Assépticas Técnicas de Laboratório: Métodos Plating

[Narrador] Este protocolo incorpora técnica asséptica em métodos de plaqueamento usados para isolar, propagar ou enumerar microorganismos como bactérias e fagos. Os procedimentos incluem culturas bacterianas de placas de estrias para isolar colônias únicas. Despeje o revestimento para determinar a concentração de bactérias. E espalhe o revestimento para enumerar colônias bacterianas viáveis. As sobreposições de ágar macio são usadas para isolar fagos e enumerar placas, enquanto as réplicas de placas transferem células de uma placa para outra em um padrão espacial idêntico. Em última análise, as aplicações práticas dessas técnicas para cultivar microrganismos vão desde a identificação de bactérias em ambientes até avanços tecnológicos em genética molecular e bioensaios de alto rendimento.

- Geralmente, indivíduos novos nesses métodos de revestimento podem ter dificuldades porque as manipulações exigem movimentos cuidadosos e coordenados, evitando o contato com superfícies não estéreis. Aprender esses procedimentos rotineiros exige treinamento e prática. Demonstrando os procedimentos estará meu coordenador de laboratório, Dr. Kris Reddi.

- [Narrador] Comece a trabalhar com microrganismos conhecendo as regras do laboratório e as precauções de segurança, incluindo classificação de risco biológico, descontaminação e descarte de resíduos. Confirme se todos os instrumentos, soluções e meios para procedimentos de galvanização são estéreis. Estabeleça também um espaço de trabalho claro. Limpe-o com desinfetante. Configure um bico de Bunsen com um tubo conectado a uma linha de gás, arrume os suprimentos necessários com materiais devidamente rotulados. Lave bem as mãos com sabão anti-séptico e água morna. Primeiro, molhe as mãos com água morna corrente e, em seguida, aplique e distribua bem o sabão. Esfregue vigorosamente as mãos gerando atrito em todas as superfícies, incluindo polegares, costas dos dedos, costas das mãos e sob as unhas. Em seguida, enxágue abundantemente para remover o sabão residual e seque com toalhas de papel dispensadas de um suporte. Finalmente, com uma toalha de papel limpa, feche a torneira. O procedimento de placa de listras é projetado para isolar culturas puras de bactérias, ou colônias, de populações mistas por simples separação mecânica. Remova uma placa de ágar de uma caixa fria de quatro graus Celsius e pré-aqueça à temperatura ambiente. Selecione uma ferramenta da variedade de instrumentos para listrar a placa. Certifique-se de que a placa esteja seca sem condensação na tampa. Rotule o fundo de uma placa de ágar ao redor da borda. Quando proficiente, use uma única placa para várias amostras. Em seguida, acenda um bico de Bunsen para acender o laço de metal. Comece a três a quatro polegadas do laço de metal com o fio na ponta do cone azul, a parte mais quente da chama do bico de Bunsen. Quando o metal ficar vermelho, mova o fio para que a chama se aproxime do laço. Para resfriar o loop, toque na borda do meio de ágar gerando um som crepitante. Continue a pegar o inóculo no loop. Levante a metade inferior da placa. Mova o laço para frente e para trás da borda para o centro no primeiro quadrante da placa. Coloque a placa invertida de volta na tampa. Acenda novamente o laço de metal. Gire a placa de Petri 90 graus. Toque o laço perto do final da última sequência usando o padrão para frente e para trás, cruze a última metade das faixas no primeiro quadrante e passe para o segundo quadrante vazio. Assim que o segundo quadrante estiver preenchido, coloque a placa no chão. Repita o procedimento de estrias para o terceiro e quarto quadrantes, evitando o contato com o primeiro quadrante. Para estriar com um palito estéril e plano, segure a extremidade estreita suavemente entre o polegar e o dedo anelar em um ângulo de 10 a 20 graus em relação ao meio, use a extremidade larga para estriar os quadrantes. Inverta o prato de volta na tampa entre os quadrantes e descarte o palito adequadamente. Prossiga para incubar as placas listradas de cabeça para baixo. O Procedimento de Pour Plate enumera o número total de unidades formadoras de colônias na superfície e dentro do ágar de uma única placa. Defina um cronômetro para 10 minutos, depois transfira 18 mililitros de meio de ágar derretido de um banho-maria de 55 graus Celsius para um bloco de calor de 48 graus Celsius e equilibre por 10 minutos. Rotule o fundo de uma placa de Petri estéril. Se aplicável, incluir o fator de diluição. Agora dispense um mililitro de amostra no meio da placa de Petri. Feche a tampa. Remova a tampa do tubo de ágar derretido e passe a borda do tubo aberto por uma chama. Despeje o ágar-ágar com cuidado na placa de Petri. Feche a tampa e misture a amostra com o ágar girando suavemente a placa. Aguarde 30 minutos para permitir que o ágar-ágar solidifique. Assim que o ágar-ágar solidificar, inverta e coloque a placa em uma sala quente. O espalhamento visa separar os microrganismos contidos em um pequeno volume de amostra, distribuindo as colônias resultantes uniformemente pela superfície do ágar. Equilibre um prato à temperatura ambiente e rotule adequadamente. Posicione a placa no prato giratório. Pipete 0,1 mililitros de amostra no centro do ágar e feche a tampa. Ejete a ponta em um recipiente de lixo. Mergulhe a haste de metal em um béquer de etanol a 70% cobrindo toda a parte inferior do espalhador e a primeira polegada da haste e, em seguida, escorra. Acenda o excesso de etanol passando pela chama de um bico de Bunsen. Em seguida, abra a tampa da placa de ágar e resfrie o espalhador tocando-o no ágar ao longo da borda perto da borda. Gire o toca-discos lentamente. Segurando o espalhador suavemente na superfície do ágar, espalhe gradualmente a amostra uniformemente por toda a placa usando um movimento para frente e para trás enquanto a plataforma giratória está girando. Feche a tampa e deixe a amostra absorver completamente por pelo menos cinco minutos. Em seguida, incube a placa invertida. Primeiro, rotule a placa de ágar adequadamente. Abra a tampa da placa de ágar. Em seguida, abra o recipiente de contas de vidro pré-esterilizadas e acenda a borda. Dispense cuidadosamente 10 a 12 esferas de vidro estéreis em uma placa de ágar. Feche a tampa da placa e acenda a borda do recipiente de contas de vidro antes de recolocar a tampa. Agora, pipete a amostra para o centro do ágar. Em movimentos horizontais, agite suavemente as contas na superfície do ágar sete vezes. Se feito corretamente, o procedimento soa como sacudir maracas. Gire a placa 60 graus e agite horizontalmente novamente sete vezes. Novamente, gire a placa 60 graus e repita a agitação. Verifique se a amostra é absorvida. Em seguida, despeje as esferas contaminadas em um copo de coleta marcado contendo alvejante a 10%. Incube a placa invertida. O ensaio de placa é comumente usado para detectar e quantificar fagos de bactérias. Cultive a bactéria indicadora até a fase exponencial e armazene no gelo. Em seguida, rotule dois tubos de microcentrífuga estéreis fago e controle e adicione 50 microlitros de amostra de fago ou tampão, respectivamente, a cada um. Em seguida, agite a cultura bacteriana no frasco, transfira uma alíquota de bactérias para um tubo estéril e subtraia suavemente as bactérias indicadoras e, em seguida, adicione 500 microlitros de bactérias a cada tubo de absorção. Misture sacudindo suavemente os tubos. Nunca faça vórtice ou pipete vigorosamente amostras de fagos. Incubar a mistura de bactérias do fago a uma temperatura apropriada para a cepa indicadora por 20 minutos. Enquanto isso, transfira dois tubos de ágar macio de um banho-maria de 55 graus Celsius para um bloco de aquecimento de 48 graus Celsius. Equilibre por 10 minutos. Rotule duas placas de ágar duro sem condensação pré-equilibradas à temperatura ambiente. Remova um tubo de ágar macio do bloco de calor e verifique se o conteúdo não está muito quente para tocar. Em seguida, transfira assepticamente a mistura do tubo de absorção de fagos para o tubo de ágar macio. Em seguida, gire rapidamente entre as palmas das mãos para misturar o conteúdo. Com o tubo em uma mão, abra a tampa da placa de ágar duro com a outra mão. Despeje imediatamente todo o conteúdo do tubo na superfície de uma placa de ágar duro. Balance o prato com rapidez e delicadeza. Feche a tampa e coloque o prato nivelado por 30 minutos até que o ágar mole solidifique. Em seguida, repita o procedimento para o tubo de absorção de controle transferindo a mistura de controle para um tubo de ágar macio. Misturando, despejando o conteúdo em um prato de ágar duro, balançando-o e permitindo que o ágar macio solidifique por 30 minutos. Inspecione as placas quanto à formação de placa. Para isolar uma placa de uma mistura heterogênea, perfure cuidadosamente o centro com um palito de dente estéril e transfira o inóculo para um tubo de microcentrífuga estéril contendo 100 microlitros de tampão de fago. Continue a purificar este lisado repetindo o ensaio de placa três a seis vezes com diluições seriadas conforme necessário. O revestimento de réplica explora um fenótipo selecionável, permitindo a comparação do crescimento celular em uma placa primária com placas secundárias. Marque uma grade na parte inferior da placa, rotule a placa primária e numere os quadrados resultantes. Agora, use a técnica asséptica para remover um palito pré-esterilizado do copo, enxugue o centro de cada quadrado com uma amostra de célula e descarte o palito em um recipiente de lixo apropriado. Incube a placa primária. Empilhe a placa primária e todas as placas secundárias. Coloque uma marca de orientação na lateral da metade inferior das placas. Agora remova um pano de veludo estéril de sua embalagem e coloque-o no bloco cilíndrico. Em seguida, coloque o suporte alinhando as marcas do suporte com as do bloco. Observe a marca de orientação no bloco e no suporte. Em seguida, remova a tampa da placa primária. Alinhe as marcas de orientação na placa e no bloco. Abaixe a placa de modo que a superfície do ágar entre em contato com o pano de veludo. Usando as pontas dos dedos, pressione levemente, mas uniformemente, a parte de trás da placa primária e, em seguida, retire-a cuidadosamente do bloco. Confirme se a marca das células pode ser vista no veludo. Recoloque a tampa na placa. Agora, repita sequencialmente o protocolo no pano de veludo com cada uma das placas secundárias. Use a impressão aveludada das células da placa primária para inocular até oito placas secundárias ordenadas do substrato menos para o mais favorável. Finalmente, como controlo positivo, para a última placa da série, utilizar meio de ágar no qual todas as estirpes ensaiadas devem crescer. Cole as placas invertidas e incuba-as. Inspecione as placas secundárias quanto ao crescimento. Desligue o bico de Bunsen e guarde todos os suprimentos. Coloque roupas de laboratório contaminadas, vidros e resíduos perigosos no recipiente de descarte adequado. Limpe a área de trabalho com desinfetante. Por fim, lave bem as mãos com sabão anti-séptico e água morna. Serratia Marcescens é uma proteobactéria gram-negativa, em forma de bastonete, que produz um pigmento avermelhado chamado prodigiosina. É comumente encontrado crescendo em banheiros e em cortinas de chuveiro. Neste exemplo, a técnica de placa de listras gera colônias únicas no quarto quadrante. Esta análise de bactérias presentes em uma amostra de água coletada de um bebedouro público usa a técnica Pour Plate. Observe a diferença na aparência das colônias. As colônias superficiais são grandes e circulares, enquanto algumas colônias superficiais são muito pequenas e de formato irregular. A técnica Spread Plate é um componente importante em experimentos de enriquecimento, seleção e triagem. Por exemplo, o método copacabana é uma ferramenta diferenciadora na clássica tela azul-branca na tecnologia de DNA recombinante. O fago T4 é um fago virulento de DNA de fita dupla que infecta seu hospedeiro como Escherichia coli para lisar e liberar o fago da progênie. Este ensaio de placa em ágar EHA mostra fagos em zonas de clareira de aproximadamente um milímetro de diâmetro. Na ausência de partículas de fago infectantes, o crescimento bacteriano resulta em uma suspensão turva de células no ágar mole na qual colônias discretas não são visíveis. Na técnica de sobreposição de ágar mole, as morfologias das placas variam. Por exemplo, aqui a mesma cepa hospedeira de micobactéria produz morfologias de placa distintas na presença de destruidores de fagos de microbactérias versus MSSS de fagos de micobactérias. O poder da réplica de chapeamento está na triagem simultânea de um grande número de microrganismos. Neste caso, quatro cepas de pseudomonas foram testadas em duplicata para crescimento em três fontes de carbono diferentes. Acetamida, lactose e glicina. Aqui, a placa primária é um meio YTA completo inoculado com as quatro cepas, conforme indicado. As cepas mostram padrões de crescimento variáveis em placas réplicas de meio MSA mínimo suplementado com uma única fonte de carbono acetamida, lactose ou glicina. Todas as cepas crescem na última placa de controle positivo, confirmando que as células foram transferidas para todas as placas secundárias desta série. A tabulação dos resultados dessas réplicas da placa detalha a triagem simultânea das diferentes cepas do tipo selvagem para requisitos de crescimento característicos.

- Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar procedimentos de plaqueamento sem contaminar meios ou culturas e também usar o método de revestimento apropriado para qualquer tarefa experimental no laboratório. Tornar-se proficiente com essas técnicas requer prática. No entanto, com treinamento adequado, os procedimentos de revestimento descritos neste vídeo se tornarão uma segunda natureza ao trabalhar na bancada do laboratório.