ट सजीले टुकड़े का उत्पादन. होwever, कुछ lytic फेज "सांड की आंख" चित्रा 12B में दिखाया पट्टिका के रूप में दिलचस्प पैटर्न का उत्पादन. ये स्पष्ट सजीले टुकड़े एक turbid प्रभामंडल से घिरे रहे हैं क्योंकि उन कोशिकाओं पट्टिका के किनारे पर या पूरी तरह से नहीं lysed संक्रमण फेज के लिए प्रतिरोधी हो सकता है. एक "सांड की आंख" समशीतोष्ण फेज के साथ मनाया पैटर्न एक turbid एक स्पष्ट अंगूठी से घिरा केंद्र के साथ एक पट्टिका है. इस आकारिकी MOI और lysis - lysogeny निर्णय करने के लिए सम्मान के साथ मेजबान सेल के शरीर क्रिया विज्ञान को दर्शाता है. जब कोशिकाओं को पहले फेज से संक्रमित हैं, MOI कम है और कोशिकाओं को तेजी से बढ़ने क्योंकि पोषक तत्वों की प्रचुर मात्रा में हैं, के साथ इस lytic विकास की सुविधा. के रूप में अधिक से अधिक कोशिकाओं lysed कर रहे हैं, MOI बढ़ जाती है और एक स्पष्ट पट्टिका रूपों. Lysogens पट्टिका के केंद्र में, तथापि, विकसित करने के लिए जारी रखने क्योंकि वे lysis एक turbid केंद्र के साथ एक स्पष्ट पट्टिका को जन्म देने के लिए प्रतिरक्षा हैं.

    उपरिशायी तकनीक यूकेरियोटिक वायरस के साथ पट्टिका assays के लिए संशोधित किया जा सकता है. मेंनरम अगर में बैक्टीरियल कोशिकाओं के लॉन पर एक ही तरह जीवाणुभोजी फार्म का सजीले टुकड़े, यूकेरियोटिक वायरस एक जेल से कवर कोशिकाओं के एक monolayer पर सजीले टुकड़े के रूप में. एक monolayer कंधे से कंधा मिलाकर एक संस्कृति डिश की सतह पर बढ़ रही है, एक दूसरे को छू, लेकिन एक दूसरे के ऊपर नहीं बढ़ रहा है कोशिकाओं के एक सहधारा चादर है. पट्टिका परख के इस प्रकार के लिए बाहर ले जाने के वायरस की aliquots यूकेरियोटिक कोशिकाओं की अतिसंवेदनशील monolayers को जोड़ रहे हैं. तब monolayer एक agarose आधारित मध्यम पोषक के साथ कवर किया जाता है - इस जेल संतान आसन्न कोशिकाओं को संक्रमित कोशिकाओं से monolayer में जारी वायरस के प्रसार को सीमित. तदनुसार, एक गोलाकार क्षेत्र, या पट्टिका का उत्पादन किया है, जिसमें virions की रिहाई से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं. सजीले टुकड़े रंजक, कि दाग जीवित कोशिकाओं सेल संक्रमित और uninfected कोशिकाओं के बीच विपरीत प्रदान संस्कृति के लिए लागू किया जा सकता है के दृश्य सहायता.

    उपरिशायी नरम अगर तकनीक पट्टिका assays के अलावा अन्य प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाता है. सबसे पहले, यह हैignificant को याद है कि मुश्किल पोषक तत्व अगर एक समर्थन मैट्रिक्स है कि जीवाणुओं के विकास परमिट है. दूसरा, ओवरले के लिए इस्तेमाल किया नरम अग्रवाल कठिन अगर तुलना में एक अलग पोषक तत्व रचना कर सकते हैं. इस तरह, अगर मुलायम विभिन्न विकास विशेषताओं या चयापचय गुण के लिए जीवाणु उपभेदों परख के लिए एक साधन के रूप में सेवा कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, उपरिशायी तकनीक सेलूलोज़ (teather और लकड़ी 1982) नीचा करने की क्षमता के लिए स्क्रीन बैक्टीरिया के लिए प्रयोग किया जाता है. एकल कालोनियों एक गैर चयनात्मक हार्ड अगर तो मुलायम - अगर 0.1% (w / v) Carboxymethyl सेलूलोज़ (सीएमसी) हार्ड अगर की सतह पर फैला हुआ है जिसमें मध्यम पर हो रहे हैं. ऊष्मायन के बाद, प्लेटें दाग है कि मुलायम अगर में कालोनियों के आसपास समाशोधन के क्षेत्रों में से एक दृश्य परमिट के साथ भर रहे हैं. समाशोधन hydrolytic नीचे मध्यम में सेलूलोज़ तोड़ने बैक्टीरिया द्वारा secreted एंजाइमों के कारण होता है. हाल ही में, उपरिशायी तकनीक है कि methanoge के विकास को बाधित करने के लिए बैक्टीरिया का पता लगाने के इस्तेमाल किया गया हैएनआईसी Archaea पशुओं के रूमेण (2010 गिल्बर्ट एट अल.) में पाया. पर्यावरणीय नमूनों से बैक्टीरियल आइसोलेट्स एक कठिन अगर पोषक तत्व है तो कालोनियों नरम अगर methanogens की एक संस्कृति युक्त overlayed मध्यम पर हो रहे हैं. ऊष्मायन के बाद, प्लेटें कालोनियों के विकास निषेध के आसपास के क्षेत्रों के लिए निरीक्षण कर रहे हैं. इस विधि जीवाणु उपभेदों कि नरम अगर में methanogens inhibitors को पहचानती है.

    सबसे आम तकनीकी त्रुटियों कि उपरिशायी नरम अगर तकनीक के साथ होते पिघल नरम - अगर डालने का कार्य कर रहे हैं तो जब यह बहुत गर्म या बहुत शांत है. अगर यह बहुत गर्म है, बैक्टीरियल कोशिकाओं मध्यम में मिश्रित चढ़ाना को पहले मारा जाएगा. अगर यह बहुत शांत है, तो अगर मुलायम फार्म clumps जब कठिन अगर पर डाला जाएगा. या तो मामले में, परिणाम अस्पष्ट या अस्पष्ट हो सबसे अच्छा होगा.

    प्रतिकृति प्लेट प्रक्रिया. पोषक माध्यम के एक प्रकार से संस्कृतियों स्थानांतरितदूसरे के लिए विकास की आवश्यकताओं को परीक्षण करने के लिए काफी श्रमसाध्य हो जाता है अगर वहाँ सिर्फ एक कुछ उपभेदों से अधिक कर रहे हैं. प्रतिकृति चढ़ाना एक तरीका है कि सूक्ष्मजीवों की एक बड़ी संख्या के साथ - साथ जांच की अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, जंगली प्रकार की कोशिकाओं के एक संस्कृति mutagenizing के बाद, एक संस्कृति के dilutions प्लेट का प्रसार करने के लिए एकल कालोनियों के साथ प्लेटों को प्राप्त कर सकते हैं. प्राथमिक प्लेटें एक माध्यम है कि जंगली प्रकार prototrophs, जो विकास के लिए आवश्यक यौगिकों synthesize और उत्परिवर्ती auxotrophs, जो एक biosynthetic उन्हें करने के लिए विशेष रूप से विकास के लिए आवश्यक यौगिकों synthesize करने में असमर्थ प्रतिपादन मार्ग में एक आनुवंशिक उत्परिवर्तन ले सहित सभी कोशिकाओं के विकास का समर्थन करता है होते हैं. एक पूरा माध्यम पर कोशिकाओं के मिश्रण चढ़ाना, लापता पोषक तत्वों पर्यावरण से ऊपर ले जाया जा सकता है. के बीच भेद prototrophs और auxotrophs, कालोनियों एक न्यूनतम माध्यम पर दोहराया जा सकता है. केवल prototrophs विकसित करने में सक्षम हो जाएगा. क्योंकि प्राथमिक थाली के स्थानिक पैटर्न संरक्षित है, comparisप्राथमिक थाली के साथ माध्यमिक थाली की पर उत्परिवर्ती कालोनियों की पहचान की अनुमति देता है. यह निर्धारित करने के लिए कि जो मिश्रित म्यूटेंट नहीं रह synthesizing करने में सक्षम हैं, कालोनियों न्यूनतम विशिष्ट यौगिकों (जैसे, अमीनो एसिड, कार्बन स्रोतों, विटामिन, आदि) के साथ पूरक मीडिया पर दोहराया जा सकता है. इस तरह, कालोनियों के सैकड़ों प्रतिकृति प्लेट प्रक्रिया का उपयोग करते हुए एक ही समय पर जांच की जा सकती है. एक तकनीकी त्रुटि है कि हो सकता है अगर प्लेटें कि बहुत गीला कर रहे हैं का उपयोग कर रहा है, कालोनियों को एक साथ धब्बा थाली पर सभी संस्कृतियों contaminating पैदा करने के लिए. यह परिणाम है कि पूरी तरह से अविश्वसनीय हैं पैदा करता है. एक अन्य तकनीकी त्रुटि बहुत अधिक दबाव लागू है जब velveteen से माध्यमिक प्लेटों के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित. फिर, माध्यमिक प्लेटें incubating के बाद, परिणामी कालोनियों विकास auxotrophy बजाय प्रदूषण के लिए जिम्मेदार ठहराया phenotypes उत्पादन ओवरलैप हो सकते हैं.

    जंगली प्रकार माइक्रोबियल नहीं सभी प्रजातियों prototrophs कर रहे हैं तो, प्रतिकृति-pदेर प्रक्रिया के लिए एक साथ विशेषता विकास की आवश्यकताओं के लिए विभिन्न प्रकार के जंगली उपभेदों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चार अलग अलग Pseudomonas जीवाणु उपभेदों से कोशिकाओं के रूप में 13 चित्र में दिखाया गया है "dabs" एक ग्रिड के रूप में चिह्नित पूरा मीडिया युक्त थाली YTA बुलाया पर दो प्रतियों में चढ़ाया (पैनल ए). उपभेदों तो तीन माध्यमिक प्लेटों पर दोहराया गया (पैनल बी, सी, और डी) की कम से कम मध्यम (एमएसए) एक अलग कार्बन स्रोत (acetamide, लैक्टोज, और glycine, क्रमशः) के साथ पूरक बना. परिणाम दर्शाते हैं कि दो चार Pseudomonas उपभेदों की (पी. aeruginosa और पी. stutzeri) इन तीन कार्बन स्रोतों पर बढ़ के काबिल हैं. एक नियंत्रण के रूप में, उपभेदों एक चौथी थाली पर YTA माध्यम से दोहराया गया पुष्टि करने के लिए कोशिकाओं प्रक्रिया के दौरान स्थानांतरित कर दिया गया है. चूंकि सभी चार उपभेदों YTA नियंत्रण थाली पर बढ़ने, विकास की कमी श्रृंखला में पिछले तीन प्लेटों पर प्रदर्शन विश्वसनीय हैं. प्रतिकृति चढ़ाना परिणाम तालिका 1 में सारणीबद्ध रहे हैं. एक सामान्य बनाया त्रुटि एक सकारात्मक परिणाम के रूप में एक माध्यमिक थाली पर विकास की एक छाप व्याख्या है. उदाहरण के लिए, पी. के phenotype की तुलना पी. के aeruginosa stutzeri एमएसए पर + acetamide (पैनल बी). बाद विकास है, जो एक नकारात्मक परिणाम है की एक छाप प्रदर्शित करता है, और अगर पिछले थाली से पोषक तत्वों के माता - पिता के कोशिकाओं के साथ स्थानांतरित कर रहे हैं हो सकता है. कोई नए सेल विकास होता है क्योंकि लापता संतान कोशिकाओं को पोषक तत्वों उपलब्ध नहीं हैं. यह वास्तविक विकास के साथ एक छाप को भ्रमित करने के लिए आसान है. शक में अगर, प्रयोग माध्यमिक मीडिया पर प्राथमिक थाली से लकीर चढ़ाना कोशिकाओं के रूप में एक वैकल्पिक ऐसी विधि का उपयोग दोहराया जाना चाहिए.

    चित्रा 1
    चित्रा 1 एक थाली पर एकल कालोनियों के उदाहरण. प्लेट के केंद्र के पास गुलाबी क्षेत्रों Serratia marcesc की कालोनियों हैंसत्ता, एक ग्राम नकारात्मक, परिवार Enterobacteriaceae में Proteobacterium छड़ के आकार का है. नम वातावरण के लिए अपनी पसंद के कारण, यह microorganism सामान्यतः bathtubs के कोनों में बढ़ रही है, सिंक बेसिनों में टाइल grout में, और शॉवर पर्दे पर पाया जाता है एस. पहचान करने के बाद से यह एक लाल prodigiosin नामक रंगद्रव्य marcescens आसान है. इस प्लेट पर कालोनियों एकल कालोनियों के 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 ऊष्मायन के बाद वृत्त का चतुर्थ भाग में प्रदर्शित होने के साथ, लकीर प्लेट तकनीक का उपयोग कर उत्पन्न किया गया. अन्य तीन quadrants सहधारा विकास में जो कोशिकाओं अगर अतिव्यापी कालोनियों में विकसित सतह पर जमा दिखा.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. उपकरण लकीर प्लेट तकनीक के लिए प्रयोग किया जाता है. ऊपर से नीचे तक दिखाया, toothpicks (चपटा नहीं दौर), एक तार पाश, एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक पाश, और लकड़िया हैं. Toothpicks आम तौर पर स्थानांतरित कर रहे हैंव्यापक अंत के साथ एक छोटे से कांच बीकर नीचे तो पन्नी के साथ कवर जब पहले बाँझ बनाना करने के लिए उपयोग करने के लिए autoclaved. लकड़िया 18 मिमी परीक्षण तो उपयोग करने से पहले बाँझ बनाना autoclaved ट्यूबों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं.

    चित्रा 3
    चित्रा 3 (ए) स्ट्रीक प्लेट वृत्त का चतुर्थ भाग विधि तकनीक का उपयोग. एक पूर्व निष्फल पाश, छड़ी या दन्तखुदनी के लिए एक तेजी से, चिकनी, थाली के केन्द्र के रिम से गति पीछे और 4 के साथ अगर सतह की एक चौथाई भर नमूना फैल करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस कार्रवाई थाली के चार quadrants में से प्रत्येक के लिए दोहराया है. ऊष्मायन के बाद, सेल के विकास थाली पर कोशिकाओं को जमा करने के लिए इस्तेमाल साधन के रास्ते पर प्रकट होता है. एक मिश्रित नमूना इस तकनीक का उपयोग करने में कोशिकाओं के यांत्रिक जुदाई 4 चक्र में एकल कालोनियों में परिणाम चाहिए (चित्रा 1 एक उदाहरण के लिए देखें). एकल कालोनियों के लिए कॉलोनी के गठन इकाइयों के रूप में भेजा जाता है (CFU). (बी) जब एक धातु पाश लकीर चढ़ाना के लिए प्रयोग किया जाता है, यह एक लैम्प बर्नर की लौ पहले का उपयोग निष्फल inoculum या अगर मध्यम के साथ संपर्क किया जाना चाहिए. याद है कि लौ के सबसे हिस्सा नीले शंकु के टिप है. साधन की संभाल होल्डिंग, पाश से 3-4 इंच के बारे लौ में तार जगह. लंबे समय के लिए पर्याप्त यह लाल गर्म बनने के तार के लिए छोड़ दें. तार ले जाएँ तो लौ पाश दृष्टिकोण. सुनिश्चित करें कि धातु पाश inoculum को छूने से पहले ठंडा किया जाता है.

    चित्रा 4
    चित्रा 4 तकनीक डालो प्लेट. (ए) नमूना (0.1 के बीच 1.0 मिलीग्राम) की एक छोटी मात्रा aseptically 5.0 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग करने के साथ एक खाली लेकिन बाँझ पेट्री डिश में तिरस्कृत किया है. (बी) के लगभग 48 की एक तापमान पिघल equilibrated अगर डिग्री सेल्सियस तो नमूना साथ पेट्री डिश में डाल दिया है. ढक्कन बंद करने के बाद, थाली धीरे से नमूना मिश्रण और swirledपिघल अगर. अगर तो प्लेटें ऊष्मायन के लिए उल्टे कर रहे हैं के बारे में 30 मिनट के लिए जमना करने के लिए अनुमति दी है.

    चित्रा 5
    5 एक turntable और कांच स्प्रेडर के साथ तकनीक फैल प्लेट चित्रा. अगर थाली के बाद एक turntable पर रखा गया है, नमूना की एक छोटी मात्रा (0.1 से 0.2 एमएल) aseptically एक micropipettor प्लेट का उपयोग कर के केन्द्र पर तिरस्कृत है. स्प्रेडर यह इथेनॉल के एक बीकर में सूई फिर यह लेम्प अतिरिक्त इथेनॉल प्रज्वलित बर्नर की लौ के माध्यम से गुजर रहा द्वारा निष्फल है. नमूने के साथ संपर्क बनाने से पहले, स्प्रेडर यह थाली के रिम के पास अगर छू द्वारा ठंडा करने के लिए किया जाना चाहिए. स्प्रेडर नमूना के माध्यम से धीरे आगे और पीछे थाली भर जबकि turntable धीरे घूम रहा है ले जाया गया. यह कार्रवाई क्रमिक लेकिन फिर भी अगर सतह भर में नमूना के प्रसार की अनुमति देता है. ढक्कन बंद करने के बाद, बेंच शीर्ष यू प्लेट पर सेट किया जाना चाहिएनमूना पूरी तरह से अगर में अवशोषित करने के लिए पूर्व ऊष्मायन के लिए inverting थाली करने के लिए अनुमति देने के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए ndisturbed.

    चित्रा 6
    चित्रा 6 फैल प्लेट ग्लास मनकों (Copacabana विधि) के साथ तकनीक. ग्लास मनकों किया गया है कि पूर्व एक autoclave में निष्फल एक अगर बेंच शीर्ष पर बैठे प्लेट की सतह पर डाल रहे हैं. नमूने की एक छोटी मात्रा में (100 से 150 μl) aseptically अगर की केंद्र एक micropipettor का उपयोग पर तिरस्कृत है. थाली का ढक्कन बंद कर दिया, एक क्षैतिज गति मिलाते हुए धीरे मोती आगे और पीछे थाली भर में 6 से 7 बार स्थानांतरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, नमूना फैल गया. थाली 60 ° घूर्णन के बाद इस क्रिया को दोहराया है. मिलाते हुए इस प्रस्ताव का एक और 60 ° रोटेशन के बाद तीसरी बार दोहराया है. एक बार नमूना अगर माध्यम में पूरी तरह से अवशोषित कर लेता है, मोती से एक 10% ब्लीच युक्त बीकर में डाल रहे हैं.प्लेटें तो ऊष्मायन के लिए उल्टे कर रहे हैं.

    7 चित्रा
    7 चित्रा शीतल अग्रवाल उपरिशायी के लिए अलग और सजीले टुकड़े के गठन (एक पट्टिका परख भी कहा जाता है) के आधार पर फेज गिनना तकनीक का इस्तेमाल किया. (ए) फेज की उपस्थिति समाशोधन के क्षेत्र, या सजीले टुकड़े के रूप में पता लगाया जा सकता है बैक्टीरियल नरम अगर में बढ़ रही कालोनियों के एक सहधारा निलंबन पर. टी -4 फेज एक विषमय, डबल असहाय डीएनए फेज कि अपने मेजबान, Escherichia कोलाई को संक्रमित करता है, जिससे मेजबान कोशिकाओं lyse और संतान फेज जारी है. संक्रमण और lysis, पड़ोसी ई. के कई दौर के बाद तत्काल क्षेत्र में कोली की कोशिकाओं को मूल संक्रमित मेजबान सेल के आसपास एक टी -4 फेज कणों के अरबों युक्त पट्टिका छोड़ गायब हो जाती है. टी -4 फेज सजीले टुकड़े हैं कि व्यास में लगभग 1 मिमी. इस प्रयोग में एक 2 x 10 8 फेज के शेयर / pfu मिलीलीटर के 10 -5 कमजोर पड़ने की 200 μl T4ई. के लगभग 300 μl के साथ मिलाया गया था कोलाई सूचक कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक तेजी से बढ़ रही है, वातित संस्कृति के रूप में तैयार दोनों फेज और बैक्टीरिया एक EHA नरम अगर ट्यूब, मिश्रित, तो एक EHA कठिन अगर थाली की सतह पर डाला जोड़ा गया था. ध्यान दें कि यह आवश्यक नहीं था फेज और बैक्टीरिया से पहले इस मामले में चढ़ाना सोखना करने के लिए अनुमति देते हैं. मुलायम अगर 20 मिनट के लिए undisturbed कठियाना करने की अनुमति के बाद, प्लेटें उलटा किया गया और 24 घंटे के लिए incubated में 37 डिग्री सेल्सियस. (बी) नरम अगर कोशिकाओं में जो असतत कालोनियों दिखाई नहीं कर रहे हैं एक बादल निलंबन में फेज कणों, बैक्टीरियल वृद्धि परिणाम संक्रमण के अभाव में. इसके बजाय, बैक्टीरियल कोशिकाओं के भी इस मामले में, लॉन ई. कोलाई पूरे नरम अगर परत भर रूपों.

    चित्रा 8
    8 चित्रा बैक्टीरिया के नमूने के साथ प्राथमिक प्लेट (गुरु) की तैयारी. का आयोजन किया नमूने रखने के लिए, प्लेट के नीचे एक ग्रिड में चिह्नित किया जा सकता है और जिसके परिणामस्वरूप वर्गों गिने. प्रत्येक नमूना ग्रिड पर एक वर्ग को सौंपा जा सकता है. दिखाया सही बनाम गलत टीका पैटर्न के उदाहरण हैं. आदर्श रूप में, कोशिकाओं की एक छोटी संख्या में वर्ग के केन्द्र नमूना "थपका" एक दन्तखुदनी (# सेल 4) के रूप में इस तरह के एक बाँझ टीका उपकरण का उपयोग करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं. ("पैच") 5 और 6 ("भरने") सेल में चित्रित उन लोगों के रूप में आम टीका गलतियों, बैक्टीरियल ऊष्मायन के बाद नमूनों की अतिवृद्धि में परिणाम है, फलस्वरूप contaminating बगल वर्ग.

    9 चित्रा
    9 चित्रा प्रतिकृति प्लेट phenotype स्क्रीन के लिए माध्यमिक प्लेटों को प्राथमिक से कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया. velveteen कवर तो ब्लॉक लोव पर प्राथमिक प्लेट पर निशान के निशान के साथ गठबंधन किया है अगर सतह कपड़ा संपर्क करने की अनुमति लाल. कोशिकाओं को हल्के से थाली से velveteen के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, लेकिन समान रूप से उंगलियों के साथ प्राथमिक प्लेट पर नीचे दबाने. यह कार्रवाई प्राथमिक थाली के रूप में एक ही स्थानिक पैटर्न में velveteen पर सेल के नमूने एक छाप छोड़ जाएगा. velveteen से एक माध्यमिक प्लेट कोशिकाओं हस्तांतरण के लिए एक ही प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है. के रूप में कई के रूप में 7-8 माध्यमिक प्लेटों velveteen पर ही प्राथमिक प्लेट छाप का उपयोग inoculated किया जा सकता है. पिछले velveteen से inoculated प्लेट एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करनी चाहिए. यह एक माध्यम है कि सभी परीक्षण उपभेदों के विकास का समर्थन करता है, पर्याप्त सेल प्लेटों की संपूर्ण श्रृंखला के दौरान हुई हस्तांतरण सुनिश्चित किया जाना चाहिए. ऊष्मायन के बाद, माध्यमिक प्लेटें और निरीक्षण किया जा सकता है कोई विकास बनाम विकास के लिए बनाए. इस प्रकार, कई जीवाणु उपभेदों कई विकास माध्यमों पर एक साथ किया जा सकता है एक ही प्रयोग में जांच की.

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    10 उदाहरण डाल प्लेट तकनीक का उपयोग कर परिणाम चित्रा. एक सार्वजनिक पीने के फव्वारे से पानी की एक 1.0 मिलीलीटर नमूना एक बाँझ खाली पेट्री डिश में तिरस्कृत किया गया था. फिर पिघल लेकिन ठंडा YTA डिश में नमूने के साथ डाल दिया गया था. अगर भी 100 छ / मिलीलीटर yeasts और molds कि पानी के नमूने में मौजूद हो सकता है की वृद्धि को रोकने के cycloheximide निहित. धीरे मिश्रण करने के लिए घूमता के बाद, थाली एक सपाट सतह पर स्थापित किया गया था और अगर पूरी तरह से जमना करने के लिए अनुमति दी गई थी. प्लेट 37 डिग्री सेल्सियस से कम 48 घंटे के लिए incubated किया गया था. इस प्रयोग का परिणाम दिखाई है. कालोनियों, सतह, जो आकार में बड़े और परिपत्र बनाम उप सतह कालोनियों, जो बहुत छोटे हैं और अनियमित आकार की उपस्थिति में अंतर नोट क्योंकि जम मध्यम उप सतह में फैल कॉलोनी रोकता.

    11 चित्रा
    11 चित्रा. </ Strong> उदाहरण तकनीक प्रसार प्लेट का उपयोग परिणाम. "Copacabana विधि" एक स्क्रीनिंग प्रयोग के लिए ई. कोलाई कोशिकाओं का एक मिश्रण की थाली के लिए इस्तेमाल किया गया था. इस मामले में, मध्यम विकास (पौंड) एक्स - लड़की का होता है तो, उन एक कार्यात्मक है β galactosidase एंजाइम फार्म नीले कालोनियों व्यक्त कोशिकाओं जबकि lacZ जीन में उत्परिवर्तन के साथ उन कोशिकाओं और इस तरह एक कार्यात्मक एंजाइम β-galactosidase फार्म व्यक्त करने में असमर्थ सफेद कालोनियों. अक्सर एक "नीले / सफेद स्क्रीन" के रूप में जाना जाता है, कालोनियों के दो प्रकार के एक ही थाली पर आसानी से किया जा सकता है एक दूसरे से भिन्न है.

    12 चित्रा
    12 चित्रा पट्टिका परख का उदाहरण परिणाम नरम अगर उपरिशायी तकनीक का उपयोग कर. पता चला है दो अलग पीएच द्वारा मेजबान का तनाव माइकोबैक्टीरियम smegmatis 2 mc 155 (700,084 ATCC) पर गठित सजीले टुकड़े हैंउम्र: (ए) Mycobacteriophage विध्वंसक और (बी) Mycobacteriophage MSSS. इन फेज UCLA प्रयोगशाला 2010 के वसंत में पाठ्यक्रम MIMG 103L में छात्रों द्वारा पृथक किया गया. एम. smegmatis एक गैर रोगजनक Actinobacterium है और माइक्रोबैक्टीरिया की एक परिवार है कि कुछ (एम. तपेदिक, एम. अफ्रिकेनाम, एम. बोविस) टीबी और कुष्ठ रोग (एम. leprae) जैसे गंभीर रोगों का कारण ज्ञात रोगजनकों के अंतर्गत आता है. लगभग एक विध्वंसक के 10 -2 कमजोर पड़ने और एक 10 प्रत्येक MSSS की -3 कमजोर पड़ने के 50 μl एम. के 500 μl के साथ incubated रहे थे 20 मिनट के लिए 37 बजे smegmatis ° C तो MBTA (नरम अगर) के साथ मिलाया और गृह मंत्रालय पर डाल प्लेटों (हार्ड अगर). मुलायम अगर 20 मिनट के लिए undisturbed कठियाना करने की अनुमति के बाद, प्लेटें उलटा किया गया और 48 घंटे के लिए incubated में 37 डिग्री सेल्सियस. अलग पट्टिका morphologies प्रत्येक फेज द्वारा उत्पादित नोट. विध्वंसक (A) छोटे रूपों (लगभग 1 मिमी की औसत व्यास), स्पष्ट सजीले टुकड़े एक lytic फेज की विशेषताजबकि MSSS (बी) स्पष्ट एक पंकिल प्रभामंडल (लगभग 3.2 मिमी की औसत व्यास) द्वारा घिरे केन्द्रों के साथ बड़े "सांड की आंख" सजीले टुकड़े विकसित करता है. धुंधला अंगूठी बैक्टीरिया कि संक्रमण फेज प्रतिरोधी हैं शामिल किया जा सकता है. यह पैटर्न lysogenic फेज, जो turbid सजीले टुकड़े का उत्पादन द्वारा गठित से अलग है.

    13 चित्रा
    13 चित्रा उदाहरण प्रतिकृति प्लेट प्रक्रिया का उपयोग कर परिणाम. : Acetamide लैक्टोज, और glycine चार Pseudomonas उपभेदों (पी. aeruginosa, पी. putida, पी. fluorescens, और पी. stutzeri) के विकास के लिए तीन अलग अलग कार्बन स्रोतों पर दो प्रतियों में परीक्षण किया गया. (ए) प्राथमिक प्लेट एक पूरा (YTA) मध्यम चार रूप में संकेत दिया उपभेदों के साथ inoculated है. 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, सभी चार उपभेदों YTA पर बढ़ता है. मुझ पर कम से कम प्राथमिक थाली प्रतिकृति थाली करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाdium (एमएसए) एक एकल कार्बन स्रोत के साथ पूरक: acetamide (बी), (सी) लैक्टोज, और ग्लाइसिन (डी). श्रृंखला में पिछले प्लेट एक सकारात्मक नियंत्रण YTA प्लेट (ई) था. के रूप में दिखाया गया है, उपभेदों माध्यमिक प्लेटों पर ऊष्मायन के बाद चर विकास पैटर्न से पता चलता है. ध्यान दें कि यह कभी कभी विकास और कोशिकाओं के एक छाप के बीच भेद करना मुश्किल है. उदाहरण के लिए, पी. द्वारा उत्पन्न छाप की तुलना पी. द्वारा ही तीन प्लेटों पर कोई विकास के लिए तीन एमएसए प्लेटों पर stutzeri aeruginosa. दोनों विकास पी. द्वारा प्रदर्शित पैटर्न की तुलना में नकारात्मक परिणाम हैं putida और पी. fluorescens. हालांकि, सभी उपभेदों सकारात्मक नियंत्रण की थाली की पुष्टि की कोशिकाओं पर बढ़ने श्रृंखला में सभी माध्यमिक प्लेटों के लिए स्थानांतरित कर दिया गया. इस प्रयोग के परिणाम तालिका 1 में सारणीबद्ध रहे हैं.

    YTA
    (प्राथमिक)
    एमएसए +
    acetamide
    एमएसए +
    दूध की ​​चीनी
    एमएसए +
    ग्लाइसिन
    YTA
    (नियंत्रण)
    पी. aeruginosa + - - - +
    पी. putida + + + + +
    पी. fluorescens + + + + +
    पी. stutzeri + - - - +

    प्रतिकृति चढ़ाना परिणाम की तालिका 1. सारांश. (-) ग्रोथ प्लस (+) हस्ताक्षर और कोई ऋण चिह्न के रूप में प्रतिनिधित्व वृद्धि के रूप में संकेत दिया. YTA एक ​​पूरा मध्यम (खमीर tryptone अगर) और एमएसए एक न्यूनतम मध्यम (न्यूनतम लवण अगर) है. एमएसए प्लेटें एक एकल कार्बन स्रोत के साथ पूरक के रूप में संकेत दिया गया है.

    Discussion

    संवर्धन सूक्ष्मजीवों चढ़ाना तरीकों, जो सभी की आवश्यकता होती है कि सड़न रोकनेवाला तकनीक कोशिकाओं और मीडिया के हेरफेर भर में बनाए रखा जा की एक संख्या शामिल है. पांच अलग प्रक्रियाओं इस प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया. हालांकि इन चढ़ाना तकनीक को नियमित करने के लिए बैक्टीरिया और फेज में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, वे भी स्तनधारी सेल संस्कृति और यूकेरियोटिक सामान्यतः खमीर (यानी, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe), शैवाल के रूप में आणविक आनुवंशिकी में इस्तेमाल किया और प्रोटोजोआ सूक्ष्मजीवों को लागू किया जा सकता है ( यानी, Volvox, Chlamydomonas, अमीबा, Paramecium), और नेमाटोड (यानी, Caenorhabditis एलिगेंस). वहाँ भी प्रत्येक चढ़ाना विधि के कई विविधताओं (और भी अधिक परिष्कृत) प्रयोगात्मक अध्ययन के तहत लक्ष्य या जीव के आधार पर कर रहे हैं. इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है कि केवल एक प्रयोग या लक्ष्य दिया सूक्ष्मजीव के लिए सबसे उपयुक्त तकनीक का चयन नहीं किया है लेकिन यह भी पद्धति दर्जी के लिए इस तरह के टीटोपी प्रयोगात्मक परिणामों उपयुक्त अनुसंधान प्रश्न या समस्या का समाधान.

    चढ़ाना इस प्रोटोकॉल में तकनीकों पर चर्चा की सबसे मौजूदा अनुप्रयोगों के कुछ प्रौद्योगिकीय अग्रिमों है कि स्क्रीनिंग और दवाओं की खोज के प्रयोगों के लिए उच्च throughput परिणाम उपज शामिल है. उदाहरण के लिए, जीनोम अनुक्रमण केन्द्रों फैल चढ़ाना क्लोन पुस्तकालयों के लिए "Copacabana विधि" का उपयोग करने के लिए, जो ई. कोलाई कोशिकाओं प्लास्मिड डीएनए एक microorganism के जीनोम से व्युत्पन्न टुकड़े युक्त के साथ बदल दिया है. क्योंकि बड़े प्लेटों के दर्जनों (बुलाया bioassay ट्रे) एक बार में तैयार कर रहे हैं, एक स्वचालित थाली हिलनेवाला की ट्रे के पूरे बैच के लिए ग्लास मनकों हिला के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके अलावा, जब इन प्लेटों से ऊष्मायन के बाद कालोनियों का चयन, एक रोबोट कॉलोनी पिकर के लिए 384 अच्छी तरह microplates में लेग शोरबा के लिए inoculum के रूप में उपयुक्त कालोनियों से कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है. इस उच्च throughput स्क्रीनिंग परख, प्रसार पी के प्रक्रियात्मक सिद्धांतों के लिएदेर तकनीक को लागू लेकिन प्रौद्योगिकी के विभिन्न चरणों का स्वचालित करने के लिए और नमूनों की एक बड़ी संख्या में एक साथ और एक छोटी समय सीमा के भीतर विश्लेषण किया जा अनुमति बढ़ाया की अनुमति देता है.

    जैव प्रौद्योगिकी और दवा कंपनियों के सूक्ष्म जीव विज्ञान और आणविक आनुवंशिकी में सबसे बुनियादी तकनीकों के लिए उच्च throughput प्रौद्योगिकी के विकास में काफी संसाधनों का निवेश. उदाहरण के लिए, वहाँ मल्टी चैनल 8 या 12 एक बार में नमूने के लिए मात्रा स्थानान्तरण प्रदर्शन micropipettors हैं. वहाँ भी रोबोट पैंतरेबाज़ी कि एक 96-चैनल विंदुक सिर workstations कर रहे हैं! इन प्रयासों में वैज्ञानिकों की बहु - अनुशासनात्मक टीमों में शामिल है, जीव है कि इंजीनियर और कंप्यूटर प्रोग्रामर जो यांत्रिक के प्रयोगों के साथ जुड़े कार्यों को करने की जरूरत उपकरण विकसित कर सकते हैं के साथ methodological विशेषज्ञता के अधिकारी बाँधना. अनुसंधान आवेदन के बावजूद, इन प्रौद्योगिकियों के विकास कंपनियों द्वारा साझा लक्ष्य एक ही है - laborato को स्वचालित रूप सेry प्रक्रियाओं, उपकरण, प्रणालियों और उपकरणों, उन्हें कम श्रम गहन और अधिक कुशल बनाने के.

    Disclosures

    मैं खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

    Acknowledgements

    IROC डिजाइन पर Cori सैंडर्स विशेष चित्र तैयारी और नमूना संस्कृतियों और आंकड़ों के साथ सहायता के लिए क्रिस रेड्डी और UCLA में भैरव शाह के लिए धन्यवाद. इस परियोजना के लिए अनुदान HHMI (HHMI अनुदान सं 52006944) द्वारा प्रदान किया गया.

    Materials

    1. Yeast Tryptone Agar (YTA)

    Yeast extract 2.0 g
    Tryptone 10.0 g
    Agar 15.0 g
    Distilled water up to 1000.0 ml
    pH 7.0

    Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

    If preparing tubes for the pour-plate procedure, allow the agar to cool to ~55°C then add 2.0 ml of 50 mg/ml cycloheximide. Aseptically dispense 18.0 ml of the melted agar per 18 mm tube then store at 4°C. The agar will solidify and will need to be melted in a steamer or microwave prior to use.

    2. Minimal Salts Agar (MSA) + 0.1% (w/v) carbon source

    NH4Cl 1.0 g
    NH2HPO4•2H2O 2.14 g
    KH2PO4 1.09 g
    MgSO4•7H2O 0.2 g
    Carbon source* 1.0 g
    Trace salts solution** 10.0 ml
    Agar 15.0 g
    Distilled water up to 1000.0 ml
    pH 7.0

    Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

    * Carbon sources used for experiments presented in Figure 13 include acetamide, lactose, and glycine.

    ** Trace salts solution is prepared in 0.1 N HCl as follows. It is added to the base before sterilization (autoclave at 121°C for 20 minutes).

    FeSO4•7H2O 300.0 mg
    MnCl2•4H2O 180.0 mg
    Co(NO3)2•6H2O 130.0 mg
    ZnSO4.7H2O 40.0 mg
    H2MoO4 20.0 mg
    CuSO4•5H2O 1.0 mg
    CaCl2 1000.0 mg
    HCl (0.1 N) up to 1000.0 ml

    3. EHA soft agar (0.65 % w/v)

    Agar 6.5 g
    Tryptone 13.0 g
    NaCl 8.0 g
    Na Citrate•2H2O 2.0 g
    Glucose 3.0 g
    Distilled water up to 1000.0 ml

    Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

    4. EHA hard agar (1.2% w/v)

    Agar 12.0 g
    Tryptone 13.0 g
    NaCl 8.0 g
    Na Citrate•2H2O 2.0 g
    Glucose 3.0 g
    Distilled water up to 1000.0 ml

    Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

    5. 1X Middlebrook Top Agar (MBTA soft agar, 0.5% w/v)

    100 mM CaCl2 stock* 1 ml
    7H9 liquid medium: Neat ** 50 ml
    2XTA *** 50 ml

    Melt 50 ml of 2XTA and allow it to cool to ~55°C. Using aseptic technique, add the CaCl2 and 7H9 broth to the melted agar. Aseptically dispense 4.5 ml of the mixture per 13 mm tube and store in a 55°C incubator ≤7 days. Cooling MBTA to room temperature or 4°C will cause the CaCl2 to precipitate out of solution.

    * 100 mM CaCl2. stock must be stored at room temperature to prevent CaCl2 from precipitating out of solution.

    ** 7H9 liquid medium: Neat

    7H9 broth base 4.7 g
    40% glycerol stock 5 ml
    Distilled water up to 900.0 ml

    Mix the base with water then add the glycerol while stirring. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C.

    *** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1.0% w/v)

    7H9 broth base 4.7 g
    Agar 1.0 g
    Distilled water up to 1000.0 ml

    Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Dispense 50 ml aliquots into 100 ml bottles and store at 4°C.

    6. Middlebrook 7H10 Agar Plates (MHA hard agar, 1.9% w/v)

    7H10 agar base 19.0 g
    40% glycerol stock 12.5 ml
    Distilled water 887.5 ml

    Mix the agar base with water then add the glycerol while stirring. Heat the solution to boiling then stir for one minute to completely dissolve the base powder. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add the following reagents:

    AD supplement (pre-warmed to 37°C)* 100 ml
    50 mg/ml Carbenicillin ** 1.0 ml
    10 mg/ml Cycloheximide ** 1.0 ml

    * AD supplement

    NaCl > 17 g >
    Albumin (Fraction V)> 100 g>
    Dextrose (D-Glucose)> 40 g>
    Distilled water> up to 2000.0 ml>

    Filter-sterilize this solution; do not autoclave. Store at 4°C.

    ** Filter-sterilize and store these solutions at 4°C for ≤60 days.

    7. LB agar (1.5% w/v) + X-Gal (60 μg/ml)

    Tryptone 10.0 g
    Yeast extract 5.0 g
    NaCl 10.0 g
    Agar 15.0 g
    Distilled water up to 1000.0 ml
    pH 7.5 at 25°C

    Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add 3.0 ml of 20 mg/ml X-Gal solution. Freshly prepare X-gal stock by dissolving 400 mg X-Gal in 20 ml dimethylformamide (DMF).

    Table of specific reagents:

    Name of the reagent Company Catalogue number
    Yeast extract Becton Dickenson 212750
    Tryptone Becton Dickenson 211705
    Agar Becton Dickenson 214030
    NH4Cl Acros Organics 123340010
    NH2HPO4•2H2O Sigma-Aldrich 30435
    KH2PO4 Fisher Scientific BP 303-500
    MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich 230391
    Acetamide Sigma-Aldrich A-0500
    Lactose Fisher Scientific L6-500
    Glycine Sigma-Aldrich G-7126
    FeSO4•7H2O Sigma-Aldrich F8048
    MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M-3634
    Co(NO3)2•6H2O Sigma-Aldrich 230375
    ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z4750
    H2MoO4 Acros Organics 213621000
    CuSO4•5H2O Sigma-Aldrich 209198
    CaCl2 Sigma-Aldrich C1016
    HCl Fisher Scientific A144-212
    Cycloheximide Sigma 038K1561
    Carbenicillin Cellgro 46-100-RG
    NaCl Fisher S271-1
    Na Citrate•2H2O Fisher S279-500
    Glucose (Dextrose) BD 215530
    7H9 broth base BD 271310
    7H10 agar base BD 262710
    Glycerol Shelton IB15760
    Albumin (Fraction V) Fisher S71907
    X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Teknova X1205
    Dimethylformamide (DMF) Sigma D4551
    Ethanol Fisher CDA19
    Chlorine Bleach Chlorox 02490/06644884
    CiDecon (disinfectant) Decon Laboratories, Inc. 8504

    Table of specific equipment:

    Name of equipment Company Catalogue number Experiment
    Metal loops American Educational Products S17352 Streak plating
    Disposable plastic loops Fisher 22-363-602 Streak plating
    Wooden sticks Fisher 23-400-104 Streak plating
    Flat Toothpicks American Educational Products S67859 Streak plating
    Turn tables Fisher 08-758Q Spread plating
    Glass rods Bellco Glass NC9004380 Spread plating
    4 mm glass beads Fisher 11-312B Spread plating
    Velveteen cloth Bel-Art Products 09-718-2 Replica plating
    Cylindrical block Bel-Art Products 09-718-1 Replica plating

    References

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    Comments

    2 Comments

    I am not sure why you keep lots of care flaming your clean loop starting at the base and then up to the loop, but in contrast, flame directly the loop when it is full of bacteria.
    My suggestion is to flame always starting from the bottom of the wire and then up to the loop, which in theory may reduce the amount of aerosols produced.
    Reply

    Posted by: Ed K.June 8, 2012, 11:02 PM

    Shouldn't the scientist be using gloves?
    Reply

    Posted by: Josh F.June 30, 2012, 3:15 PM

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