Aseptische Labortechnik: Überzug Methoden

[Erzähler] Dieses Protokoll beinhaltet aseptische Techniken in Beschichtungsmethoden, die zur Isolierung, Vermehrung oder Zählung von Mikroorganismen wie Bakterien und Phagen verwendet werden. Zu den Verfahren gehört das Streifenplattieren von Bakterienkulturen, um einzelne Kolonien zu isolieren. Gießen Sie die Beschichtung, um die Bakterienkonzentration zu bestimmen. Und verteilen Sie die Plattierung, um lebensfähige Bakterienkolonien aufzuzählen. Soft-Agar-Overlays werden verwendet, um Phagen zu isolieren und Plaques zu zählen, während die Replikationsplattierung Zellen in einem identischen räumlichen Muster von einer Platte auf eine andere überträgt. Letztendlich reichen die praktischen Anwendungen dieser Techniken zur Kultivierung von Mikroorganismen von der Identifizierung von Bakterien in der Umwelt bis hin zu technologischen Fortschritten in der molekularen Genetik und Hochdurchsatz-Bioassays.

- Im Allgemeinen können Personen, die mit diesen Beschichtungsmethoden noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Manipulationen sorgfältige und koordinierte Bewegungen erfordern, um den Kontakt mit nicht sterilen Oberflächen zu vermeiden. Das Erlernen dieser Routineverfahren erfordert Training und Übung. Die Verfahren werden von meinem Laborkoordinator, Dr. Kris Reddi, demonstriert.

- [Erzähler] Beginnen Sie die Arbeit mit Mikroorganismen, indem Sie die Laborregeln und Sicherheitsvorkehrungen kennen, einschließlich der Einstufung biologischer Gefahren, der Dekontamination von Abfällen und der Entsorgung. Vergewissern Sie sich, dass alle Instrumente, Lösungen und Medien für Beschichtungsverfahren steril sind. Richten Sie auch einen übersichtlichen Arbeitsbereich ein. Reinigen Sie es mit Desinfektionsmittel. Stellen Sie einen Bunsenbrenner mit einem Rohr auf, das an einer Gasleitung befestigt ist, und ordnen Sie die notwendigen Vorräte mit ordnungsgemäß gekennzeichneten Materialien an. Waschen Sie sich die Hände gründlich mit antiseptischer Seife und warmem Wasser. Zuerst die Hände mit warmem, fließendem Wasser befeuchten, dann Seife auftragen und gründlich verteilen. Reiben Sie die Hände kräftig und erzeugen Sie Reibung auf allen Oberflächen, einschließlich Daumen, Fingerrücken, Handrücken und unter den Fingernägeln. Spülen Sie dann gründlich ab, um Seifenreste zu entfernen, und trocknen Sie sie mit Papiertüchern, die aus einem Halter ausgegeben werden. Schließen Sie zum Schluss mit einem frischen Papiertuch den Wasserhahn. Das Streak-Plate-Verfahren wurde entwickelt, um Reinkulturen von Bakterien oder Kolonien aus gemischten Populationen durch einfache mechanische Trennung zu isolieren. Nehmen Sie eine Agarplatte aus einer vier Grad Celsius warmen Kühlbox und wärmen Sie sie auf Raumtemperatur vor. Wählen Sie ein Werkzeug aus der Reihe der Instrumente aus, um die Platte zu streifen. Stellen Sie sicher, dass die Platte trocken ist und sich kein Kondenswasser auf dem Deckel bildet. Beschrifte den Boden einer Agarplatte um den Rand herum. Wenn Sie geübt sind, verwenden Sie eine einzige Platte für mehrere Proben. Zünden Sie dann einen Bunsenbrenner an, um die Metallschlaufe zu entflammen. Beginne drei bis vier Zentimeter von der Metallschlaufe entfernt mit dem Draht in der Spitze des blauen Kegels, dem heißesten Teil der Bunsenbrennerflamme. Wenn das Metall glühend heiß wird, bewege den Draht so, dass sich die Flamme der Schlaufe nähert. Um den Loop zu kühlen, berühren Sie den Rand des Agar-Mediums, wodurch ein brutzelndes Geräusch entsteht. Nehmen Sie weiterhin das Inokulum an der Schlaufe auf. Hebe die untere Hälfte des Tellers an. Bewegen Sie die Schlaufe vom Rand zur Mitte im ersten Quadranten der Platte hin und her. Legen Sie die umgedrehte Platte wieder auf den Deckel. Flammen Sie die Metallschlaufe erneut an. Drehen Sie die Petrischale um 90 Grad. Berühre die Schleife am Ende des letzten Streifens mit dem Hin- und Her-Muster, überkreuze die letzte Hälfte der Streifen im ersten Quadranten und gehe dann in den leeren zweiten Quadranten. Sobald der zweite Quadrant gefüllt ist, setzen Sie den Teller ab. Wiederholen Sie den Streifenvorgang für den dritten und vierten Quadranten und vermeiden Sie dabei den Kontakt mit dem ersten Quadranten. Zum Schlieren mit einem sterilen, flachen Zahnstocher halten Sie das schmale Ende vorsichtig zwischen Daumen und Ringfinger in einem Winkel von 10 bis 20 Grad zum Medium, verwenden Sie das breite Ende, um die Quadranten zu streifen. Drehen Sie die Platte zwischen den Quadranten wieder auf den Deckel und entsorgen Sie den Zahnstocher ordnungsgemäß. Fahren Sie fort, die gestreiften Platten kopfüber zu inkubieren. Das Pour Plate Procedure zählt die Gesamtzahl der koloniebildenden Einheiten auf der Oberfläche und innerhalb des Agars einer einzelnen Platte auf. Stellen Sie einen Timer auf 10 Minuten, dann übertragen Sie 18 Milliliter geschmolzenes Agarmedium aus einem 55 Grad Celsius warmen Wasserbad auf einen 48 Grad Celsius heißen Block und äquilibrieren Sie es 10 Minuten lang. Beschriften Sie den Boden einer sterilen Petrischale. Gegebenenfalls den Verdünnungsfaktor angeben. Geben Sie nun einen Milliliter Probe in die Mitte der Petrischale. Schließen Sie den Deckel. Entfernen Sie die Kappe von der Tube mit dem geschmolzenen Agar und führen Sie den Rand der offenen Tube durch eine Flamme. Gieße das Agar vorsichtig in die Petrischale. Schließen Sie den Deckel und mischen Sie die Probe mit dem Agar, indem Sie die Platte vorsichtig schwenken. Warten Sie 30 Minuten, damit sich der Agar verfestigen kann. Sobald der Agar fest geworden ist, drehen Sie die Platte um und stellen Sie sie in einen warmen Raum. Ziel des Spread-Plating ist es, Mikroorganismen, die in einem kleinen Probenvolumen enthalten sind, zu trennen und die resultierenden Kolonien gleichmäßig über die Agaroberfläche zu verteilen. Äquilibrieren Sie eine Platte auf Raumtemperatur und beschriften Sie sie entsprechend. Positionieren Sie die Platte auf dem Drehteller. Pipettieren Sie 0,1 Milliliter der Probe in die Mitte des Agars und schließen Sie den Deckel. Werfen Sie die Spitze in einen Abfallbehälter. Tauchen Sie den Metallstab in ein Becherglas mit 70 % Ethanol, das den gesamten unteren Teil des Spreizers und den ersten Zentimeter des Stiels bedeckt, und lassen Sie ihn dann abtropfen. Entzünden Sie überschüssiges Ethanol, indem Sie durch die Flamme eines Bunsenbrenners laufen. Öffnen Sie dann den Deckel der Agarplatte und kühlen Sie den Spreizer ab, indem Sie ihn entlang der Kante in der Nähe des Randes mit dem Agar berühren. Drehen Sie den Plattenteller langsam. Halten Sie den Spreader sanft auf der Oberfläche des Agars und verteilen Sie die Probe allmählich gleichmäßig über die gesamte Platte, indem Sie eine Hin- und Herbewegung ausführen, während sich der Drehteller dreht. Schließen Sie den Deckel und lassen Sie die Probe mindestens fünf Minuten lang gründlich einziehen. Inkubieren Sie dann die umgekehrte Platte. Beschriften Sie zunächst die Agarplatte entsprechend. Öffne den Deckel der Agarplatte. Öffnen Sie dann den Behälter mit den vorsterilisierten Glasperlen und flammen Sie den Rand ab. Geben Sie vorsichtig 10 bis 12 sterile Glasperlen auf eine Agarplatte. Schließen Sie den Deckel der Platte und flammen Sie den Rand des Glasperlenbehälters ab, bevor Sie den Deckel wieder aufsetzen. Pipettieren Sie nun die Probe auf die Mitte des Agars. Schütteln Sie die Kügelchen in einer horizontalen Bewegung sieben Mal sanft über die Oberfläche des Agars. Wenn es richtig gemacht wird, hört sich die Prozedur an, als würde man Maracas schütteln. Drehen Sie die Platte um 60 Grad und schütteln Sie sie erneut sieben Mal waagerecht. Drehen Sie die Platte erneut um 60 Grad und wiederholen Sie das Schütteln. Vergewissern Sie sich, dass die Probe absorbiert wird. Gießen Sie dann die kontaminierten Kügelchen in ein gekennzeichnetes Auffangbecherglas mit 10 % Chlorbleiche. Inkubieren Sie die umgekehrte Platte. Der Plaque-Assay wird häufig zum Nachweis und zur Quantifizierung von Bakterienphagen verwendet. Die Indikatorbakterien in die exponentielle Phase kultivieren und auf Eis lagern. Markieren Sie dann zwei sterile Mikrozentrifugenröhrchen mit Phagen und Kontrolle und fügen Sie jeweils 50 Mikroliter Phagenprobe bzw. Puffer hinzu. Als nächstes wird die Bakterienkultur im Kolben geschwenkt, dann ein Aliquot von Bakterien in ein steriles Röhrchen überführt und die Indikatorbakterien vorsichtig verwirbelt, dann 500 Mikroliter Bakterien in jedes Absorptionsröhrchen gegeben. Mischen Sie, indem Sie die Tuben vorsichtig schnippen. Phagenproben niemals vortexen oder kräftig pipettieren. Die Phagenbakterienmischung wird 20 Minuten lang bei einer für den Indikatorstamm geeigneten Temperatur inkubiert. In der Zwischenzeit werden zwei weiche Agar-Röhrchen aus einem 55 Grad Celsius warmen Wasserbad in einen 48 Grad Celsius warmen Heizblock übertragen. 10 Minuten lang äquilibrieren. Beschriften Sie zwei kondensationsfreie Nährstoff-Hartagarplatten, die auf Raumtemperatur voräquilibriert sind. Nehmen Sie ein weiches Agarrohr aus dem Heizblock und prüfen Sie, ob der Inhalt nicht zu heiß ist, um ihn anzufassen. Übertragen Sie anschließend die Mischung aseptisch aus dem Phagenabsorptionsröhrchen in das weiche Agarröhrchen. Drehen Sie dann schnell zwischen den Handflächen, um den Inhalt zu mischen. Öffnen Sie mit dem Röhrchen in der einen Hand mit der anderen Hand den Deckel der Hartagarplatte. Gießen Sie sofort den gesamten Inhalt des Röhrchens auf die Oberfläche einer harten Agarplatte. Den Teller schnell und vorsichtig schaukeln. Schließen Sie den Deckel und stellen Sie die Platte 30 Minuten lang auf eine Waage, bis sich der weiche Agar verfestigt. Wiederholen Sie als Nächstes den Vorgang für das Kontrollabsorptionsröhrchen, indem Sie die Kontrollmischung in ein weiches Agarröhrchen überführen. Mischen, den Inhalt auf eine harte Agarplatte gießen, diese schaukeln und den weichen Agar 30 Minuten lang fest werden lassen. Untersuchen Sie die Platten auf Plaquebildung. Um eine Plaque aus einer heterogenen Mischung zu isolieren, stanzen Sie vorsichtig mit einem sterilen Zahnstocher in die Mitte und geben Sie das Inokulum in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikrolitern Phagenpuffer. Setzen Sie die Reinigung dieses Lysats fort, indem Sie den Plaque-Assay drei- bis sechsmal mit seriellen Verdünnungen wiederholen, je nach Bedarf. Das Replica-Plattieren nutzt einen selektierbaren Phänotyp, indem es den Vergleich des Zellwachstums auf einer Primärplatte mit dem einer Sekundärplatte ermöglicht. Markieren Sie ein Raster an der Unterseite der Platte, beschriften Sie die Primärplatte, und nummerieren Sie die resultierenden Quadrate. Verwenden Sie nun eine aseptische Technik, um einen vorsterilisierten Zahnstocher aus dem Becherglas zu nehmen, tupfen Sie die Mitte jedes Quadrats mit einer Zellprobe ab und entsorgen Sie den Zahnstocher in einem geeigneten Abfallbehälter. Inkubieren Sie die Primärplatte. Stapeln Sie die Primärplatte und alle Sekundärplatten. Platzieren Sie eine Ausrichtungsmarkierung an der Seite der unteren Hälfte der Platten. Nehmen Sie nun ein steriles Samttuch aus der Hülle und legen Sie es auf den zylindrischen Block. Platzieren Sie als Nächstes den Halter, indem Sie die Markierungen auf dem Halter mit denen auf dem Block ausrichten. Beachten Sie die Ausrichtungsmarkierung auf dem Block und der Halterung. Entfernen Sie als Nächstes den Deckel von der Primärplatte. Richten Sie die Ausrichtungsmarkierungen auf der Platte und dem Block aus. Senken Sie die Platte so ab, dass die Oberfläche des Agars das Samttuch berührt. Drücken Sie mit den Fingerspitzen leicht, aber gleichmäßig auf die Rückseite der Primärplatte und heben Sie sie dann vorsichtig vom Block ab. Vergewissern Sie sich, dass der Abdruck der Zellen auf dem Samt zu sehen ist. Setze den Deckel wieder auf die Platte. Wiederholen Sie nun nacheinander das Protokoll auf dem Samttuch mit jeder der Sekundärplatten. Verwenden Sie den samtigen Abdruck von Zellen aus der Primärplatte, um bis zu acht Sekundärplatten zu impfen, die vom ungünstigsten bis zum günstigsten Substrat geordnet sind. Als Positivkontrolle wird schließlich für die letzte Platte der Serie Agarmedium verwendet, in dem alle getesteten Stämme wachsen sollen. Klebe die umgedrehten Platten zusammen und inkubiere sie. Überprüfen Sie die Sekundärplatten auf Wachstum. Schalten Sie den Bunsenbrenner aus und räumen Sie alle Vorräte weg. Legen Sie kontaminierte Laborkleidung, Glaswaren und Sonderabfälle in den entsprechenden Entsorgungsbehälter. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desinfektionsmittel. Waschen Sie sich zum Schluss gründlich die Hände mit antiseptischer Seife und warmem Wasser. Serratia Marcescens ist ein gramnegatives, stäbchenförmiges Proteobacterium, das ein rötliches Pigment namens Prodigiosin produziert. Sie wächst häufig in Badezimmern und auf Duschvorhängen. In diesem Beispiel erzeugt die Streak-Plate-Technik einzelne Kolonien im vierten Quadranten. Bei dieser Analyse von Bakterien, die in einer Wasserprobe enthalten sind, die aus einem öffentlichen Trinkbrunnen entnommen wurde, wird die Pour Plate-Technik verwendet. Beachten Sie den Unterschied im Aussehen der Kolonien. Oberflächenkolonien sind groß und kreisförmig, während einige Oberflächenkolonien sehr klein und unregelmäßig geformt sind. Die Spread-Plate-Technik ist eine wichtige Komponente bei Anreicherungs-, Selektions- und Screening-Experimenten. So ist beispielsweise die Copacabana-Methode ein Differenzierungswerkzeug im klassischen Blau-Weiß-Raster der rekombinanten DNA-Technologie. Phagen T4 ist ein virulenter doppelsträngiger DNA-Phagen, der seinen Wirt als Escherichia coli infiziert, um Nachkommenphagen zu lysieren und freizusetzen. Dieser Plaque-Assay an EHA-Agar zeigt Phagen in Clearing-Zonen mit einem Durchmesser von etwa einem Millimeter. In Abwesenheit von infizierenden Phagenpartikeln führt das Bakterienwachstum zu einer trüben Suspension der Zellen im weichen Agar, in der keine einzelnen Kolonien sichtbar sind. Bei der Soft-Agar-Overlay-Technik variieren die Plaque-Morphologien. Zum Beispiel produziert hier derselbe Mycobacterium-Wirtsstamm in Gegenwart von Mikrobakterien-Phagenzerstörern unterschiedliche Plaque-Morphologien im Vergleich zu Mykobakterien-Phagen-MSSS. Die Stärke des Replica Plattating liegt im gleichzeitigen Screening einer großen Anzahl von Mikroorganismen. In diesem Fall wurden vier Pseudomonas-Stämme im Duplikat auf ihr Wachstum an drei verschiedenen Kohlenstoffquellen getestet. Acetamid, Laktose und Glycin. Hier ist die Primärplatte ein vollständiges YTA-Medium, das wie angegeben mit den vier Stämmen inokuliert ist. Die Stämme zeigen variable Wachstumsmuster auf Replikplatten aus minimalem MSA-Medium, das mit einer einzigen Kohlenstoffquelle Acetamid, Laktose oder Glycin ergänzt wird. Alle Stämme wachsen auf der letzten positiven Kontrollplatte, die bestätigt, dass die Zellen auf alle Sekundärplatten dieser Serie übertragen wurden. Die tabellarische Darstellung dieser Replikplattenergebnisse zeigt das gleichzeitige Screening der verschiedenen Wildtypstämme auf charakteristische Wachstumsanforderungen.

- Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Beschichtungsverfahren durchführen können, ohne Medien oder Kulturen zu kontaminieren, und wie Sie die geeignete Beschichtungsmethode für jede gegebene experimentelle Aufgabe im Labor anwenden können. Um diese Techniken zu beherrschen, braucht es Übung. Mit der richtigen Schulung werden die in diesem Video beschriebenen Beschichtungsverfahren bei der Arbeit am Labortisch jedoch zur zweiten Natur.