Name: Assépticas Técnicas de Laboratório: Métodos Plating (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min
Description: Aprenda técnicas assépticas de plaqueamento para isolar, propagar e enumerar microrganismos como bactérias e fagos em microbiologia. Este método demonstra streak plating, pour plating e spread plating para pesquisa.

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Agradecimentos especiais a Cori Sanders em projetos da IROC para a preparação de ilustrações e Kris Reddi e Shah Bhairav ​​na UCLA para a criação de culturas de amostras e auxiliando com números. O financiamento para este projeto foi fornecido pelo HHMI (HHMI Grant No. 52006944).

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<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+Red-Polysaccharide+Interactions+in+Enumeration+and+Characterization+of+Cellulolytic+Bacteria+from+the+Bovine+Rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 43, 777-780 (1982).</li>
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<li>Worthington, M., Luo, R. Q., Pelo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copacabana+method+for+spreading+E.+coli+and+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Copacabana method for spreading E. coli and yeast colonies.</a> BioTechniques. 30, 738-742 (2001).</li>
<li>American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/</a> (2012).</li>
<li>EPA Microbiology Home Page. , Available from: 
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 <a target="_blank" href="http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html">http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html</a> (2012).</li>
<li>Joint Genome Institute (JGI) Genome Sequencing Protocols: Library Plating Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html">http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html</a> (2012).</li>
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 <a target="_blank" href="http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics">http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics</a> (2012).</li>
<li>Organization of American States (OAS) Department of Sustainable Development (DSD). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm">http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm</a> (2012).</li>
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 <a target="_blank" href="http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss">http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss</a> (2012).</li>
<li>United States Environmental Protection Agency (EPA) Office of Water. , Available from: 
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 <a target="_blank" href="http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html">http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html</a> (2012).</li>
<li>Introductory Course in Microbiology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html">http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html</a> (2012).</li>
</ol>

Não tenho nada para revelar.

Microrganismos de cultura envolve um certo número de métodos de revestimento, todas as quais requerem que uma técnica asséptica ser mantida durante toda a manipulação de células e meios de comunicação. Cinco diferentes procedimentos foram descritos neste protocolo. Embora estas técnicas de revestimento são rotineiramente usado para manipular as bactérias e os fagos, eles também podem ser aplicados a cultura de células de mamíferos e de microrganismos eucarióticos comumente utilizados em genética molecular, tais como levedura (ie, Saccharomyces cerevisiae, Cândida albicans, Schizosaccharomyces pombe), algas e protozoários ( isto é, Volvox, Chlamydomonas, Amoeba, Paramecium), e nemátodos (isto é, Caenorhabditis elegans). Há também numerosas (e ainda mais sofisticados) variações de cada método de plaqueamento, dependendo do objectivo experimental ou organismo em estudo. Assim, é importante não só seleccionar a técnica mais apropriada para um microorganismo experiência ou determinado alvo, mas também para adaptar o t tal metodologiachapéu dos resultados experimentais adequadamente abordar a questão ou problema de pesquisa. Alguns dos aplicativos mais atuais das técnicas de revestimento discutidas neste protocolo envolvem avanços tecnológicos que produzem alto rendimento resultados para experiências de descoberta de triagem e de drogas. Por exemplo, os centros de seqüenciamento do genoma usar o &quot;Método de Copacabana&quot; para bibliotecas propagação chapeamento-clone, que são E. células de Escherichia transformada com os plasmídeos que contêm fragmentos de DNA derivadas do genoma de um microorganismo. Devido dezenas de grandes placas (chamado tabuleiros de bioensaio) são preparados de uma vez, um agitador de placas automatizado é usado para agitar as pérolas de vidro para todo o lote de bandejas. Além disso, ao seleccionar colónias destas placas após a incubação, um seleccionador de colónia robótico é utilizado para recolher células a partir de colónias adequadas como o inoculo para caldo LB em 384 poços de microplacas. Para este ensaio de rastreio de alto rendimento, os princípios processuais da propagação p-técnica tarde aplica, mas a tecnologia permite vários passos para ser automatizado e dimensionadas para permitir um grande número de amostras a serem analisadas simultaneamente e dentro de um curto espaço de tempo. Empresas farmacêuticas e de biotecnologia investem recursos consideráveis ​​no desenvolvimento de tecnologia de alto rendimento para as técnicas mais básicas de microbiologia e genética molecular. Por exemplo, existem multi-canal micropipetas de realizar transferências de volume até 8 ou 12 amostras de uma vez. Há ainda são estações de trabalho robótico que manobra uma 96-canal cabeça pipeta! Estes esforços envolvem equipes multidisciplinares de cientistas, biólogos emparelhamento que possuem experiência metodológica com os engenheiros e programadores de computador que podem desenvolver a instrumentação necessária para executar as operações mecânicas associadas com os experimentos. Independentemente da aplicação de pesquisa, o objetivo compartilhado por empresas que desenvolvem essas tecnologias é o mesmo - para automatizar laboratóriosry processos, ferramentas, sistemas e instrumentos, tornando-os menos trabalhoso e mais eficiente.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Ágar triptona de levedura (YTA)
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Extrato de levedura</td>
			<td>2,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triptona</td>
			<td>10.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>15,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Água destilada</td>
			<td>até 1000,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7,0</td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
Autoclave em 121&deg; C por 20 minutos para esterilizar. Armazene a 4&deg;C.
Se estiver preparando tubos para o procedimento de placa de vazamento, deixe o ágar esfriar a ~ 55 graus; Em seguida, adicione 2,0 ml de 50 mg/ml de cicloheximida. Dispensar assepticamente 18,0 ml do ágar fundido por tubo de 18 mm e conservar a 4 graus C. O ágar-ágar solidificará e precisará ser derretido em um vaporizador ou micro-ondas antes do uso.
2. Ágar Sais Mínimos (MSA) + 0,1% (p/v) fonte de carbono
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH2HPO4&bull; 2H2O</td>
			<td>2,14 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1,09 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>0,2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fonte de carbono*</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solução de sais vestigiais**</td>
			<td>10.0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>15,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Água destilada</td>
			<td>até 1000,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7,0</td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
Autoclave em 121&deg; C por 20 minutos para esterilizar. Armazene a 4&deg;C.
* As fontes de carbono usadas para experimentos apresentados na Figura 13 incluem acetamida, lactose e glicina.
** A solução de sais traços é preparada em HCl 0,1 N da seguinte forma. É adicionado à base antes da esterilização (autoclave a 121&graus; C por 20 minutos).
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>FeSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>300,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&bull; 4H2O</td>
			<td>180,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co(NO3)2&bull; 6H2O</td>
			<td>130,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>40,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2MoO4</td>
			<td>20,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&bull; 5H2O</td>
			<td>1,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1000,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (0,1 N)</td>
			<td>até 1000,0 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
3. Ágar mole EHA (0,65 % p/v)
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>6,5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Triptona</td>
			<td>13,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NaCl</td>
			<td>8,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Na Citrato&bull; 2H2O</td>
			<td>2,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Glicose</td>
			<td>3,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Água destilada</td>
			<td>até 1000,0 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
Autoclave em 121&deg; C por 20 minutos para esterilizar. Armazene a 4&deg;C.
4. Ágar EHA (1,2% p / v) 
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>12,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triptona</td>
			<td>13,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td> 8,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Citrato&bull; 2H2O</td>
			<td> 2,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicose</td>
			<td> 3,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Água destilada</td>
			<td>até 1000,0 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
Autoclave em 121&deg; C por 20 minutos para esterilizar. Armazene a 4&deg;C.
5. 1X Ágar Middlebrook Top (ágar macio MBTA, 0,5% p/v)
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mM CaCl2 estoque*</td>
			<td> 1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 meio líquido: Neat **</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2XTA ***</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
Derreta 50 ml de 2XTA e deixe esfriar até ~55&�C. Usando técnica asséptica, adicione o caldo CaCl2 e 7H9 ao ágar derretido. Dispensar assepticamente 4,5 ml da mistura por tubo de 13 mm e armazenar em um tubo de 55&graus; C &#8804; 7 dias. MBTA de resfriamento à temperatura ambiente ou 4&deg; C fará com que o CaCl2 precipite para fora da solução.
* 100 mM CaCl2. O estoque deve ser armazenado à temperatura ambiente para evitar que CaCl2 precipite da solução.
** 7H9 meio líquido: Puro
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7H9 base de caldo</td>
			<td>4,7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% estoque de glicerol</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Água destilada</td>
			<td>até 900,0 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
Misture a base com água e adicione o glicerol enquanto mexe. Autoclave a 121&deg; C por 20 minutos para esterilizar. Armazene a 4&deg;C.
*** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1,0% p/v)
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7H9 base de caldo</td>
			<td>4,7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Água destilada</td>
			<td>até 1000,0 ml </td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
Autoclave em 121&deg; C por 20 minutos para esterilizar. Distribuir alíquotas de 50 ml em frascos de 100 ml e conservar a 4 graus C. 
6. Placas de ágar Middlebrook 7H10 (ágar duro MHA, 1,9% p / v) 
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7H10 base de ágar</td>
			<td>19,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% estoque de glicerol</td>
			<td>12,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Água destilada</td>
			<td>887.5 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
Misture a base de ágar com água e adicione o glicerol enquanto mexe. Aqueça a solução até ferver e mexa por um minuto para dissolver completamente o pó base. Autoclave a 121&deg; C por 20 minutos para esterilizar. Deixe o ágar esfriar até ~55&deg; C então adicione assepticamente os seguintes reagentes: 
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			suplemento <td>AD (pré-aquecido a 37&deg; C)*</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mg/ml de carbenicilina **</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/ml de cicloheximida **</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
* suplemento AD
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl > </td>
			<td>17 g > </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumina (fração V)> </td>
			<td>100 g> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glicose)> </td>
			<td>40 g> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Água destilada> </td>
			<td>até 2000,0 ml> </td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
Filtre esta solução; Não autoclave. Armazene a 4&deg;C.
** Filtre-esterilize e armazene essas soluções em 4&deg; C para &le; 60 dias.
7. Ágar LB (1,5% p/v) + X-Gal (60 &mu; g/ml)
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Triptona</td>
			<td>10.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extrato de levedura</td>
			<td>5,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>10.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>15,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Água destilada</td>
			<td>até 1000,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7,5 a 25&deg; C</td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
Autoclave em 121&deg; C por 20 minutos para esterilizar. Deixe o ágar esfriar até ~55&deg; C em seguida, adicionar assepticamente 3,0 ml de solução X-Gal a 20 mg/ml. Preparar o caldo X-gal dissolvendo 400 mg de X-Gal em 20 ml de dimetilformamida (DMF). 
Tabela de reagentes específicos:
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nome do reagente</td>
			<td>Company</td>
			<td>Número de catálogo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extrato de levedura</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>212750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triptona</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>211705</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>214030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>123340010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH2HPO4&bull; 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30435</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 303-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetamida</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>A-0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactose</td>
			<td>Fisher Scientific </td>
			<td>L6-500 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicina</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-7126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&bull; 4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3634</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co(NO3)2&bull; 6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2MoO4</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>213621000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&bull; 5H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>209198 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicloheximida</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>038K1561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicilina < / td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>46-100-RG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Citrato&bull; 2H2O</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S279-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicose (Dextrose)</td>
			<td>BD</td>
			<td>215530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 base de caldo</td>
			<td>BD</td>
			<td>271310</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10 base de ágar</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicerol</td>
			<td>Shelton</td>
			<td>IB15760</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumina (Fração V)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S71907</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-&#946;-D-galactopiranosídeo) </td>
			<td>Teknova</td>
			<td>X1205</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimetilformamida (DMF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4551</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CDA19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alvejante de cloro</td>
			<td>Clorox</td>
			<td>02490/06644884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CiDecon (desinfetante)</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>8504</td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela>
Tabela de equipamentos específicos:
<borda da tabela = "1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nome do equipamento</td>
			<td>Company</td>
			<td>Número de catálogo</td>
			<td>Experimento</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loops de metal</td>
			<td>Produtos Educacionais Americanos</td>
			<td>S17352</td>
			<td>Chapeamento de raias</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laços de plástico descartáveis</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-602</td>
			<td>Chapeamento de raias</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varas de madeira</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-400-104</td>
			<td>Chapeamento de raias</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palitos de dente planos</td>
			<td>Produtos Educacionais Americanos</td>
			<td>S67859</td>
			<td>Chapeamento de raias</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesas giratórias</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-758Q</td>
			<td>Espalhamento de chapeamento</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hastes de vidro</td>
			<td>Bellco Glass</td>
			<td>NC9004380</td>
			<td>Espalhamento de chapeamento</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm contas de vidro</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-312B</td>
			<td>Espalhamento de chapeamento</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pano de veludo</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>09-718-2</td>
			<td>Réplica de chapeamento</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bloco cilíndrico</td>
			<td>Bel-Art Products</td>
			<td>09-718-1</td>
			<td>Réplica de chapeamento</td>
		</tr>
	</tbody>
</tabela></td></tr></tbody></table>

assépticas técnicas de laboratório: métodos plating

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microrganismos estão presentes em todas as superfícies inanimadas criação de fontes de contaminação ubíquos possível no laboratório. Experimental sucesso depende da capacidade de um cientista para esterilizar superfícies de trabalho e equipamentos, bem como evitar o contato de instrumentos esterilizados e soluções com superfícies não-estéreis. Aqui apresentamos os passos para métodos de revestimento vários rotineiramente utilizadas em laboratório para isolar, propagar, ou enumerar microorganismos, como bactérias e fagos. Todos os cinco métodos incorporar uma técnica asséptica, ou procedimentos que mantêm a esterilidade de materiais experimentais. Procedimentos descritos incluem (1) raia excesso de regulamentação culturas bacterianas para isolar colônias de solteiro, (2) derramar excesso de regulamentação e (3) difusão-plating para enumerar viáveis ​​colônias bacterianas, (4) overlays ágar mole para isolar fago e placas de enumerar, e ( 5) réplica de placas para transferir células de uma placa para a outra em um padrão idêntico espacial. Estes procedimentos podem ser executados em tele bancada de laboratório, desde que envolvem não patogénicas estirpes de microrganismos (Nível de Biossegurança 1, BSL-1). Se estiver trabalhando com BSL-2 organismos e, em seguida estas manipulações devem ocorrer em uma cabine de segurança biológica. Consulte a edição mais atual da Biossegurança em Laboratórios Microbiológicos e Biomédicos (BMBL), bem como Fichas de Dados de Segurança (MSDS) para substâncias infecciosas para determinar a classificação de risco biológico, bem como as precauções de segurança e instalações de confinamento necessárias para o microrganismo em questão. Cepas bacterianas e estoques fago pode ser obtido a partir de pesquisadores de investigação, empresas e coleções particulares mantidos por organizações como a American Type Culture Collection (ATCC). Recomenda-se que não patogénicos-estirpes ser utilizado quando a aprendizagem dos métodos de revestimento diferentes. Seguindo os procedimentos descritos neste protocolo, o aluno deve ser capaz de: <ul><li> Realizar procedimentos de chapeamento sem contaminatimídia ng. </li><li> Isolar simples colônias de bactérias pelo método de raia-plating. </li><li> Utilizar métodos de verter de revestimento e propagação de revestimento a fim de determinar a concentração de bactérias. </li><li> Realizar sobreposições agar mole quando se trabalha com fago. </li><li> Transferir as células bacterianas de uma placa para a outra utilizando o procedimento de réplica de placas. </li><li> Dada uma tarefa experimental, selecione o método de plaqueamento apropriado. </li></ul>

Quando se trabalha com meios de comunicação e dos reagentes utilizados para os microorganismos de cultura, uma técnica asséptica deve ser praticado para assegurar a contaminação é minimizado. Uma variedade de métodos de revestimento são rotineiramente utilizados para isolar, propagar ou bactérias enumerar e de fagos, os quais incorporam os procedimentos que mantêm a esterilidade de materiais experimentais.

Assépticas Técnicas de Laboratório: Métodos Plating

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

[Locutor] Este protocolo incorpora técnica asséptica em métodos de plaqueamento utilizados para isolar, propagar ou enumerar microrganismos como bactérias e fagos. Os procedimentos incluem plaqueamento por esgotamento de culturas bacterianas para isolar colônias isoladas, plaqueamento por espalhamento para determinar a concentração de bactérias e plaqueamento por espalhamento superficial para enumerar colônias bacterianas viáveis. Camadas de ágar mole são usadas para isolar fagos e enumerar placas, enquanto o plaqueamento por replica permite transferir células de uma placa para outra em um padrão espacial idêntico. Em última análise, as aplicações práticas dessas técnicas para o cultivo de microrganismos variam desde a identificação de bactérias em ambientes até avanços tecnológicos em genética molecular e bioensaios de alto rendimento.– Geralmente, indivíduos novos nesses métodos de plaqueamento podem ter dificuldades, pois as manipulações exigem movimentos cuidadosos e coordenados, evitando o contato com superfícies não estéreis. Aprender esses procedimentos rotineiros exige treinamento e prática. O responsável por demonstrar os procedimentos será o coordenador do meu laboratório, Dr. Kris Reddi.- [Locutor] Inicie o trabalho com microrganismos conhecendo as regras do laboratório e as precauções de segurança, incluindo classificação de risco biológico, descontaminação de resíduos e descarte. Confirme que todos os instrumentos, soluções e meios para procedimentos de plaqueamento são estéreis. Estabeleça também uma área de trabalho limpa. Limpe-a com desinfetante. Monte um bico de Bunsen com um tubo conectado à linha de gás e organize os materiais necessários, com todos os itens devidamente rotulados. Prossiga lavando as mãos cuidadosamente com sabão antisséptico e água morna. Primeiro, umedecer as mãos com água corrente morna, aplicar o sabão e espalhá-lo completamente. Esfregar vigorosamente as mãos, gerando fricção em todas as superfícies, incluindo polegares, costas dos dedos, costas das mãos e sob as unhas. Em seguida, enxaguar completamente para remover o sabão residual e secar com toalhas de papel retiradas de um dispensador. Por fim, com uma toalha de papel nova, fechar a torneira. O Método de Plaqueamento em Estria é projetado para isolar culturas puras de bactérias, ou colônias, de populações mistas por separação mecânica simples. Retire uma placa de ágar de uma caixa fria a quatro graus Celsius e pré-aqueça à temperatura ambiente. Selecione uma ferramenta entre os instrumentos disponíveis para estriar a placa. Certifique-se de que a placa esteja seca, sem condensação na tampa. Rotule a base da placa de ágar ao redor da borda. Quando proficientes, use uma única placa para múltiplas amostras. Em seguida, acenda um bico de Bunsen para flamejar o loop metálico. Comece a três ou quatro polegadas do loop metálico, com o fio na ponta do cone azul, a parte mais quente da chama do bico de Bunsen. Quando o metal ficar incandescente, mova o fio para que a chama alcance o loop. Para resfriar o loop, toque a borda do meio de ágar, produzindo um som de chiado. Continue coletando o inóculo no loop. Levante a metade inferior da placa. Mova o loop de trás para frente, da borda ao centro, no primeiro quadrante da placa. Coloque a placa invertida de volta sobre a tampa. Reflame o loop metálico. Gire a placa de Petri em 90 graus. Toque o loop próximo ao final da última estria, usando o padrão de vaivém, cruze a metade final das estrias no primeiro quadrante e depois avance para o segundo quadrante vazio. Após preencher o segundo quadrante, coloque a placa de lado. Repita o procedimento de estriamento para o terceiro e quarto quadrantes, evitando o contato com o primeiro quadrante. Para estriar com um palito de dente estéril e plano, segure a extremidade estreita suavemente entre o polegar e o dedo anelar, em um ângulo de 10 a 20 graus em relação ao meio, e use a extremidade larga para estriar os quadrantes. Inverta a placa sobre a tampa entre os quadrantes e descarte o palito adequadamente. Prossiga incubando as placas estriadas com a tampa para baixo. O Método de Plaqueamento por Espalhamento permite enumerar o número total de unidades formadoras de colônias na superfície e dentro do ágar de uma única placa. Ajuste um cronômetro para 10 minutos, transfira 18 mililitros de meio de ágar fundido de um banho-maria a 55 graus Celsius para um bloco térmico a 48 graus Celsius e equilibre por 10 minutos. Rotule a base de uma placa de Petri estéril. Se aplicável, inclua o fator de diluição. Agora, dispense um mililitro de amostra no centro da placa de Petri. Feche a tampa. Remova a tampa do tubo de ágar fundido e passe a borda do tubo aberto pela chama. Despeje cuidadosamente o ágar na placa de Petri. Feche a tampa e, em seguida, misture a amostra com o ágar girando suavemente a placa. Aguarde 30 minutos para que o ágar solidifique. Após a solidificação do ágar, inverta e coloque a placa em um local aquecido. O plaqueamento por espalhamento visa separar microrganismos contidos em um pequeno volume de amostra, distribuindo as colônias resultantes uniformemente sobre a superfície do ágar. Equilibre uma placa à temperatura ambiente e rotule-a adequadamente. Posicione a placa na plataforma giratória. Pipete 0,1 mililitro de amostra no centro do ágar e feche a tampa. Ejecte a ponteira em um recipiente de resíduos. Mergulhe a haste metálica em um béquer com etanol a 70%, cobrindo toda a parte inferior do espalhador e a primeira polegada da haste, e depois escorra. Queime o etanol em excesso passando pela chama do bico de Bunsen. Em seguida, abra a tampa da placa de ágar e resfrie o espalhador tocando-o no ágar ao longo da borda, próximo à extremidade. Gire lentamente a plataforma giratória. Segurando o espalhador suavemente sobre a superfície do ágar, distribua gradualmente a amostra uniformemente por toda a placa com movimentos de vaivém enquanto a plataforma gira. Feche a tampa e deixe a amostra absorver completamente por pelo menos cinco minutos. Em seguida, incube a placa invertida. Primeiro, rotule adequadamente a placa de ágar. Abra a tampa da placa de ágar. Em seguida, abra o recipiente de esferas de vidro pré-esterilizadas e flameje a borda. Dispense cuidadosamente 10 a 12 esferas de vidro estéreis sobre uma placa de ágar. Feche a tampa da placa e flameje a borda do recipiente de esferas de vidro antes de recolocar a tampa. Agora, pipete a amostra no centro do ágar. Com movimento horizontal, agite suavemente as esferas sobre a superfície do ágar sete vezes. Se realizado corretamente, o procedimento produz um som semelhante ao de chocalhos. Gire a placa em 60 graus e agite horizontalmente novamente sete vezes. Mais uma vez, gire a placa em 60 graus e repita a agitação. Verifique se a amostra foi absorvida. Em seguida, despeje as esferas contaminadas em um béquer de coleta marcado contendo água sanitária a 10%. Incube a placa invertida. O ensaio de placa é comumente usado para detectar e quantificar fagos bacterianos. Cultive a bactéria indicadora até a fase exponencial e mantenha-a em gelo. Em seguida, rotule dois tubos microcêntrifugos estéreis como fago e controle e adicione 50 microlitros de amostra de fago ou tampão, respectivamente, a cada um. Em seguida, agite suavemente a cultura bacteriana no frasco, transfira uma alíquota de bactérias para um tubo estéril, vortexe suavemente a bactéria indicadora e adicione 500 microlitros de bactérias a cada tubo de absorção. Misture suavemente agitando os tubos com os dedos. Nunca vortexe ou pipete vigorosamente amostras de fago. Incube a mistura de fago e bactérias à temperatura apropriada para a cepa indicadora por 20 minutos. Enquanto isso, transfira dois tubos de ágar mole de um banho-maria a 55 graus Celsius para um bloco de aquecimento a 48 graus Celsius. Equilibre por 10 minutos. Rotule duas placas de ágar duro nutricional, livres de condensação e previamente equilibradas à temperatura ambiente. Remova um tubo de ágar mole do bloco de aquecimento e verifique se o conteúdo não está muito quente ao toque. Em seguida, transfira assépticamente a mistura do tubo de absorção de fago para o tubo de ágar mole. Em seguida, gire rapidamente entre as palmas das mãos para misturar o conteúdo. Com o tubo em uma mão, abra a tampa da placa de ágar duro com a outra mão. Imediatamente, despeje todo o conteúdo do tubo sobre a superfície da placa de ágar duro. Balance a placa rapidamente e suavemente. Feche a tampa e coloque a placa em uma superfície nivelada por 30 minutos até que o ágar mole solidifique. Em seguida, repita o procedimento para o tubo de absorção controle, transferindo a mistura controle para um tubo de ágar mole, misturando, despejando o conteúdo sobre uma placa de ágar duro, balanceando e permitindo que o ágar mole solidifique por 30 minutos. Inspecione as placas quanto à formação de placas. Para isolar uma placa de uma mistura heterogênea, perfure cuidadosamente o centro com um palito de dente estéril e transfira o inóculo para um tubo microcêntrifugo estéril contendo 100 microlitros de tampão de fago. Continue purificando este lisado repetindo o ensaio de placa de três a seis vezes, com diluições seriadas conforme necessário. O plaqueamento por réplica explora um fenótipo selecionável, permitindo a comparação do crescimento celular em uma placa primária com placas secundárias. Marque uma grade na base da placa, rotule a placa primária e numere os quadrados resultantes. Agora, use técnica asséptica para retirar um palito de dente pré-esterilizado do béquer, toque o centro de cada quadrado com uma amostra de células e descarte o palito em um recipiente de resíduos apropriado. Incube a placa primária. Empilhe a placa primária e todas as placas secundárias. Faça uma marca de orientação no lado da metade inferior das placas. Em seguida, remova um pano de veludo estéril da embalagem e coloque-o sobre o bloco cilíndrico. Coloque o suporte, alinhando as marcas do suporte com as do bloco. Observe a marca de orientação no bloco e no suporte. Em seguida, remova a tampa da placa primária. Alinhe as marcas de orientação da placa e do bloco. Abaixe a placa para que a superfície do ágar entre em contato com o pano de veludo. Usando as pontas dos dedos, pressione suavemente e uniformemente a parte traseira da placa primária e, em seguida, levante-a cuidadosamente do bloco. Confirme que a impressão das células é visível no veludo. Recoloque a tampa na placa. Agora, repita sequencialmente o protocolo no pano de veludo com cada uma das placas secundárias. Use a impressão de células da placa primária para inocular até oito placas secundárias, ordenadas da menos à mais favorável em termos de substrato. Finalmente, como controle positivo, para a última placa da série, use um meio de ágar no qual todas as cepas testadas devem crescer. Fixe as placas invertidas juntas com fita adesiva e incube-as. Inspecione as placas secundárias quanto ao crescimento. Desligue o bico de Bunsen e guarde todos os materiais. Coloque roupas de laboratório contaminadas, vidraria e resíduos perigosos nos recipientes apropriados de descarte. Limpe a área de trabalho com desinfetante. Finalmente, lave as mãos cuidadosamente com sabão antisséptico e água morna. Serratia marcescens é uma proteobactéria gram-negativa, em forma de bastonete, que produz um pigmento avermelhado chamado prodigiosina. É comumente encontrada crescendo em banheiros e cortinas de chuveiro. Neste exemplo, a técnica de plaqueamento em estria gera colônias isoladas no quarto quadrante. Esta análise de bactérias presentes em uma amostra de água coletada de uma fonte pública de água potável utiliza a técnica de Plaqueamento por Espalhamento. Observe a diferença na aparência das colônias. As colônias superficiais são grandes e de formato circular, enquanto algumas colônias superficiais são muito pequenas e de formato irregular. A técnica de Plaqueamento por Espalhamento é um componente importante em experimentos de enriquecimento, seleção e triagem. Por exemplo, o método copacabana é uma ferramenta diferencial na clássica triagem azul-branca em tecnologia de DNA recombinante. O fago T4 é um fago de DNA de dupla fita virulento que infecta seu hospedeiro Escherichia coli, lisando-o e liberando fagos descendentes. Este ensaio de placa em ágar EHA mostra fagos em zonas de clareamento de aproximadamente um milímetro de diâmetro. Na ausência de partículas de fago infectantes, o crescimento bacteriano resulta em uma suspensão turva de células no ágar mole, na qual colônias discretas não são visíveis. Na técnica de sobreposição com ágar mole, as morfologias das placas variam. Por exemplo, aqui a mesma cepa hospedeira de micobactéria produz morfologias de placas distintas na presença de fagos destruidores de micobactérias versus fagos de micobactérias MSSS. O poder do plaqueamento por réplica está na triagem simultânea de um grande número de microrganismos. Neste caso, quatro cepas de Pseudomonas foram testadas em duplicata quanto ao crescimento em três diferentes fontes de carbono: acetamida, lactose e glicina. Aqui, a placa primária é um meio completo YTA inoculado com as quatro cepas, conforme indicado. As cepas mostram padrões variáveis de crescimento em placas réplica de meio mínimo MSA suplementado com uma única fonte de carbono: acetamida, lactose ou glicina. Todas as cepas crescem na última placa de controle positivo, confirmando que as células foram transferidas para todas as placas secundárias nesta série. A tabulação desses resultados de plaqueamento por réplica detalha a triagem simultânea de diferentes cepas selvagens quanto aos requisitos característicos de crescimento.— Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar procedimentos de plaqueamento sem contaminar os meios ou culturas, bem como de como usar o método de plaqueamento apropriado para qualquer tarefa experimental específica no laboratório. Tornar-se proficiente nessas técnicas exige prática. No entanto, com treinamento adequado, os procedimentos de plaqueamento descritos neste vídeo se tornarão naturais ao trabalhar na bancada do laboratório.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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