Técnicas de laboratorio asépticas: Métodos de Revestimiento

[Narrador] Este protocolo incorpora una técnica aséptica en los métodos de siembra utilizados para aislar, propagar o enumerar microorganismos como bacterias y fagos. Los procedimientos incluyen cultivos bacterianos de estrías para aislar colonias individuales. Vierta el revestimiento para determinar la concentración de bacterias. Y extender la placa para enumerar colonias bacterianas viables. Las superposiciones de agar blando se utilizan para aislar fagos y enumerar placas, mientras que las réplicas de placas transfieren células de una placa a otra en un patrón espacial idéntico. En última instancia, las aplicaciones prácticas de estas técnicas para cultivar microorganismos van desde la identificación de bacterias en entornos hasta avances tecnológicos en genética molecular y bioensayos de alto rendimiento.

- En general, las personas nuevas en estos métodos de placas pueden tener dificultades porque las manipulaciones requieren movimientos cuidadosos y coordinados que evitan el contacto con superficies no estériles. Aprender estos procedimientos rutinarios requiere entrenamiento y práctica. La demostración de los procedimientos estará a cargo de mi coordinador de laboratorio, el Dr. Kris Reddi.

- [Narrador] Comience a trabajar con microorganismos conociendo las reglas del laboratorio y las precauciones de seguridad, incluida la clasificación de riesgos biológicos, la descontaminación de desechos y la eliminación. Confirme que todos los instrumentos, soluciones y medios para los procedimientos de emplatado sean estériles. También establezca un espacio de trabajo despejado. Límpialo con desinfectante. Instale un quemador Bunsen con un tubo conectado a una línea de gas, organice los suministros necesarios con materiales etiquetados correctamente. Proceda a lavarse bien las manos con jabón antiséptico y agua tibia. Primero, humedezca las manos con agua corriente tibia y luego aplique y distribuya bien el jabón. Frote vigorosamente las manos generando fricción en todas las superficies, incluidos los pulgares, el dorso de los dedos, el dorso de las manos y debajo de las uñas. Luego enjuague bien para eliminar el jabón residual y seque con toallas de papel dispensadas de un soporte. Finalmente, con una toalla de papel limpia, cierre el grifo. El procedimiento de placa de rayas está diseñado para aislar cultivos puros de bacterias, o colonias, de poblaciones mixtas mediante una simple separación mecánica. Retire una placa de agar de una caja fría de cuatro grados centígrados y precaliente a temperatura ambiente. Seleccione una herramienta de la matriz de instrumentos para rayar la placa. Asegúrese de que la placa esté seca sin condensación en la tapa. Etiquete la parte inferior de una placa de agar alrededor del borde. Cuando sea competente, use una sola placa para múltiples muestras. Luego encienda un mechero Bunsen para encender el lazo de metal. Comience a tres o cuatro pulgadas del bucle de metal con el alambre en la punta del cono azul, la parte más caliente de la llama del quemador Bunsen. Cuando el metal se ponga al rojo vivo, mueva el cable para que la llama se acerque al bucle. Para enfriar el bucle, toque el borde del medio agar generando un sonido chisporroteante. Continúe recogiendo el inóculo en el bucle. Levante la mitad inferior del plato. Mueve el lazo hacia adelante y hacia atrás desde el borde hacia el centro en el primer cuadrante de la placa. Vuelva a colocar la placa invertida en la tapa. Vuelve a encender el lazo de metal. Gire la placa de Petri 90 grados. Toque el bucle cerca del final de la última raya usando el patrón de ida y vuelta, cruce la última mitad de las rayas en el primer cuadrante y luego muévase al segundo cuadrante vacío. Una vez que se llena el segundo cuadrante, coloque la placa. Repita el procedimiento de rayado para el tercer y cuarto cuadrante evitando el contacto con el primer cuadrante. Para rayar con un palillo de dientes plano y estéril, sostenga el extremo estrecho suavemente entre el pulgar y el anular en un ángulo de 10 a 20 grados con respecto al medio, use el extremo ancho para rayar los cuadrantes. Invierta la placa nuevamente en la tapa entre los cuadrantes y deseche el palillo de dientes de manera adecuada. Proceda a incubar las placas rayadas boca abajo. El procedimiento de vertido de placas enumera el número total de unidades formadoras de colonias en la superficie y dentro del agar de una sola placa. Configure un temporizador durante 10 minutos, luego transfiera 18 mililitros de medio de agar derretido de un baño de agua a 55 grados Celsius a un bloque de calor de 48 grados Celsius y equilibre durante 10 minutos. Etiquete el fondo de una placa de Petri estéril. Si corresponde, incluya el factor de dilución. Ahora dispense un mililitro de muestra en el medio de la placa de Petri. Cierre la tapa. Retire la tapa del tubo de agar derretido y pase el borde del tubo abierto a través de una llama. Vierta el agar con cuidado en la placa de Petri. Cierre la tapa y luego mezcle la muestra con el agar girando suavemente la placa. Espere 30 minutos para permitir que el agar se solidifique. Una vez que el agar se haya solidificado, invierta y coloque la placa en una habitación cálida. El esparcimiento tiene como objetivo separar los microorganismos contenidos dentro de un pequeño volumen de muestra distribuyendo las colonias resultantes de manera uniforme en la superficie del agar. Equilibre un plato a temperatura ambiente y etiquételo adecuadamente. Coloque la placa en el plato giratorio. Pipetear 0,1 mililitros de muestra en el centro del agar y cerrar la tapa. Expulse la punta en un contenedor de residuos. Sumerja la varilla de metal en un vaso de precipitados de etanol al 70% que cubra toda la parte inferior del esparcidor y la primera pulgada del tallo y luego escurra. Encienda el exceso de etanol pasando a través de la llama de un mechero Bunsen. A continuación, abra la tapa de la placa de agar y enfríe el esparcidor tocándolo con el agar a lo largo del borde cerca del borde. Gira el tocadiscos lentamente. Sosteniendo el esparcidor suavemente sobre la superficie del agar, extienda gradualmente la muestra de manera uniforme sobre toda la placa con un movimiento hacia adelante y hacia atrás mientras gira la plataforma giratoria. Cierre la tapa y deje que la muestra se absorba completamente durante al menos cinco minutos. Luego, incube la placa invertida. Primero, etiquete la placa de agar adecuadamente. Abra la tapa de la placa de agar. Luego abra el recipiente de cuentas de vidrio preesterilizadas y encienda el borde. Dispense con cuidado de 10 a 12 perlas de vidrio estériles en una placa de agar. Cierre la tapa de la placa y encienda el borde del recipiente de cuentas de vidrio antes de volver a colocar la tapa. Ahora, pipetea la muestra en el centro del agar. Con un movimiento horizontal, agite suavemente las perlas a través de la superficie del agar siete veces. Si se hace correctamente, el procedimiento suena como agitar maracas. Gire el plato 60 grados y agite horizontalmente nuevamente siete veces. Nuevamente, gire la placa 60 grados y repita la agitación. Verifique que la muestra se absorba. Luego, vierta las perlas contaminadas en un vaso de precipitados de recolección marcado que contenga un 10% de lejía con cloro. Incubar la placa invertida. El ensayo de placa se usa comúnmente para detectar y cuantificar fagos bacterianos. Cultive las bacterias indicadoras hasta la fase exponencial y guárdelas en hielo. Luego, etiquete dos tubos de microcentrífuga estériles como fago y control y agregue 50 microlitros de muestra de fago o tampón respectivamente a cada uno. A continuación, agite el cultivo bacteriano en el matraz, luego transfiera una alícuota de bacterias a un tubo estéril y agite suavemente las bacterias indicadoras, luego agregue 500 microlitros de bacterias a cada tubo de absorción. Mezclar moviendo suavemente los tubos. Nunca pipetee muestras de fagos en vórtices ni pipetee vigorosamente. Incube la mezcla de bacterias del fago a una temperatura apropiada para la cepa indicadora durante 20 minutos. Mientras tanto, transfiera dos tubos de agar blando de un baño de agua a 55 grados Celsius a un bloque calefactor de 48 grados Celsius. Equilibre durante 10 minutos. Etiquete dos placas de agar duro de nutrientes libres de condensación preequilibradas a temperatura ambiente. Retire un tubo de agar blando del bloque de calor y verifique que el contenido no esté demasiado caliente para tocarlo. A continuación, transfiera asépticamente la mezcla del tubo de absorción de fagos al tubo de agar blando. Luego, gire rápidamente entre las palmas para mezclar el contenido. Con el tubo en una mano, abra la tapa de la placa de agar duro con la otra mano. Vierta inmediatamente todo el contenido del tubo sobre la superficie de una placa de agar duro. Agita el plato rápida y suavemente. Cierre la tapa y coloque el plato nivelado durante 30 minutos hasta que el agar blando se solidifique. A continuación, repita el procedimiento para el tubo de absorción de control transfiriendo la mezcla de control a un tubo de agar blando. Mezclándolo, vertiendo el contenido en una placa de agar duro, balanceándola y dejando que el agar blando se solidifique durante 30 minutos. Inspeccione las placas para detectar la formación de placa. Para aislar una placa de una mezcla heterogénea, golpee con cuidado el centro con un palillo de dientes estéril y transfiera el inóculo a un tubo de microcentrífuga estéril que contenga 100 microlitros de tampón de fagos. Continúe purificando este lisado repitiendo el ensayo de placa de tres a seis veces con diluciones en serie según sea necesario. La placa de réplica explota un fenotipo seleccionable al permitir la comparación del crecimiento celular en una placa primaria con placas secundarias. Marque una cuadrícula en la parte inferior de la placa, etiquete la placa principal y numere los cuadrados resultantes. Ahora, use una técnica aséptica para quitar un palillo de dientes preesterilizado del vaso de precipitados, frote el centro de cada cuadrado con una muestra de células y deseche el palillo en un recipiente de desechos apropiado. Incuba la placa primaria. Apila la placa primaria y todas las placas secundarias. Coloque una marca de orientación en el costado de la mitad inferior de las placas. Ahora retire un paño de terciopelo estéril de su envoltura y colóquelo sobre el bloque cilíndrico. A continuación, coloque el soporte alineando las marcas del soporte con las del bloque. Tenga en cuenta la marca de orientación en el bloque y el soporte. A continuación, retire la tapa de la placa principal. Alinee las marcas de orientación en la placa y el bloque. Baje la placa para que la superficie del agar entre en contacto con la tela de terciopelo. Con las yemas de los dedos, presione ligera pero uniformemente la parte posterior de la placa principal y luego levántela con cuidado del bloque. Confirme que la huella de las células se puede ver en el terciopelo. Vuelva a colocar la tapa en el plato. Ahora, repita secuencialmente el protocolo en la tela de terciopelo con cada una de las placas secundarias. Utilice la impresión aterciopelada de las células de la placa primaria para inocular hasta ocho placas secundarias ordenadas de sustrato menos a más favorable. Finalmente, como control positivo, para la última placa de la serie, use medio de agar en el que deben crecer todas las cepas probadas. Pega las placas invertidas e incuba. Inspeccione las placas secundarias para ver si crecen. Apague el quemador Bunsen y luego guarde todos los suministros. Coloque la ropa de laboratorio, los artículos de vidrio y los desechos peligrosos contaminados en el recipiente de eliminación adecuado. Limpie el área de trabajo con desinfectante. Finalmente, lávese bien las manos con jabón antiséptico y agua tibia. Serratia Marcescens es una proteobacteria gramnegativa en forma de bastoncillo que produce un pigmento rojizo llamado prodigiosina. Se encuentra comúnmente creciendo en baños y cortinas de ducha. En este ejemplo, la técnica de placa de rayas genera colonias individuales en el cuarto cuadrante. Este análisis de bacterias presentes en una muestra de agua recolectada de una fuente pública utiliza la técnica Pour Plate. Tenga en cuenta la diferencia en la apariencia de las colonias. Las colonias superficiales son grandes y de forma circular, mientras que algunas colonias superficiales son muy pequeñas y de forma irregular. La técnica de placa extendida es un componente importante en los experimentos de enriquecimiento, selección y cribado. Por ejemplo, el método copacabana es una herramienta diferenciadora en la clásica pantalla azul-blanca en la tecnología de ADN recombinante. El fago T4 es un fago virulento de ADN bicatenario que infecta a su huésped como Escherichia coli para lisar y liberar fagos de progenie. Este ensayo de placa en agar EHA muestra fagos en zonas de aclaramiento de aproximadamente un milímetro de diámetro. En ausencia de partículas de fagos infectantes, el crecimiento bacteriano da como resultado una suspensión turbia de células en el agar blando en la que no se ven colonias discretas. En la técnica de recubrimiento de agar blando, las morfologías de la placa varían. Por ejemplo, aquí la misma cepa huésped de micobacterias produce distintas morfologías de placa en presencia de destructores de fagos de microbacterias frente a los fagos de micobacterias MSSS. El poder del recubrimiento de réplica está en la detección simultánea de una gran cantidad de microorganismos. En este caso, se probaron cuatro cepas de pseudomonas por duplicado para el crecimiento en tres fuentes de carbono diferentes. Acetamida, lactosa y glicina. Aquí, la placa primaria es un medio YTA completo inoculado con las cuatro cepas como se indica. Las cepas muestran patrones de crecimiento variables en placas de réplica de medio MSA mínimo suplementado con una sola fuente de carbono acetamida, lactosa o glicina. Todas las cepas crecen en la última placa de control positivo que confirma que las células se transfirieron a todas las placas secundarias de esta serie. La tabulación de los resultados de estas réplicas de placas detalla el cribado simultáneo de las diferentes cepas de tipo salvaje para determinar los requisitos de crecimiento característicos.

- Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar procedimientos de siembra sin contaminar medios o cultivos y también utilizar el método de siembra apropiado para cualquier tarea experimental dada en el laboratorio. Dominar estas técnicas requiere práctica. Sin embargo, con la capacitación adecuada, los procedimientos de recubrimiento descritos en este video se convertirán en una segunda naturaleza cuando se trabaje en la mesa de laboratorio.