Name: 무균 실험실 기술 : 도금 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min
Description: 학습하세요 미생물 도금 기술을 통해 세균과 파지를 분리하고 계수하는 무균 실험 방법을 익히세요. 이 기술은 순수 배양 분리와 미생물 연구에 필수적입니다.

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샘플 문화권을 설정하고 그림과 함께 지원을 위해 그림을 준비하고 크리스 Reddi와 UCLA의 Bhairav​​ 샤에 대한 Iroc 설계에서 Cori 샌더스에 대한 특별 감사합니다. 이 프로젝트에 대한 자금 지원은 HHMI (HHMI 그랜트 번호 52006944)에 의해 제공되었다.

<ol><li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarker%2C+K+%22At+the+Bench%3A+A+Laboratory+Navigator%22">At the Bench: A Laboratory Navigator</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1998).</li>
<li>US Department of Health and Human Services (DHHS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+Microbiological+And+Biomedical+Laboratories+%28BMBL%29%22">Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th, U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> (2009).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li>
<li>Fields, B. N., Knipe, D. M., Chanock, R. M., Hirsch, M. S., Melnick, J. L., Monath, T. P., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFields%2C+BN+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. 1, 2nd, Raven Press. New York, NY. (1991).</li>
<li>Gilbert, R. A., Ouwerkerk, D., Zhang, L. H., Klieve, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Research+Center+for+Beef+Genetic+Technologies.+In+vitro+detection+and+primary+cultivation+of+bacteria+producing+materials+inhibitory+to+ruminal+methanogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cooperative Research Center for Beef Genetic Technologies. In vitro detection and primary cultivation of bacteria producing materials inhibitory to ruminal methanogens.</a> Journal of Microbiological Methods. 80, 217-218 (2010).</li>
<li>Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+agar+plate+method+for+quantifying+viable+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria.</a> BioTechniques. 23, 648-650 (1997).</li>
<li>Karam, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaram%2C+JD+%22Molecular+Biology+of+Bacteriophage+T4%22">Molecular Biology of Bacteriophage T4</a>. , ASM Press. Washington, DC. (1994).</li>
<li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A., Roizman, B., Straus, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fundamental+Virology%22">Fundamental Virology</a>. , 4th, Lippincott, Williams, and Wilkins. Philadelphia, PA. (2001).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JH+%22A+Short+Course+in+Bacterial+Genetics%3A+A+Laboratory+Manual+and+Handbook+for+Escherichia+coli+and+related+bacteria%22">A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and related bacteria</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1992).</li>
<li>Mills, K. V., Gareau, J. R., Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+modification+to+the+Copacabana+method+for+spreading+transformation+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Low-cost modification to the Copacabana method for spreading transformation mixtures.</a> BioTechniques. 39, 188(2005).</li>
<li>Jordan, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJordan%2C+T+%22RESEARCH%3A+National+Genomics+Research+Initiative+Phage+Resource+Laboratory+Manual%22">RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual</a>. , Howard Hughes Medical Institute. (2008).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning - A Laboratory Manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Sanders, E. R., Miller, J. H. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanders%2C+ER+%22Microbiologist%3A+A+Discovery-based+Course+in+Microbial+Ecology+and+Molecular+Evolution%22">Microbiologist: A Discovery-based Course in Microbial Ecology and Molecular Evolution</a>. , ASM Press. Washington, DC. (2010).</li>
<li>Slonczewski, J. L., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlonczewski%2C+JL+%22Microbiology+-+An+Evolving+Science%22">Microbiology - An Evolving Science</a>. , 2nd, W.W. Norton & Co., Inc. New York, NY. (2011).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+Red-Polysaccharide+Interactions+in+Enumeration+and+Characterization+of+Cellulolytic+Bacteria+from+the+Bovine+Rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Wise, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWise%2C+K+%22Preparing+Spread+Plates+Protocols%22">Preparing Spread Plates Protocols</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols">http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols</a> (2006).</li>
<li>Worthington, M., Luo, R. Q., Pelo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copacabana+method+for+spreading+E.+coli+and+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Copacabana method for spreading E. coli and yeast colonies.</a> BioTechniques. 30, 738-742 (2001).</li>
<li>American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/</a> (2012).</li>
<li>EPA Microbiology Home Page. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html">http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html</a> (2012).</li>
<li>The GENE Project: Laboratory Methods and Materials. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html">http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html</a> (2012).</li>
<li>Joint Genome Institute (JGI) Genome Sequencing Protocols: Library Plating Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html">http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html</a> (2012).</li>
<li>Microbial Genetics (maintained by Stanley Maloy at UCSD). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics">http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics</a> (2012).</li>
<li>Organization of American States (OAS) Department of Sustainable Development (DSD). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm">http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm</a> (2012).</li>
<li>Public Health Agency of Canada: Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss">http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss</a> (2012).</li>
<li>United States Environmental Protection Agency (EPA) Office of Water. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov">http://water.epa.gov</a> (2012).</li>
<li>American Society for Microbiology (ASM)'s Curriculum Recommendations Microbiology Majors Program. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html">http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html</a> (2012).</li>
<li>Introductory Course in Microbiology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html">http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html</a> (2012).</li>
</ol>

나는 공개 할게 없다.

Culturing의 미생물 무균 기술은 세포와 미디어의 조작에 걸쳐 유지하는 것이 필요한 모든 중 도금 방법의 수를 포함한다. 다섯 가지 절차는이 프로토콜에서 설명되었다. 이러한 도금 기법은 일상적으로 세균과 파지를 조작하는 데 사용하고 있지만, 그들은 또한 (일반적으로 같은 효모 (즉, Saccharomyces의 cerevisiae, 칸디다 albicans, Schizosaccharomyces의 pombe), 해조류 등 분자 유전학에서 사용하고 원생 동물문 포유 동물 세포 배양 및 진핵 미생물에 적용할 수 즉, Volvox, Chlamydomonas, 아메바, Paramecium) 및 nematodes (즉, Caenorhabditis elegans). 또한 연구 미만 실험 목표 또는 유기체에 따라 각각의 도금 방법의 다양한 (그리고 훨씬 더 정교한) 차이가 있습니다. 그러므로, 그것은 단지 방법론 같은 T를 주어진 실험 또는 대상 미생물에 가장 적합한 기술을 선택할뿐만 아니라 봉제에하지하는 것이 중요모자 실험 결과는 적절한 연구 질문이나 문제를 해결합니다. 이 프로토콜에서 언급한 도금 기술의 최신 애플 리케이션 중 일부는 선별 및 약물 발견 실험에 대한 높은 처리량 결과를 얻을 기술 진보를 포함. 예를 들어, 게놈 시퀀싱 센터 E.되는, 확산 도금 클론 라이브러리에 대해 &quot;Copacabana 방법&quot;을 사용 대장균 세포는 미생물의 게놈으로부터 파생된의 DNA 조각을 포함하는 plasmids으로 바꾸었다. 큰 접시 수십개이 (bioassay 트레이라고도 함) 한번에 준비가되어 있기 때문에, 자동 번호판 뿌리는 쟁반의 전체 배치를 위해 유리 구슬을 떨쳐낼하는 데 사용됩니다. 또한, 부화에 따라 다음과 접시에서 콜로니를 선택할 때, 로봇 식민지 따는 사람은 384 잘 microplates의 LB의 국물을위한 inoculum 따라 식민지에서 세포를 수집하는 데 사용됩니다. 이러한 높은 처리량 심사 분석, 확산-P의 절차적 원칙에 대한늦은 기법이 적용될 수 있지만 기술은 여러 단계가 자동화되어 있으며 동시에 짧은 시간 내에 분석해야 할 시료의 큰 숫자를 허용하도록 조정 수 있습니다. 생명 공학 및 제약 회사들은 미생물학과 분자 유전학의 가장 기본적인 기술에 대한 높은 처리량 기술 개발에 상당한 자원을 투자합니다. 예를 들어, 최대 한번에 8 또는 12 샘플에 대해 볼륨 전송을 수행하는 멀티 채널 micropipettors가 없습니다. 심지어 로봇 워크 스테이션 그 책략 96 채널 피펫 머리가있다! 이러한 노력은 실험과 관련된 기계적인 작업을 수행하기 위해 필요한 장비를 개발할 수 있습니다 엔지니어와 컴퓨터 프로그래머가 방법론적인 전문 지식을 가진 생물학 자 페어 링, 과학자의 멀티 징계 팀을 포함됩니다. 에 관계없이 연구에 응용 프로그램의 이러한 기술을 개발 회사에 의해 공동 목표는 동일 - laborato를 자동화공예 프로세스, 도구, 시스템 및 악기, 그들 집중 적은 노동과 더 효율적인.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1입니다. 효모 트립톤 한천(YTA)
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>효모 추출물</td>
			<td>2.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트립톤</td>
			<td>10.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>한천</td>
			<td>15.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>증류수</td>
			<td>최대 1000.0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7.0</td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
121°Cød의 오토클레이브; C에서 20분 동안 살균합니다. 4°C.</p에 보관하십시오>
 붓는 플레이트 절차를 위해 튜브를 준비하는 경우 한천을 ~55&deg까지 식히십시오. C를 첨가한 다음 2.0ml의 50mg/ml 사이클로헥시미드를 첨가합니다. 18mm 튜브당 녹은 한천 18.0ml를 무균 적으로 분배한 다음 4°C에서 보관합니다. 한천은 굳어지므로 사용하기 전에 찜기나 전자레인지에서 녹여야 합니다.
2. 최소 염분 한천(MSA) + 0.1%(w/v) 탄소원
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>1.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH2HPO4&bull; 2H2O</td>
			<td>2.14 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1.09g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>0.2g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>탄소 공급원*</td>
			<td>1.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>미량염 용액**</td>
			<td>10.0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>한천</td>
			<td>15.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>증류수</td>
			<td>최대 1000.0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7.0</td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
121°Cød의 오토클레이브; C에서 20분 동안 살균합니다. 4°C.</p에 보관하십시오>
* 그림 13에 제시된 실험에 사용되는 탄소원에는 아세트아미드, 유당 및 글리신이 포함됩니다.
** 미량염 용액은 다음과 같이 0.1N HCl에서 제조됩니다. 멸균 전에 베이스에 첨가됩니다(121&deg에서 오토클레이브; C 20분).
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>FeSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>300.0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&bull; 4H2O</td>
			<td>180.0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co(NO3)2&bull; 6H2O</td>
			<td>130.0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>40.0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2MoO4</td>
			<td>20.0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&bull; 5H2O</td>
			<td>1.0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1000.0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl(0.1N)</td>
			<td>최대 1000.0 ml</td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
3입니다. EHA 연질 한천 (0.65 % w/v)
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>한천</td>
			<td>6.5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>트립톤</td>
			<TD>13.0g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NaCl</td>
			<td>8.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Na 구연산염&bull; 2H2O</td>
			<td>2.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>포도당</td>
			<td>3.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>증류수</td>
			<td>최대 1000.0 ml</td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
121°Cød의 오토클레이브; C에서 20분 동안 살균합니다. 4°C.</p에 보관하십시오>
4입니다. EHA 경천 (1.2% w/v)
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>한천</td>
			<td>12.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트립톤</td>
			<TD>13.0g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td> 8.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na 구연산염&bull; 2H2O</td>
			<td> 2.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>포도당</td>
			<td> 3.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>증류수</td>
			<td>최대 1000.0 ml</td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
121°Cød의 오토클레이브; C에서 20분 동안 살균합니다. 4°C.</p에 보관하십시오>
5입니다. 1X 미들브룩 탑 한천(MBTA 연질 한천, 0.5% w/v)
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>100 mM CaCl2 재고*</td>
			<td> 1ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 액체 매체: 깔끔한 **</td>
			<td>50ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2XTA ***</td>
			<td>50ml</td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
2XTA 50ml를 녹이고 ~55°C까지 식힙니다. 무균 기술을 사용하여 녹인 한천에 CaCl2 및 7H9 국물을 첨가합니다. 13mm 튜브당 4.5ml의 혼합물을 무균 분배하고 55°C에 보관합니다. C 인큐베이터 &#8804; 7일. MBTA를 실온 또는 4°C로 냉각; C는 CaCl2가 용액에서 침전되도록 합니다.
* 100mM CaCl2. CaCl2가 용액에서 침전되는 것을 방지하기 위해 스톡은 실온에서 보관해야 합니다.
** 7H9 액체 매체: 깔끔한
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>7H9 국물 베이스</td>
			<TD>4.7g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% 글리세롤 스톡</td>
			<td>5ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>증류수</td>
			<td>최대 900.0ml</td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
베이스를 물과 섞은 다음 저으면서 글리세롤을 첨가합니다. 121도 오토클레이브; C에서 20분 동안 살균합니다. 4°C.</p에 보관하십시오>
*** 2X 미들브룩 탑 한천(2XTA, 1.0% w/v)
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>7H9 국물 베이스</td>
			<TD>4.7g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>한천</td>
			<td>1.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>증류수</td>
			<td>최대 1000.0ml </td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
121°Cød의 오토클레이브; C에서 20분 동안 살균합니다. 50ml 분취량을 100ml 병에 분배하고 4°C에서 보관합니다. 
6. Middlebrook 7H10 한천 플레이트(MHA 경질 한천, 1.9% w/v)
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>7H10 한천 베이스</td>
			<TD>19.0 g</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% 글리세롤 스톡</td>
			<td>12.5ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>증류수</td>
			<td>887.5 ml</td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
한천 베이스를 물과 섞은 다음 저어주면서 글리세롤을 첨가합니다. 용액을 끓일 때까지 가열한 다음 1분 동안 저어서 기본 분말을 완전히 녹입니다. 121도 오토클레이브; C에서 20분 동안 살균합니다. 한천을 ~55°C까지 식히십시오. C는 다음 시약을 무균 상태로 추가합니다.
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>AD 보충제(37°C로 예열; C)*</td>
			<td>100ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mg/ml 카르베니실린 **</td>
			<td>1.0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/ml 사이클로헥시미드 **</td>
			<td>1.0 ml</td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
* AD 보충
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>NaCl > </td>
			<td>17 그램 > </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>알부민(분획 V)> </td>
			<td>100g> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>포도당(D-포도당)> </td>
			<td>40g> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>증류수> </td>
			<td>최대 2000.0 ml> </td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
이 용액을 필터링 멸균하십시오. 오토클레이브하지 마십시오. 4°C.</p에 보관하십시오>
** 이러한 용액을 여과-멸균하여 4°C에 보관합니다. C는 &le; 60일.
7. LB 한천(1.5% w/v) + X-Gal(60 &mu; g/ml)
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>트립톤</td>
			<td>10.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>효모 추출물</td>
			<td>5.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>10.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>한천</td>
			<td>15.0g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>증류수</td>
			<td>최대 1000.0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7.5(25도에서); C</td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
121°Cød의 오토클레이브; C에서 20분 동안 살균합니다. 한천을 ~55°C까지 식히십시오. 그런 다음 C 20mg/ml X-Gal 용액 3.0ml를 무균적으로 첨가합니다. 400mg X-Gal을 20ml 디메틸포름아미드(DMF)에 녹여 X-gal 스톡을 신선하게 준비합니다. 
특정 시약 표:
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>시약 이름</td>
			<td>회사</td>
			<td>카탈로그 번호</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>효모 추출물</td>
			<td>벡턴 디킨슨</td>
			<td>212750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트립톤</td>
			<td>벡턴 디킨슨</td>
			<td>211705</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>한천</td>
			<td>벡턴 디킨슨</td>
			<td>214030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>아크로스 오가닉스</td>
			<td>123340010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH2HPO4&bull; 2H2O</td>
			<td>시그마-알드리치</td>
			<TD>30435</TD>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>피셔 사이언티픽</td>
			<td>BP 303-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>시그마-알드리치</td>
			<td>230391 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>아세트아미드</td>
			<td>시그마-알드리치 </td>
			<td>A-0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>유당</td>
			<td>피셔 사이언티픽 </td>
			<td>L6-500 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>글리신</td>
			<td>시그마-알드리치</td>
			<td>G-7126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>시그마-알드리치</td>
			<td>F8048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&bull; 4H2O</td>
			<td>시그마-알드리치</td>
			<td>M-3634</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co(NO3)2&bull; 6H2O</td>
			<td>시그마-알드리치</td>
			<td>230375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>시그마-알드리치</td>
			<td>Z4750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2MoO4</td>
			<td>아크로스 오가닉스</td>
			<td>213621000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&bull; 5H2O</td>
			<td>시그마-알드리치</td>
			<td>209198 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>시그마-알드리치</td>
			<td>C1016 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>피셔 사이언티픽</td>
			<td>A144-212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>사이클로헥시미드</td>
			<td>시그마</td>
			<td>038K1561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>카르베니실린</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>46-100-RG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>피셔</td>
			<td>S271-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na 구연산염&bull; 2H2O</td>
			<td>피셔</td>
			<td>S279-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>포도당(포도당)</td>
			<td>BD</td>
			<td>215530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 국물 베이스</td>
			<td>BD</td>
			<td>271310</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10 한천 베이스</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>글리세롤</td>
			<td>쉘튼</td>
			<td>IB15760</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>알부민(분획 V)</td>
			<td>피셔</td>
			<td>S71907</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-&#946;-D-갈락토피라노사이드) </td>
			<td>Teknova</td>
			<td>X1205</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>디메틸포름아미드(DMF)</td>
			<td>시그마</td>
			<td>D4551</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>에탄올</td>
			<td>피셔</td>
			<td>CDA19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>염소 표백제</td>
			<td>클로록스</td>
			<td>02490/06644884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CiDecon(소독제)</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>8504</td>
		</tr>
	</몸>
</테이블>
특정 장비 표:
<테이블 테두리="1">
	<본>
		<tr>
			<td>장비 이름</td>
			<td>회사</td>
			<td>카탈로그 번호</td>
			<td>실험</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>금속 루프</td>
			<td>American Educational Products</td>
			<td>S17352</td>
			<td>줄무늬 도금</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>일회용 플라스틱 루프</td>
			<td>피셔</td>
			<td>22-363-602</td>
			<td>줄무늬 도금</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>나무 막대기</td>
			<td>피셔</td>
			<td>23-400-104</td>
			<td>줄무늬 도금</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>플랫 이쑤시개</td>
			<td>American Educational Products</td>
			<td>S67859</td>
			<td>줄무늬 도금</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>턴테이블</td>
			<td>피셔</td>
			<td>08-758Q</td>
			<td>스프레드 도금</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>유리 막대</td>
			<td>벨코 유리</td>
			<td>NC9004380</td>
			<td>스프레드 도금</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4mm 유리 구슬</td>
			<td>피셔</td>
			<td>11-312B</td>
			<td>스프레드 도금</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>벨벳 천</td>
			<td>Bel-Art 제품</td>
			<td>09-718-2</td>
			<td>복제 도금</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>원통형 블록</td>
			<td>Bel-Art 제품</td>
			<td>09-718-1</td>
			<td>복제 도금</td>
		</tr>
	</몸>
</테이블></td></tr></tbody></table>

무균 실험실 기술 : 도금 방법

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

미생물 실험실에서 가능한 오염의 유비 쿼터스 소스를 만들고 모든 생명이없는 표면에 존재한다. 실험 성공은 작업 표면 및 장비를 소독뿐만 아니라 비 멸균 표면 살균 장비와 솔루션의 접촉을 방지하기 위해 과학자의 능력에 의존하고 있습니다. 여기에서 우리는 정기적으로, 고립 전파, 또는 세균과 파지와 같은 미생물을 열거하기 위해 실험실에서 사용되는 여러 가지 도금 방법에 대한 단계를 제시한다. 다섯 가지 방법 무균 기술, 또는 실험 재료의 불임을 유지 절차를 포함. 설명된 절차는 단일 콜로니를 분리하기 (1) 탄력 - 도금 세균성 문화, (2) 붓다 - 도금 (3) 확산 도금 가능한 세균성 식민지를 열거하기 위해, 파지 및 열거 plaques를 분리하기 (4) 부드러운 한천 오버레이, 및 (포함 5) 복제 - 도금을 한 판에서 동일한 공간적 패턴에서 다른 세포를 전송할 수 있습니다. 이러한 절차는 t에서 수행할 수그는 실험실 벤치는 그들이 미생물의 비 병원성 변종을 (Biosafety 레벨 1, BSL-1) 참여 제공. BSL-2 생물과 협력한다면, 이러한 조작은 biosafety 캐비닛에서 개최한다. 생물 학적 분류는 물론 문제의 미생물에 필요한 안전 조치 및 억제 시설을 결정하는 감염성 물질에 대한 최신 미생물 및 바이오 메디컬 연구소의 Biosafety의 판 (BMBL)뿐만 아니라 재료 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조하십시오. 박테리아 변종과 파지 주식 같은 미국 유형 문화 수집 (ATCC)와 같은 특정 단체에 의해 관리 연구 조사관, 회사 및 컬렉션에서 얻을 수있다. 그것은 여러 가지 도금 방법을 배우고 비 병원성 종자를 사용하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에서 설명한 절차에 따라, 학생들은 수 있어야합니다 : <ul><li> contaminati없이 도금 절차를 수행NG 미디어. </li><li> 줄무늬-도금 방법으로 단일 세균성 식민지를 분리. </li><li> 박테리아의 농도를 결정 부어 - 도금 및 확산 도금 방법을 사용합니다. </li><li> 파지 작업시 부드러운 한천 오버레이를 수행합니다. </li><li> 한 접시의 복제 - 도금 절차를 사용하여 다른 세균 세포를 전송합니다. </li><li> 실험적인 작업을 감안할 때, 적절한 도금 방법을 선택합니다. </li></ul>

문화 미생물에 사용되는 미디어 및 시약과 함께 작업할 경우 무균 기술은 오염을 최소화하기 위해 실천해야합니다. 도금 방법의 다양한 정기적으로, 고립 전파, 또는 열거 세균 및 파지, 실험 재료의 불임을 유지 절차를 포함 모두의하는 데 사용됩니다.

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

[해설자] 본 프로토콜은 박테리아 및 파지와 같은 미생물을 분리, 증식 또는 계수하는 데 사용되는 도말법의 무균 조작법을 다룹니다. 절차에는 단일 콜로니를 분리하기 위한 박테리아 배양액의 획선 도말법(streak plating), 박테리아 농도를 결정하기 위한 부어 넣기 도말법(pour plating), 그리고 생존 박테리아 콜로니를 계수하기 위한 도말 평판법(spread plating)이 포함됩니다. 연한 한천 층(soft agar overlay)은 파지를 분리하고 플라크(plaque)를 계수하는 데 사용되며, 복제 도말법(replica plating)은 세포를 동일한 공간적 패턴으로 한 플레이트에서 다른 플레이트로 옮기는 방법입니다. 결과적으로, 이러한 미생물 배양 기술의 실제 응용 분야는 환경 내 박테리아 식별부터 분자 유전학 및 고속 대량 분석(high throughput bioassays)의 기술적 진보에 이르기까지 다양합니다.- 일반적으로 이러한 도말법에 익숙하지 않은 개인은 비멸균 표면과의 접촉을 피하면서 신중하고 조율된 움직임으로 조작해야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이러한 일상적인 절차를 익히기 위해서는 교육과 연습이 필요합니다. 실험실 코디네이터인 Kris Reddi 박사가 해당 절차를 시연하겠습니다.- [Narrator] 바이오하자드 분류, 폐기물 멸균 및 처리 방법을 포함한 실험실 수칙과 안전 주의 사항을 숙지하여 미생물 실험을 시작하십시오. 도말 절차에 필요한 모든 기구, 용액 및 배지가 멸균되었는지 확인하십시오. 또한 깨끗한 작업 공간을 확보하고 소독제로 닦아내십시오. 가스 라인에 연결된 튜브가 달린 분젠 버너를 설치하고, 적절하게 라벨이 붙은 필수 소모품들을 준비하십시오. 항균 비누와 따뜻한 물로 손을 깨끗이 씻으십시오. 먼저 흐르는 따뜻한 물에 손을 적신 다음 비누를 칠해 충분히 거품을 냅니다. 엄지손가락, 손가락 등, 손등, 손톱 밑을 포함한 모든 표면에 마찰이 생기도록 강하게 문지릅니다. 그 다음 남은 비누가 없도록 깨끗이 헹구고 홀더에서 꺼낸 종이 타월로 물기를 닦으십시오. 마지막으로 새 종이 타월을 사용하여 수도꼭지를 잠급니다. 획도말법(Streak Plate Procedure)은 단순한 기계적 분리를 통해 혼합 집단으로부터 박테리아의 순수 배양물, 즉 단일 콜로니(colony)를 분리하기 위해 설계되었습니다. 4°C 냉장 보관함에서 한천 배지 플레이트를 꺼내 실온에서 미리 예열하십시오. 플레이트 도말에 사용할 도구 세트에서 적절한 도구를 선택하십시오. 플레이트 뚜껑에 응결수가 없이 건조한지 확인하십시오. 한천 플레이트 바닥의 가장자리를 따라 라벨을 붙입니다. 숙련된 경우 하나의 플레이트에 여러 샘플을 사용할 수 있습니다. 그런 다음 분젠 버너에 불을 붙여 금속 루프를 화염 멸균합니다. 금속 루프에서 3~4인치 떨어진 곳에서 시작하여, 분젠 버너 화염의 가장 뜨거운 부분인 파란색 원뿔 끝부분에 와이어를 넣습니다. 금속이 빨갛게 달구어지면 루프 쪽에 화염이 닿도록 와이어를 움직입니다. 루프를 식히기 위해 한천 배지의 가장자리에 접촉시키면 지지직거리는 소리가 납니다. 루프에 접종균(inoculum)을 묻힙니다. 플레이트의 하단 절반을 들어 올립니다. 플레이트의 첫 번째 사분면에서 가장자리부터 중심까지 루프를 앞뒤로 움직입니다. 뒤집힌 플레이트를 다시 뚜껑 위에 내려놓습니다. 금속 루프를 다시 화염 멸균합니다. 페트리 접시를 90도 회전시킵니다. 첫 번째 사분면의 마지막 획의 끝부분 근처에 루프를 대고 앞뒤 패턴을 사용하여 이전 획의 마지막 절반과 교차시킨 후, 비어 있는 두 번째 사분면으로 이동합니다. 두 번째 사분면을 다 채우면 플레이트를 내려놓습니다. 첫 번째 사분면과의 접촉을 피하면서 세 번째와 네 번째 사분면에 대해서도 도말 절차를 반복합니다. 멸균된 평평한 이쑤시개로 도말할 때는 좁은 끝부분을 엄지와 약지 사이에 잡고 배지와 10~20도 각도를 유지하며, 넓은 끝부분을 사용하여 각 사분면을 도말합니다. 사분면 사이에서는 플레이트를 다시 뚜껑 위에 뒤집어 놓고 이쑤시개를 적절하게 폐기하십시오. 도말된 플레이트를 뒤집어 배양합니다. 주입평판법(Pour Plate Procedure)은 단일 플레이트의 표면과 한천 내부의 총 콜로니 형성 단위(CFU) 수를 측정합니다. 타이머를 10분으로 설정한 후, 55°C 항온수조에 있던 18mL의 융해된 한천 배지를 48°C 열블록으로 옮겨 10분 동안 평형을 맞춥니다. 멸균된 페트리 접시 바닥에 라벨을 붙입니다. 필요한 경우 희석 배수를 기재하십시오. 이제 페트리 접시 중앙에 샘플 1mL를 분주합니다. 뚜껑을 닫습니다. 융해된 한천 튜브의 캡을 제거하고 열린 튜브의 입구를 화염에 통과시킵니다. 한천을 페트리 접시에 조심스럽게 붓습니다. 뚜껑을 닫은 후 플레이트를 부드럽게 흔들어 샘플과 한천을 섞습니다. 한천이 응고될 때까지 30분 동안 기다립니다. 한천이 응고되면 플레이트를 뒤집어 따뜻한 방에 둡니다. 도말평판법(Spread-plating)은 소량의 샘플 내에 포함된 미생물을 분리하여 결과 콜로니들이 한천 표면에 고르게 분포하도록 하는 것을 목표로 합니다. 플레이트를 실온으로 평형 맞추고 적절하게 라벨을 붙입니다. 플레이트를 턴테이블 위에 놓습니다. 한천 중앙에 샘플 0.1mL를 피펫으로 분주하고 뚜껑을 닫습니다. 팁을 폐기물 용기에 버립니다. 금속 스패더를 70% 에탄올 비커에 담가 스패더의 바닥 전체와 줄기 부분의 처음 1인치까지 덮은 후 꺼내어 흘려보냅니다. 분젠 버너의 화염에 통과시켜 과잉 에탄올을 연소시킵니다. 다음으로 한천 플레이트의 뚜껑을 열고, 가장자리 근처의 한천에 스패더를 접촉시켜 식힙니다. 턴테이블을 천천히 회전시킵니다. 스패더를 한천 표면에 부드럽게 대고, 턴테이블이 회전하는 동안 앞뒤 동작을 사용하여 샘플을 플레이트 전체에 점진적으로 고르게 펴 바릅니다. 뚜껑을 닫고 샘플이 완전히 흡수되도록 최소 5분 동안 둡니다. 그런 다음 뒤집은 플레이트를 배양합니다. 먼저 한천 플레이트에 적절히 라벨을 붙입니다. 한천 플레이트의 뚜껑을 엽니다. 그런 다음 미리 멸균된 유리 구슬 용기를 열고 입구를 화염 멸균합니다. 한천 플레이트에 10~12개의 멸균 유리 구슬을 조심스럽게 분주합니다. 플레이트 뚜껑을 닫고, 캡을 닫기 전 유리 구슬 용기의 입구를 다시 화염 멸균합니다. 이제 한천 중앙에 샘플을 피펫으로 분주합니다. 수평 방향으로 유리 구슬을 한천 표면 위에서 7회 부드럽게 흔듭니다. 제대로 수행되면 마라카스를 흔드는 것과 같은 소리가 납니다. 플레이트를 60도 회전시키고 다시 7회 수평으로 흔듭니다. 다시 플레이트를 60도 회전시키고 흔드는 과정을 반복합니다. 샘플이 흡수되었는지 확인합니다. 그런 다음 오염된 구슬을 10% 염소 표백제가 들어 있는 표시된 수집 비커에 붓습니다. 뒤집은 플레이트를 배양합니다. 플라크 분석법(plaque assay)은 일반적으로 박테리오파지를 검출하고 정량화하는 데 사용됩니다. 지시 박테리아를 대수 증식기까지 배양하여 얼음에 보관합니다. 그런 다음 두 개의 멸균 마이크로 원심분리 튜브에 'phage'와 'control'이라고 라벨을 붙이고, 각각 파지 샘플 또는 버퍼 50µL를 첨가합니다. 다음으로 플라스크 안의 박테리아 배양액을 흔든 후, 박테리아 일부를 멸균 튜브로 옮겨 지시 박테리아를 부드럽게 볼텍싱(vortex)하고, 각 흡착 튜브에 박테리아 500µL를 첨가합니다. 튜브를 가볍게 튕겨 섞습니다. 파지 샘플을 절대 볼텍싱하거나 강하게 피펫팅하지 마십시오. 파지-박테리아 혼합물을 지시 균주에 적합한 온도에서 20분 동안 배양합니다. 그동안 55°C 항온수조에서 소프트 아가(soft agar) 튜브 두 개를 48°C 가열 블록으로 옮깁니다. 10분 동안 평형을 맞춥니다. 실온으로 미리 예열된 응결수가 없는 영양 하드 아가(hard agar) 플레이트 두 개에 라벨을 붙입니다. 가열 블록에서 소프트 아가 튜브를 꺼내 내용물이 만지기에 너무 뜨겁지 않은지 확인합니다. 다음으로 파지 흡착 튜브의 혼합물을 소프트 아가 튜브로 무균적으로 옮깁니다. 그런 다음 손바닥 사이에서 빠르게 회전시켜 내용물을 섞습니다. 한 손에 튜브를 잡고 다른 손으로 하드 아가 플레이트의 뚜껑을 엽니다. 즉시 튜브의 전체 내용물을 하드 아가 플레이트 표면에 붓습니다. 플레이트를 빠르게 그리고 부드럽게 흔듭니다. 뚜껑을 닫고 소프트 아가가 응고될 때까지 수평한 곳에 30분 동안 둡니다. 다음으로 대조군 흡착 튜브에 대해서도 동일한 절차를 반복합니다. 대조군 혼합물을 소프트 아가 튜브로 옮기고, 섞고, 하드 아가 플레이트에 부어 흔든 뒤, 소프트 아가가 30분 동안 응고되도록 합니다. 플레이트에서 플라크(plaque) 형성을 확인합니다. 불균일한 혼합물에서 플라크를 분리하려면, 멸균된 이쑤시개로 중심부를 조심스럽게 찌르고 접종균을 100µL의 파지 버퍼가 들어 있는 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 필요한 경우 연속 희석과 함께 플라크 분석법을 3~6회 반복하여 이 용해물(lysate)을 계속 정제합니다. 복제 도말법(Replica plating)은 1차 플레이트의 세포 성장과 2차 플레이트의 성장을 비교함으로써 선택 가능한 표현형을 활용하는 방법입니다. 플레이트 바닥에 격자를 표시하고, 1차 플레이트에 라벨을 붙인 후 생성된 각 사각형에 번호를 매깁니다. 이제 무균 조작법을 사용하여 비커에서 미리 멸균된 이쑤시개를 꺼내 각 사각형의 중심을 세포 샘플로 찍고, 이쑤시개를 적절한 폐기물 수거함에 버립니다. 1차 플레이트를 배양합니다. 1차 플레이트와 모든 2차 플레이트를 쌓습니다. 플레이트 하단 측면에 방향 표시를 합니다. 이제 포장지에서 멸균된 벨벳 천을 꺼내 원통형 블록 위에 놓습니다. 다음으로 홀더를 놓아 홀더의 표시와 블록의 표시를 맞춥니다. 블록과 홀더의 방향 표시를 확인하십시오. 다음으로 1차 플레이트의 뚜껑을 제거합니다. 플레이트와 블록의 방향 표시를 맞춥니다. 한천 표면이 벨벳 천에 닿도록 플레이트를 내립니다. 손끝을 사용하여 1차 플레이트 뒷면을 가볍게 그리고 고르게 누른 다음, 블록에서 조심스럽게 들어 올립니다. 벨벳 위에 세포의 각인이 찍혔는지 확인합니다. 플레이트에 뚜껑을 다시 덮습니다. 이제 각 2차 플레이트에 대해 벨벳 천 위에서 이 프로토콜을 순차적으로 반복합니다. 1차 플레이트의 벨벳 세포 각인을 사용하여, 가장 덜 유리한 기질에서 가장 유리한 기질 순으로 배치된 최대 8개의 2차 플레이트에 접종합니다. 마지막으로 양성 대조군으로, 시리즈의 마지막 플레이트에는 테스트된 모든 균주가 성장할 수 있는 한천 배지를 사용합니다. 뒤집은 플레이트들을 테이프로 함께 고정하고 배양합니다. 2차 플레이트의 성장을 확인합니다. 분젠 버너를 끄고 모든 소모품을 정리하십시오. 오염된 실험복, 유리 기구 및 위험 폐기물을 적절한 폐기 용기에 넣으십시오. 작업 구역을 소독제로 닦아냅니다. 마지막으로 항균 비누와 따뜻한 물로 손을 깨끗이 씻으십시오. *Serratia marcescens*는 프로디지오신(prodigiosin)이라는 붉은 색소를 생성하는 그람 음성 간균형 프로테오박테리아입니다. 주로 화장실이나 샤워 커튼에서 자라는 것이 발견됩니다. 이 예시에서 획도말법은 네 번째 사분면에서 단일 콜로니를 생성합니다. 공공 식수대에서 수집한 수돗물 샘플에 존재하는 박테리아 분석에는 주입평판법이 사용되었습니다. 콜로니 외형의 차이에 주목하십시오. 표면 콜로니는 크고 원형인 반면, 일부 표면 콜로니는 매우 작고 불규칙한 모양입니다. 도말평판법은 농축, 선택 및 스크리닝 실험의 중요한 구성 요소입니다. 예를 들어, 코파카바나 방법(copacabana method)은 재조합 DNA 기술의 고전적인 블루-화이트 스크리닝에서 차별화 도구로 사용됩니다. 파지 T4는 독성 이중 가닥 DNA 파지로, 호스트인 *Escherichia coli*를 감염시켜 용해시키고 자손 파지를 방출합니다. EHA 한천에서의 이 플라크 분석은 직경 약 1mm의 투명 구역(zones of clearing)에 파지가 있음을 보여줍니다. 감염성 파지 입자가 없는 경우, 박테리아 성장이 일어나 소프트 아가 내에 세포의 혼탁한 현탁액이 형성되어 개별 콜로니가 보이지 않습니다. 소프트 아가 오버레이 기술에서 플라크의 형태(morphology)는 다양하게 나타납니다. 예를 들어, 여기서는 동일한 마이코박테리아 호스트 균주가 마이코박테리아 파지 destroyers와 마이코박테리아 파지 MSSS가 있을 때 서로 다른 플라크 형태를 생성합니다. 복제 도말법의 위력은 수많은 미생물을 동시에 스크리닝할 수 있다는 점에 있습니다. 이 경우, 4가지 슈도모나스(pseudomonas) 균주를 세 가지 서로 다른 탄소원(아세트아미드, 락토스, 글리신)에서의 성장에 대해 이중으로 테스트했습니다. 여기에서 1차 플레이트는 표시된 4가지 균주가 접종된 완전 YTA 배지입니다. 이 균주들은 단일 탄소원인 아세트아미드, 락토스 또는 글리신이 보충된 최소 MSA 배지 복제 플레이트에서 다양한 성장 패턴을 보입니다. 모든 균주가 마지막 양성 대조군 플레이트에서 성장하여, 이 시리즈의 모든 2차 플레이트로 세포가 성공적으로 옮겨졌음을 확인해 줍니다. 이러한 복제 플레이트 결과의 표 작성을 통해 특성 성장 요구 사항에 대한 서로 다른 야생형 균주의 동시 스크리닝 내용을 상세히 알 수 있습니다.- 이 영상을 시청한 후에는 배지나 배양물을 오염시키지 않고 플레이팅 절차를 수행하는 방법과 실험실의 각 실험 과제에 적합한 플레이팅 방법을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이러한 기술에 능숙해지기 위해서는 연습이 필요합니다. 하지만 적절한 훈련을 거친다면, 이 영상에서 설명하는 플레이팅 절차는 실험실 벤치에서 작업할 때 자연스럽게 익숙해질 것입니다.

aseptic-laboratory-techniques-plating-methods

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

연구실에 근무하면 오염의 소스를 최소화하기 위해 필수적입니다. 무균 기법이 아닌 멸균 표면과 접촉을 피하면서 문화와 시약의 양도를 허용 절차를 말합니다. Serological pipettes 및 micropipettors는 실험에 사용되는 솔루션의 불임을 손상시키지 않고 정확한 볼륨을 측정하는 데 사용됩니다.

무균 실험실 기술 : Serological Pipettes 및 Micropipettors로 볼륨 이동

출처: Koeth, LM, et. al., 호기성 성장 박테리아의 달바반신 체외 감수성 테스트에 대한 참조 국물 미세 희석 방법. J. Vis. 경험. (2015).이 비디오는 그람 양성균에 대한 리포글리코펩타이드 항생제의 최소 억제 농도(MIC)를 결정하기 위한 국물 미세 희석 방법을 보여줍니다. 박테리아 콜로니 분리, 희석, 다양한 항생제 농도의 마이크로플레이트 웰 접종, 배양 순도 및 세포 수 검증을 다룹니다. 이 비디오는 또한 항생제 결합이 세포벽 합성을 방해하여 용해를 유발하는 방법과 눈에 보이는 성장 억제를 기반으로 MIC를 식별하는 방법을 설명합니다.

그람 양성균의 항생제 감수성 시험을 위한 국물 미세 희석 방법

양성 혈액 배양에서 빠른 박테리아 펠렛 제제는 MALDI-TOF에 의해 식별, 그람 염색, 항생제 감수성 시험 및 PCR-기반 테스트와 같은 애플리케이션을위한 샘플로서 이용 될 수있다. 결과는 급속 혈류 감염으로 고통받는 환자의 결과를 개선하기 위해 임상에 통신 될 수있다.

빠른 세균의 식별 및 항생제 감수성 테스트를위한 혈액 문화 펠렛의 제조

이 원고는 일련의 생화학 분석법 외에도 적절한 Vibrio cholerae 유지 기술을 설명하며, 임상 적 및 환경 적 V 사이의 신속하고 안정적인 차별화를 위해 집합 적으로 활용됩니다. 실험실 환경에서 cholerae biotypes.

생물학적 유형을 유지하고 차별화하기 위해 사용되는 실험실 기술<em&gt; 콜레라 비브리오</em&gt; 임상 적 및 환경 적 분리 물

이 프로토콜 사용 장 병원 체 부착, 세포 외 고분자 물질 매트릭스 형성, 평가 하 여 박테리아 biofilms의 동적 특성을 잡으려고 다각적인 접근을 사용 하 여 담 즙 소금 유도 biofilm 형성 분석 리더 그리고 분산입니다.

담 즙 소금 유도 Biofilm 형성 장 병원 체에서: 식별 및 정량화 기술

항균 시너지 테스트 조합에 사용 되는 두 개 이상의 항생제의 효과 평가 하는 데 사용 하 고는 일반적으로 두 가지 방법 중 하나에 의해 수행: 바둑판 배열 또는 시간 죽 일 분석 결과. 여기, 우리는 자동화 된, 잉크젯 프린터 기반 바둑판 배열 시너지 기술 및 고전적인 시간 죽이기 시너지 연구 제시.

잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

자연과 실험실에서 미생물 커뮤니티 - 인터뷰

면역 세포 기능과 확산을 모니터하기위한 셀 추적 염료의 성공적인 사용은 몇 가지 중요한 단계를 포함한다. 우리가 방법을 설명합니다 : 1) 막 염료를 갖춘 밝고 균일 재현 라벨 - ING 획득, 2) fluorochromes 및 데이터 수집 조건을 선택을하고, 3) 염료 희석에 따라 세포 증식을 수량화 할 수있는 모델을 선택.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

많은 다른 방법은 유동 세포 계측법 (FCM)를 사용하여 세포 외 소체 (전기 자동차)의 측정을 위해 존재한다. 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 때 여러 측면이 고려되어야한다. 측정 전기 자동차에 대한 두 프로토콜은 개별 감지 또는 비드 기반의 접근 방식을 사용하여,되게됩니다.

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

우리는 튜브웜인 Hydroides elegans의 석회화를 관찰하고 최초의 석회화된 물질을 찾고 특성화하는 데 유용한 다양한 현미경 방법의 사용을 보여줍니다. 생체 현미경과 전자 현미경을 함께 사용하여 생체 광물화 연구에 중요한 기능 및 재료 정보를 제공합니다.

해양 tubeworm 인 라이브 광학 및 전자 현미경 기술을 사용하여 석회화 이벤트의 특성

학습하세요 미생물 도금 기술을 통해 세균과 파지를 분리하고 계수하는 무균 실험 방법을 익히세요. 이 기술은 순수 배양 분리와 미생물 연구에 필수적입니다.

무균 실험실 기술 : 도금 방법

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