Tecniche di laboratorio asettico: Metodi Placcatura

[Narratore] Questo protocollo incorpora una tecnica asettica nei metodi di placcatura utilizzati per isolare, propagare o enumerare microrganismi come batteri e fagi. Le procedure includono colture batteriche a strisciamento per isolare singole colonie. Versare la placcatura per determinare la concentrazione di batteri. E la placcatura diffusa per enumerare le colonie batteriche vitali. Le sovrapposizioni di agar morbido vengono utilizzate per isolare i fagi ed enumerare le placche, mentre la replica della placcatura trasferisce le cellule da una piastra all'altra in un modello spaziale identico. In definitiva, le applicazioni pratiche di queste tecniche per la coltura di microrganismi vanno dall'identificazione di batteri negli ambienti ai progressi tecnologici nella genetica molecolare e nei biotest ad alto rendimento.

- In generale, le persone che non conoscono questi metodi di placcatura possono avere difficoltà perché le manipolazioni richiedono movimenti attenti e coordinati evitando il contatto con superfici non sterili. L'apprendimento di queste procedure di routine richiede formazione e pratica. A dimostrare le procedure sarà il mio coordinatore di laboratorio, il dottor Kris Reddi.

- [Narratore] Inizia a lavorare con i microrganismi conoscendo le regole di laboratorio e le precauzioni di sicurezza, tra cui la classificazione dei rischi biologici, la decontaminazione dei rifiuti e lo smaltimento. Verificare che tutti gli strumenti, le soluzioni e i terreni per le procedure di placcatura siano sterili. Stabilisci anche uno spazio di lavoro chiaro. Puliscilo con disinfettante. Installare un bruciatore Bunsen con un tubo collegato a una linea del gas, disporre le forniture necessarie con materiali etichettati correttamente. Procedere a lavarsi accuratamente le mani con sapone antisettico e acqua tiepida. Per prima cosa, bagnare le mani con acqua corrente calda, quindi applicare e distribuire accuratamente il sapone. Strofinare energicamente le mani generando attrito su tutte le superfici, inclusi pollici, dorso delle dita, dorso delle mani e sotto le unghie. Quindi risciacquare abbondantemente per rimuovere i residui di sapone e asciugare utilizzando salviette di carta erogate da un supporto. Infine, con un tovagliolo di carta fresco, chiudi il rubinetto. La procedura Streak Plate è progettata per isolare colture pure di batteri, o colonie, da popolazioni miste mediante semplice separazione meccanica. Rimuovere una piastra di agar da una scatola fredda a quattro gradi Celsius e preriscaldarla a temperatura ambiente. Selezionare uno strumento dalla serie di strumenti per striare la piastra. Assicurarsi che la piastra sia asciutta senza condensa sul coperchio. Etichettare la parte inferiore di una piastra di agar attorno al bordo. Quando si è esperti, utilizzare una singola piastra per più campioni. Quindi accendi un bruciatore Bunsen per accendere l'anello di metallo. Inizia da tre a quattro pollici dall'anello di metallo con il filo nella punta del cono blu, la parte più calda della fiamma del bruciatore Bunsen. Quando il metallo diventa incandescente, muovi il filo in modo che la fiamma si avvicini all'anello. Per raffreddare il loop, toccare il bordo del terreno di coltura agar generando un suono sfrigolante. Continua a raccogliere l'inoculo sul cappio. Sollevare la metà inferiore del piatto. Sposta l'anello avanti e indietro dal bordo al centro nel primo quadrante della piastra. Riposizionare la piastra capovolta sul coperchio. Riaccendere l'anello di metallo. Girare la capsula di Petri di 90 gradi. Tocca l'anello vicino alla fine dell'ultima serie usando il motivo avanti e indietro, incrocia l'ultima metà delle strisce nel primo quadrante, quindi spostati nel secondo quadrante vuoto. Una volta riempito il secondo quadrante, appoggiare la piastra. Ripetere la procedura di striature per il terzo e il quarto quadrante evitando il contatto con il primo quadrante. Per striare con uno stuzzicadenti sterile e piatto, tenere delicatamente l'estremità stretta tra il pollice e l'anulare con un angolo di 10-20 gradi rispetto al medio, utilizzare l'estremità larga per striare i quadranti. Capovolgere la piastra sul coperchio tra i quadranti e smaltire lo stuzzicadenti in modo appropriato. Procedere all'incubazione delle piastre striate capovolte. La procedura di colata su piastra enumera il numero totale di unità formanti colonie sulla superficie e all'interno dell'agar di una singola piastra. Impostare un timer per 10 minuti, quindi trasferire 18 millilitri di terreno di agar fuso da un bagnomaria a 55 gradi Celsius a un blocco di calore a 48 gradi Celsius ed equilibrare per 10 minuti. Etichettare il fondo di una capsula di Petri sterile. Se applicabile, includere il fattore di diluizione. Erogare ora un millilitro di campione al centro della capsula di Petri. Chiudere il coperchio. Togliete il tappo dal tubo di agar fuso e passate il bordo del tubo aperto attraverso una fiamma. Versare accuratamente l'agar agar nella capsula di Petri. Chiudere il coperchio, quindi mescolare il campione con l'agar facendo roteare delicatamente la piastra. Attendere 30 minuti per consentire all'agar di solidificarsi. Una volta che l'agar si è solidificato, capovolgere e posizionare la piastra in una stanza calda. La placcatura diffusa mira a separare i microrganismi contenuti in un piccolo volume di campione, distribuendo uniformemente le colonie risultanti sulla superficie dell'agar. Equilibrare una piastra a temperatura ambiente ed etichettarla in modo appropriato. Posizionare la piastra sul piatto girevole. Pipettare 0,1 millilitri di campione al centro dell'agar e chiudere il coperchio. Espellere l'ugello in un contenitore per rifiuti. Immergi l'asta di metallo in un becher di etanolo al 70% che copre l'intera parte inferiore dello spandiconcime e il primo pollice dello stelo e poi scola. Accendere l'etanolo in eccesso passando attraverso la fiamma di un bruciatore Bunsen. Quindi, aprire il coperchio della piastra di agar e raffreddare lo spandiconcime toccandolo con l'agar lungo il bordo vicino al bordo. Gira lentamente il giradischi. Tenendo delicatamente lo spandiconcime sulla superficie dell'agar, distribuire gradualmente il campione in modo uniforme su tutta la piastra con un movimento avanti e indietro mentre il giradischi gira. Chiudere il coperchio e lasciare che il campione si assorba completamente per almeno cinque minuti. Quindi, incubare la piastra capovolta. Innanzitutto, etichettare la piastra di agar in modo appropriato. Aprire il coperchio della piastra di agar. Quindi aprire il contenitore delle perle di vetro pre-sterilizzate e fiammeggiare il bordo. Erogare con cura da 10 a 12 perle di vetro sterili su una piastra di agar. Chiudere il coperchio della piastra e fiammeggiare il bordo del contenitore delle perle di vetro prima di riposizionare il tappo. Ora, pipettare il campione al centro dell'agar. Con un movimento orizzontale, agitare delicatamente le perle sulla superficie dell'agar sette volte. Se eseguita correttamente, la procedura suona come agitare le maracas. Ruotare la piastra di 60 gradi e agitare di nuovo orizzontalmente sette volte. Ancora una volta, ruota la piastra di 60 gradi e ripeti l'agitazione. Verificare che il campione sia assorbito. Quindi, versare le perle contaminate in un becher di raccolta contrassegnato contenente il 10% di candeggina. Incubare la piastra capovolta. Il test della placca è comunemente usato per rilevare e quantificare i batteri fagi. Coltivare i batteri indicatori in fase esponenziale e conservarli su ghiaccio. Quindi, etichettare due provette sterili per microcentrifuga fago e controllo e aggiungere rispettivamente 50 microlitri di campione di fago o tampone a ciascuna. Quindi, agitare la coltura batterica nel pallone, quindi trasferire un'aliquota di batteri in una provetta sterile e agitare delicatamente i batteri indicatori, quindi aggiungere 500 microlitri di batteri a ciascuna provetta di assorbimento. Mescolare muovendo delicatamente i tubi. Non pipettare mai i campioni di fagi a vorticare o pipettare energicamente. Incubare la miscela di batteri fagi a una temperatura appropriata per il ceppo indicatore per 20 minuti. Nel frattempo, trasferisci due tubi di agar morbido da un bagnomaria a 55 gradi Celsius a un blocco riscaldante a 48 gradi Celsius. Equilibrare per 10 minuti. Etichettare due piastre di agar duro nutriente prive di condensa pre-bilanciate a temperatura ambiente. Rimuovere un tubo di agar morbido dal blocco termico e verificare che il contenuto non sia troppo caldo per essere toccato. Quindi, trasferire asetticamente la miscela dalla provetta di assorbimento dei fagi alla provetta morbida per agar. Quindi, ruotare rapidamente tra i palmi delle mani per mescolare il contenuto. Con la provetta in una mano, aprire il coperchio della piastra di agar dura con l'altra mano. Versare immediatamente l'intero contenuto della provetta sulla superficie di una piastra di agar dura. Scuotere il piatto rapidamente e delicatamente. Chiudere il coperchio e posizionare la piastra su un piano per 30 minuti fino a quando l'agar morbido non si solidifica. Successivamente, ripetere la procedura per la provetta di assorbimento di controllo trasferendo la miscela di controllo in una provetta di agar morbido. Mescolandolo, versando il contenuto su una piastra di agar dura, facendola oscillare e lasciando solidificare l'agar morbido per 30 minuti. Ispezionare le piastre per la formazione di placca. Per isolare una placca da una miscela eterogenea, perforare accuratamente il centro con uno stuzzicadenti sterile e trasferire l'inoculo in una provetta da microcentrifuga sterile contenente 100 microlitri di tampone fagico. Continuare a purificare questo lisato ripetendo il test della placca da tre a sei volte con diluizioni seriali, se necessario. La placcatura di replica sfrutta un fenotipo selezionabile consentendo il confronto della crescita cellulare su una piastra primaria con piastre secondarie. Segna una griglia sul fondo della piastra, etichetta la piastra primaria e numera i quadrati risultanti. Ora, utilizzare la tecnica asettica per rimuovere uno stuzzicadenti pre-sterilizzato dal becher, tamponare il centro di ogni quadrato con un campione di cellule e smaltire lo stuzzicadenti in un apposito contenitore per i rifiuti. Incubare la piastra primaria. Impilare la piastra primaria e tutte le piastre secondarie. Posizionare un segno di orientamento sul lato della metà inferiore delle piastre. Ora togliete un panno di velluto sterile dal suo involucro e posizionatelo sul blocco cilindrico. Quindi, posizionare il supporto allineando i segni sul supporto con quelli sul blocco. Notare il segno di orientamento sul blocco e sul supporto. Quindi, rimuovere il coperchio dalla piastra principale. Allineare i segni di orientamento sulla piastra e sul blocco. Abbassare la piastra in modo che la superficie dell'agar tocchi il panno di vellutino. Con la punta delle dita, premere leggermente ma uniformemente sul retro della piastra primaria e quindi sollevarla con cautela dal blocco. Conferma che l'impronta delle cellule può essere vista sul velluto. Riposizionare il coperchio sulla piastra. Ora, ripeti in sequenza il protocollo sul panno di velluto con ciascuna delle piastre secondarie. Utilizzare l'impronta vellutata delle cellule della piastra primaria per inoculare fino a otto piastre secondarie ordinate dal substrato meno favorevole a quello più favorevole. Infine, come controllo positivo, per l'ultima piastra della serie, utilizzare il terreno di agar in cui dovrebbero crescere tutti i ceppi testati. Fissare insieme le piastre invertite con del nastro adesivo e incubarle. Ispezionare le piastre secondarie per la crescita. Spegni il bruciatore Bunsen, quindi metti via tutte le scorte. Mettere gli indumenti da laboratorio contaminati, gli articoli in vetro e i rifiuti pericolosi nell'apposito contenitore per lo smaltimento. Pulire l'area di lavoro con disinfettante. Infine, lavarsi accuratamente le mani con sapone antisettico e acqua tiepida. La Serratia Marcescens è un proteobatterio gram negativo, a forma di bastoncello, che produce un pigmento rossastro chiamato prodigiosina. Si trova comunemente nei bagni e sulle tende della doccia. In questo esempio, la tecnica streak-plate genera singole colonie nel quarto quadrante. Questa analisi dei batteri presenti in un campione d'acqua raccolto da una fontanella pubblica utilizza la tecnica Pour Plate. Si noti la differenza nell'aspetto delle colonie. Le colonie superficiali sono grandi e di forma circolare, mentre alcune colonie superficiali sono molto piccole e di forma irregolare. La tecnica Spread Plate è una componente importante negli esperimenti di arricchimento, selezione e screening. Ad esempio, il metodo copacabana è uno strumento di differenziazione nel classico schermo blu-bianco nella tecnologia del DNA ricombinante. Il fago T4 è un fago virulento a doppio filamento di DNA che infetta il suo ospite come Escherichia coli per lisi e rilasciare il fago della progenie. Questo saggio della placca su agar EHA mostra il fago in zone di schiarita di circa un millimetro di diametro. In assenza di particelle di fagi infettanti, la crescita batterica provoca una sospensione torbida di cellule nell'agar morbido in cui le colonie discrete non sono visibili. Nella tecnica di sovrapposizione di agar morbido, le morfologie della placca variano. Ad esempio, qui lo stesso ceppo ospite di micobatterio produce morfologie di placca distinte in presenza di microbatteri distruttori di fagi rispetto ai micobatteri fagi MSSS. Il potere della placcatura delle repliche risiede nello screening simultaneo di un gran numero di microrganismi. In questo caso, quattro ceppi di pseudomonas sono stati testati in duplicato per la crescita su tre diverse fonti di carbonio. Acetammide, lattosio e glicina. Qui, la piastra primaria è un terreno YTA completo inoculato con i quattro ceppi come indicato. I ceppi mostrano modelli di crescita variabili su piastre replica di terreno MSA minimo integrato con una singola fonte di carbonio acetammide, lattosio o glicina. Tutti i ceppi crescono sull'ultima piastra di controllo positiva che conferma che le cellule sono state trasferite a tutte le piastre secondarie di questa serie. La tabulazione di questi risultati della piastra di replica descrive lo screening simultaneo dei diversi ceppi di tipo selvatico per i requisiti di crescita caratteristici.

- Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire le procedure di placcatura senza contaminare terreni o colture e anche di utilizzare il metodo di placcatura appropriato per qualsiasi attività sperimentale in laboratorio. Diventare esperti con queste tecniche richiede pratica. Tuttavia, con un'adeguata formazione, le procedure di placcatura descritte in questo video diventeranno una seconda natura quando si lavora al banco di laboratorio.