무균 실험실 기술 : 도금 방법

[내레이터] 이 프로토콜은 박테리아 및 파지와 같은 미생물을 분리, 증식 또는 열거하는 데 사용되는 도금 방법에 무균 기술을 통합합니다. 절차에는 단일 콜로니를 분리하기 위한 줄무늬 도금 박테리아 배양이 포함됩니다. 박테리아의 농도를 결정하기 위해 도금을 붓습니다. 그리고 도금을 퍼뜨려 생존 가능한 박테리아 콜로니를 열거합니다. 연질 한천 오버레이는 파지를 분리하고 플라크를 열거하는 데 사용되며, 복제 도금은 동일한 공간 패턴으로 한 플레이트에서 다른 플레이트로 세포를 전달합니다. 궁극적으로 미생물 배양에 대한 이러한 기술의 실제 적용은 환경 내 박테리아 식별부터 분자 유전학 및 고처리량 생물 분석의 기술 발전에 이르기까지 다양합니다.

- 일반적으로 이러한 도금 방법을 처음 접하는 개인은 조작이 멸균되지 않은 표면과의 접촉을 피하는 신중하고 조정된 움직임이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 이러한 일상적인 절차를 배우려면 훈련과 연습이 필요합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실 코디네이터인 Dr. Kris Reddi가 될 것입니다.

- [내레이터] 생물학적 위험 분류, 폐기물 오염 제거 및 폐기를 포함한 실험실 규칙과 안전 예방 조치를 알고 미생물 작업을 시작합니다. 도금 절차를 위한 모든 기기, 용액 및 배지가 멸균되었는지 확인하십시오. 또한 명확한 작업 공간을 확보하십시오. 소독제로 청소하십시오. 가스 라인에 튜브가 부착된 분젠 버너를 설치하고 적절하게 라벨이 붙은 재료로 필요한 소모품을 배치하십시오. 소독 비누와 따뜻한 물로 손을 깨끗이 씻으십시오. 먼저 흐르는 따뜻한 물로 손을 적신 다음 비누를 바르고 완전히 분배합니다. 엄지손가락, 손가락등, 손등, 손톱 아래를 포함한 모든 표면에 마찰을 일으키는 손을 세게 문지릅니다. 그런 다음 철저히 헹구어 잔여 비누를 제거하고 홀더에서 분배한 종이 타월을 사용하여 말립니다. 마지막으로 새 종이 타월로 수도꼭지를 잠그십시오. 줄무늬 플레이트 절차는 간단한 기계적 분리를 통해 혼합 집단에서 박테리아 또는 콜로니의 순수 배양을 분리하도록 설계되었습니다. 섭씨 4도의 냉장 상자에서 한천 플레이트를 꺼내 실온으로 예열합니다. 플레이트를 줄무늬로 만들기 위한 도구 배열에서 도구를 선택합니다. 접시가 뚜껑에 결로 없이 건조한지 확인하십시오. 한천 플레이트의 바닥에 가장자리에 라벨을 붙입니다. 능숙한 경우 여러 샘플에 단일 플레이트를 사용하십시오. 그런 다음 분젠 버너에 불을 붙여 금속 루프에 불을 붙입니다. 분젠 버너 불꽃의 가장 뜨거운 부분인 파란색 원뿔 끝에 와이어를 사용하여 금속 루프에서 3-4인치 떨어진 곳에서 시작합니다. 금속이 붉게 뜨거워지면 화염이 루프에 접근하도록 와이어를 움직입니다. 루프를 식히려면 지글지글 소리를 내는 한천 배지의 가장자리를 만집니다. 루프에서 접종물을 계속 집습니다. 플레이트의 아래쪽 절반을 들어 올립니다. 루프를 림에서 플레이트의 첫 번째 사분면의 중앙으로 앞뒤로 움직입니다. 거꾸로 된 접시를 뚜껑 위에 다시 놓습니다. 금속 루프를 다시 불태웁니다. 페트리 접시를 90도 돌립니다. 앞뒤 패턴을 사용하여 마지막 줄무늬 끝 근처의 루프를 터치하고 첫 번째 사분면에서 줄무늬의 마지막 절반을 교차한 다음 빈 두 번째 사분면으로 이동합니다. 두 번째 사분면이 채워지면 접시를 내려놓습니다. 첫 번째 사분면과의 접촉을 피하면서 세 번째와 네 번째 사분면에 대해 줄무늬 절차를 반복합니다. 멸균된 납작한 이쑤시개로 줄무늬를 잡으려면 엄지와 약지 사이의 좁은 끝을 매체에 대해 10-20도 각도로 부드럽게 잡고 넓은 끝을 사용하여 사분면에 줄무늬를 그립니다. 접시를 사분면 사이의 뚜껑 위로 다시 뒤집고 이쑤시개를 적절하게 폐기하십시오. 줄무늬가 있는 플레이트를 거꾸로 배양합니다. Pour Plate Procedure는 단일 플레이트의 표면과 한천 내에서 콜로니 형성 단위의 총 수를 열거합니다. 타이머를 10분 동안 설정한 다음 녹인 한천 배지 18밀리리터를 섭씨 55도 수조에서 섭씨 48도 열 블록으로 옮기고 10분 동안 평형을 유지합니다. 멸균 페트리 접시의 바닥에 라벨을 붙입니다. 해당되는 경우 희석 계수를 포함합니다. 이제 1밀리리터의 샘플을 페트리 접시 중앙에 분배합니다. 뚜껑을 닫습니다. 녹은 한천 튜브에서 캡을 제거하고 열린 튜브의 가장자리를 화염에 통과시킵니다. 한천을 페트리 접시에 조심스럽게 붓습니다. 뚜껑을 닫은 다음 플레이트를 부드럽게 휘젓어 샘플을 한천과 혼합합니다. 한천이 굳을 때까지 30분 동안 기다리십시오. 한천이 굳으면 접시를 뒤집어서 따뜻한 방에 놓습니다. 확산 도금은 작은 샘플 부피에 포함된 미생물을 분리하여 결과 콜로니를 한천 표면 전체에 고르게 분포시키는 것을 목표로 합니다. 플레이트를 실온으로 평형을 유지하고 적절하게 라벨을 붙입니다. 턴테이블에 플레이트를 놓습니다. 0.1밀리리터의 샘플을 한천 중앙에 피펫팅하고 뚜껑을 닫습니다. 팁을 쓰레기통에 꺼냅니다. 스프레더의 전체 바닥 부분과 줄기의 첫 번째 인치를 덮는 70% 에탄올 비커에 금속 막대를 담근 다음 물기를 뺍니다. 분젠 버너의 불꽃을 통과하여 과도한 에탄올을 점화합니다. 그런 다음 한천 플레이트의 뚜껑을 열고 스프레더를 테두리 근처의 가장자리를 따라 한천에 닿아 식힙니다. 턴테이블을 천천히 돌립니다. 스프레더를 한천 표면에 부드럽게 대고 턴테이블이 회전하는 동안 앞뒤로 움직이면서 샘플을 플레이트 전체에 점차적으로 고르게 펴 바릅니다. 뚜껑을 닫고 샘플이 최소 5분 동안 완전히 흡수되도록 합니다. 그런 다음 거꾸로 된 플레이트를 배양합니다. 먼저 한천 플레이트에 적절하게 라벨을 붙입니다. 한천 플레이트의 뚜껑을 엽니다. 그런 다음 사전 멸균된 유리 구슬이 담긴 용기를 열고 테두리에 불을 붙입니다. 10-12개의 멸균 유리 구슬을 한천 플레이트에 조심스럽게 분배합니다. 캡을 교체하기 전에 플레이트의 뚜껑을 닫고 유리 구슬 용기의 가장자리에 불을 붙입니다. 이제 샘플을 한천 중앙에 피펫팅합니다. 수평으로 한천 표면을 가로질러 구슬을 부드럽게 7번 흔듭니다. 제대로 수행하면 절차가 마라카스를 흔드는 것처럼 들립니다. 플레이트를 60도 회전하고 다시 수평으로 7번 흔듭니다. 다시 플레이트를 60도 회전하고 흔들기를 반복합니다. 샘플이 흡수되었는지 확인합니다. 그런 다음 오염된 비드를 10% 염소 표백제가 들어 있는 표시된 수집 비커에 붓습니다. 거꾸로 된 플레이트를 배양합니다. 플라크 분석은 일반적으로 박테리아 파지를 검출하고 정량화하는 데 사용됩니다. 지표 박테리아를 기하급수적으로 배양하고 얼음 위에 보관합니다. 그런 다음 두 개의 멸균 미세 원심분리기 튜브에 파지 및 대조군을 라벨링하고 각각 50마이크로리터의 파지 샘플 또는 완충액을 추가합니다. 다음으로, 플라스크에서 박테리아 배양물을 소용돌이치고, 박테리아의 분취량을 멸균 튜브로 옮기고 지시 박테리아를 부드럽게 소용돌이치게 한 다음, 각 흡수 튜브에 500마이크로리터의 박테리아를 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 튕겨 섞습니다. 파지 샘플을 소용돌이치거나 세게 피펫팅하지 마십시오. 파지 박테리아 혼합물을 지시약 균주에 적합한 온도에서 20분 동안 배양합니다. 한편, 섭씨 55도 수조에서 섭씨 48도 가열 블록으로 두 개의 부드러운 한천 튜브를 옮깁니다. 10분 동안 평형을 유지합니다. 실온으로 미리 평형화된 두 개의 응축이 없는 영양 경천 플레이트에 라벨을 붙입니다. 히트 블록에서 부드러운 한천 튜브를 제거하고 내용물이 너무 뜨거워서 만지지 않는지 확인하십시오. 다음으로, 혼합물을 파지 흡수 튜브에서 연질 한천 튜브로 무균 상태로 옮깁니다. 그런 다음 손바닥 사이를 빠르게 회전시켜 내용물을 섞습니다. 한 손에 튜브를 들고 다른 손으로 단단한 한천 플레이트의 뚜껑을 엽니다. 즉시 튜브의 전체 내용물을 단단한 한천 플레이트의 표면에 붓습니다. 접시를 빠르고 부드럽게 흔듭니다. 뚜껑을 닫고 부드러운 한천이 굳을 때까지 30분 동안 접시를 수평에 놓습니다. 다음으로, 대조군 혼합물을 부드러운 한천 튜브로 옮겨 대조군 흡수 튜브에 대한 절차를 반복합니다. 그것을 섞고 내용물을 단단한 한천 접시에 붓고 흔들고 부드러운 한천을 30분 동안 굳히십시오. 플레이트에 플라크 형성이 있는지 검사합니다. 이질적인 혼합물에서 플라크를 분리하려면 멸균 이쑤시개로 중앙을 조심스럽게 펀칭하고 접종물을 100마이크로리터의 파지 완충액이 들어 있는 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 필요에 따라 연속 희석액으로 플라크 분석을 3-6회 반복하여 이 용해물을 계속 정제합니다. 복제 도금은 1차 플레이트의 세포 성장을 2차 플레이트와 비교할 수 있도록 하여 선택 가능한 표현형을 활용합니다. 플레이트 바닥에 격자를 표시하고 기본 플레이트에 레이블을 지정한 다음 결과 사각형에 번호를 매깁니다. 이제 무균 기술을 사용하여 비커에서 사전 멸균된 이쑤시개를 제거하고 세포 샘플로 각 사각형의 중앙을 두드린 다음 이쑤시개를 적절한 폐기물 용기에 폐기합니다. 1차 플레이트를 배양합니다. 기본 플레이트와 모든 보조 플레이트를 쌓습니다. 플레이트의 아래쪽 절반 측면에 방향 표시를 놓습니다. 이제 포장지에서 멸균 벨벳 천을 꺼내 원통형 블록 위에 놓습니다. 그런 다음 홀더의 표시를 블록의 표시와 정렬하여 홀더를 놓습니다. 블록과 홀더의 방향 표시를 기록해 둡니다. 그런 다음 기본 플레이트에서 뚜껑을 제거합니다. 플레이트와 블록에 방향 표시를 정렬합니다. 한천의 표면이 벨벳 천에 닿도록 플레이트를 내립니다. 손가락 끝을 사용하여 기본 플레이트의 뒷면을 가볍지만 고르게 누른 다음 조심스럽게 블록에서 들어 올립니다. 벨벳에 세포의 각인이 보이는지 확인합니다. 접시의 뚜껑을 다시 닫습니다. 이제 각 보조 플레이트와 함께 벨벳 천에 대한 프로토콜을 순차적으로 반복합니다. 1차 플레이트에서 세포의 벨벳 인상을 사용하여 가장 적은 기질에서 가장 유리한 기질까지 순서대로 최대 8개의 2차 플레이트를 접종합니다. 마지막으로 양성 대조군으로서 시리즈의 마지막 플레이트에 대해 테스트된 모든 균주가 성장해야 하는 한천 배지를 사용합니다. 거꾸로 된 플레이트를 테이프로 붙이고 배양합니다. 2차 플레이트의 성장을 검사합니다. 분젠 버너를 끈 다음 모든 소모품을 치우십시오. 오염된 실험실 마모, 유리 제품 및 유해 폐기물을 적절한 폐기 용기에 넣으십시오. 소독제로 작업 공간을 청소하십시오. 마지막으로 소독 비누와 따뜻한 물로 손을 깨끗이 씻으십시오. Serratia Marcescens는 프로디지오신이라는 붉은 색소를 생성하는 그람 음성 막대 모양의 프로테오박테리움입니다. 욕실과 샤워 커튼에서 자라는 것이 흔히 발견됩니다. 이 예에서 줄무늬 플레이트 기술은 네 번째 사분면에 단일 콜로니를 생성합니다. 공공 식수대에서 수집한 물 샘플에 존재하는 박테리아에 대한 이 분석은 Pour Plate 기술을 사용합니다. 식민지의 모양 차이에 주목하십시오. 표면 콜로니는 크고 원형인 반면 일부 표면 콜로니는 매우 작고 불규칙한 모양입니다. 스프레드 플레이트 기술은 농축, 선택 및 스크리닝 실험에서 중요한 구성 요소입니다. 예를 들어, 코파카바나 방법은 재조합 DNA 기술의 고전적인 청백색 스크린에서 차별화 도구입니다. 파지 T4는 숙주를 대장균으로 감염시켜 자손 파지를 용해하고 방출하는 독성 이중 가닥 DNA 파지입니다. EHA 한천에 대한 이 플라크 분석은 직경이 약 1mm인 제거 영역에서 파지를 보여줍니다. 감염되는 파지 입자가 없는 경우, 박테리아 성장은 개별 콜로니가 보이지 않는 연질 한천에 세포의 탁한 현탁을 초래합니다. 연질 한천 오버레이 기술에서는 플라크 형태가 다양합니다. 예를 들어, 여기서 동일한 마이코박테리움 숙주 균주는 미세균 파지 파괴자 대 마이코박테리아 파지 MSSS의 존재 하에서 뚜렷한 플라크 형태를 생성합니다. 복제 도금의 힘은 많은 수의 미생물을 동시에 스크리닝하는 데 있습니다. 이 경우 4개의 슈도모나스 균주가 3개의 서로 다른 탄소원에서 성장하기 위해 이중으로 테스트되었습니다. 아세트아미드, 유당 및 글리신. 여기서, 1차 플레이트는 표시된 바와 같이 4개의 균주가 접종된 완전한 YTA 배지입니다. 균주는 단일 탄소원, 아세트아미드, 유당 또는 글리신이 보충된 최소 MSA 배지의 복제 플레이트에서 다양한 성장 패턴을 보여줍니다. 모든 균주는 세포가 이 시리즈의 모든 2차 플레이트로 옮겨졌음을 확인하는 마지막 양성 대조군 플레이트에서 성장합니다. 이러한 복제 플레이트 결과의 표는 특징적인 성장 요구 사항에 대한 다양한 야생형 균주의 동시 스크리닝을 자세히 설명합니다.

- 이 비디오를 시청한 후에는 배지나 배양균을 오염시키지 않고 도금 절차를 수행하는 방법과 실험실에서 주어진 실험 작업에 적합한 도금 방법을 사용하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 이러한 기술에 능숙해지려면 연습이 필요합니다. 그러나 적절한 교육을 통해 이 비디오에 설명된 도금 절차는 실험실 벤치에서 작업할 때 제2의 천성이 될 것입니다.