Name: Aseptische Labortechnik: Überzug Methoden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min
Description: Lernen Sie aseptische Labortechniken zur Isolierung, Vermehrung und Quantifizierung von Mikroorganismen wie Bakterien und Phagen. Diese Methoden ermöglichen präzise mikrobiologische Analysen ohne Kontamination.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Besonderer Dank geht an Cori Sanders bei Iroc Designs zur Vorbereitung von Illustrationen und Kris Reddi und Bhairav ​​Shah an der UCLA für den Aufbau und die Unterstützung der Probe Kulturen mit Zahlen. Finanzierung für dieses Projekt wurde von HHMI (HHMI Grant Nr. 52006944) zur Verfügung gestellt.

<ol><li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarker%2C+K+%22At+the+Bench%3A+A+Laboratory+Navigator%22">At the Bench: A Laboratory Navigator</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1998).</li>
<li>US Department of Health and Human Services (DHHS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+Microbiological+And+Biomedical+Laboratories+%28BMBL%29%22">Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL)</a>. , 5th, U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> (2009).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+problems+of+animal+virology+as+studied+by+the+plaque+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Some problems of animal virology as studied by the plaque technique.</a> Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).</li>
<li>Fields, B. N., Knipe, D. M., Chanock, R. M., Hirsch, M. S., Melnick, J. L., Monath, T. P., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFields%2C+BN+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. 1, 2nd, Raven Press. New York, NY. (1991).</li>
<li>Gilbert, R. A., Ouwerkerk, D., Zhang, L. H., Klieve, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Research+Center+for+Beef+Genetic+Technologies.+In+vitro+detection+and+primary+cultivation+of+bacteria+producing+materials+inhibitory+to+ruminal+methanogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cooperative Research Center for Beef Genetic Technologies. In vitro detection and primary cultivation of bacteria producing materials inhibitory to ruminal methanogens.</a> Journal of Microbiological Methods. 80, 217-218 (2010).</li>
<li>Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+agar+plate+method+for+quantifying+viable+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria.</a> BioTechniques. 23, 648-650 (1997).</li>
<li>Karam, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaram%2C+JD+%22Molecular+Biology+of+Bacteriophage+T4%22">Molecular Biology of Bacteriophage T4</a>. , ASM Press. Washington, DC. (1994).</li>
<li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A., Roizman, B., Straus, S. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fundamental+Virology%22">Fundamental Virology</a>. , 4th, Lippincott, Williams, and Wilkins. Philadelphia, PA. (2001).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JH+%22A+Short+Course+in+Bacterial+Genetics%3A+A+Laboratory+Manual+and+Handbook+for+Escherichia+coli+and+related+bacteria%22">A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and related bacteria</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1992).</li>
<li>Mills, K. V., Gareau, J. R., Garcia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+modification+to+the+Copacabana+method+for+spreading+transformation+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Low-cost modification to the Copacabana method for spreading transformation mixtures.</a> BioTechniques. 39, 188(2005).</li>
<li>Jordan, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJordan%2C+T+%22RESEARCH%3A+National+Genomics+Research+Initiative+Phage+Resource+Laboratory+Manual%22">RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual</a>. , Howard Hughes Medical Institute. (2008).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning+-+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning - A Laboratory Manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Sanders, E. R., Miller, J. H. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSanders%2C+ER+%22Microbiologist%3A+A+Discovery-based+Course+in+Microbial+Ecology+and+Molecular+Evolution%22">Microbiologist: A Discovery-based Course in Microbial Ecology and Molecular Evolution</a>. , ASM Press. Washington, DC. (2010).</li>
<li>Slonczewski, J. L., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSlonczewski%2C+JL+%22Microbiology+-+An+Evolving+Science%22">Microbiology - An Evolving Science</a>. , 2nd, W.W. Norton & Co., Inc. New York, NY. (2011).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+Red-Polysaccharide+Interactions+in+Enumeration+and+Characterization+of+Cellulolytic+Bacteria+from+the+Bovine+Rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen.</a> Applied and Environmental Microbiology. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Wise, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWise%2C+K+%22Preparing+Spread+Plates+Protocols%22">Preparing Spread Plates Protocols</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols">http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols</a> (2006).</li>
<li>Worthington, M., Luo, R. Q., Pelo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copacabana+method+for+spreading+E.+coli+and+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Copacabana method for spreading E. coli and yeast colonies.</a> BioTechniques. 30, 738-742 (2001).</li>
<li>American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atcc.org/">http://www.atcc.org/</a> (2012).</li>
<li>EPA Microbiology Home Page. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html">http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html</a> (2012).</li>
<li>The GENE Project: Laboratory Methods and Materials. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html">http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html</a> (2012).</li>
<li>Joint Genome Institute (JGI) Genome Sequencing Protocols: Library Plating Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html">http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html</a> (2012).</li>
<li>Microbial Genetics (maintained by Stanley Maloy at UCSD). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics">http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics</a> (2012).</li>
<li>Organization of American States (OAS) Department of Sustainable Development (DSD). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm">http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm</a> (2012).</li>
<li>Public Health Agency of Canada: Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss">http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss</a> (2012).</li>
<li>United States Environmental Protection Agency (EPA) Office of Water. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://water.epa.gov">http://water.epa.gov</a> (2012).</li>
<li>American Society for Microbiology (ASM)'s Curriculum Recommendations Microbiology Majors Program. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html">http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html</a> (2012).</li>
<li>Introductory Course in Microbiology. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html">http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html</a> (2012).</li>
</ol>

Ich habe nichts zu offenbaren.

Kultivierung von Mikroorganismen umfasst eine Reihe von Beschichtungsverfahren, die alle, dass aseptischen Technik in der Manipulation von Zellen und Medien aufrechterhalten werden müssen. Fünf verschiedene Verfahren wurden in diesem Protokoll beschrieben. Obwohl diese Plattierungstechniken routinemäßig verwendet, um Bakterien und Phagen zu manipulieren, können sie auch zu Säugetierzellkulturen und eukaryotischen Mikroorganismen üblicherweise in der molekularen Genetik, wie Hefe (dh, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe), Algen und Protozoen angewendet werden ( dh, Volvox, Chlamydomonas, Amöben, Paramecium) und Nematoden (z. B. Caenorhabditis elegans). Es gibt auch zahlreiche (und noch ausgefeiltere) Variationen von jeder Plating-Verfahren in Abhängigkeit von der experimentellen Ziel oder Organismus unter-Studie. Somit ist es wichtig, nicht nur die am besten geeignete Technik für ein bestimmtes Experiment oder Ziel-Mikroorganismus, sondern auch, um eine maßgeschneiderte Methodik, tHat die experimentellen Ergebnisse entsprechend richtet sich das Forschungsinteresse Frage oder ein Problem. Einige der wichtigsten aktuellen Anwendungen der Beschichtung Techniken in diesem Protokoll diskutiert beinhalten technologische Fortschritte, die High-Throughput-Screening-Ergebnisse für Wirkstoffforschung und Experimente führen. Verwenden Sie z. B. Genom-Sequenzierung Zentren der &quot;Copacabana-Methode&quot; für Spread-Plating Klon-Bibliotheken, die sich E. coli-Zellen mit Plasmiden, die DNA-Fragmente aus dem Genom eines Mikroorganismus transformiert. Weil Dutzende von großen Platten (so genannte Bioassay Trays) auf einmal bereit sind, wird eine automatisierte Schüttler verwendet, um die Glasperlen für den gesamten Stapel von Schalen zu schütteln. Darüber hinaus bei der Auswahl von Kolonien von diesen Platten nach der Inkubation wird ein Roboter-Kolonie-Picker verwendet, um Zellen von entsprechenden Kolonien als Inokulum für LB-Medium in 384-Well Mikroplatten zu sammeln. Für diese High-Throughput-Screening-Assay, die verfahrensrechtlichen Grundsätze des Spread-pEnde der Technik gelten, sondern Technologie ermöglicht verschiedene Schritte zu automatisieren und so skaliert, dass eine große Anzahl von Proben gleichzeitig und innerhalb eines kurzen Zeitrahmens analysiert werden zu können. Biotechnologie-und Pharmaunternehmen investieren erhebliche Ressourcen in die Entwicklung von High-Throughput-Technologien für die grundlegenden Techniken in der Mikrobiologie und Molekulargenetik. Zum Beispiel gibt es Mehrkanal-Mikroliterpipetten, um die Lautstärke Transfers für bis zu 8 oder 12 Proben auf einmal durchzuführen. Es gibt sogar Roboter-Arbeitsstationen, die Manöver eine 96-Kanal-Pipette Kopf! Diese Bemühungen betreffen multidisziplinäre Teams von Wissenschaftlern, Biologen, die Paarung methodische Kompetenz besitzen, mit Ingenieuren und Programmierern, die die Instrumentierung notwendig, um die mechanischen Abläufe mit den Versuchen verbundenen Aufgaben entwickeln können. Unabhängig von der Anwendung der Forschung ist es das Ziel von Unternehmen bei der Entwicklung dieser Technologien teilten das gleiche - Labor automatisierenry Prozesse, Tools, Systeme und Instrumente, so dass sie weniger arbeitsintensiv und effizienter.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Hefe-Trypton-Agar (YTA)
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>Hefeextrakt</td>
			<td>2,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>10,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>15,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destilliertes Wasser</td>
			<td>bis zu 1000,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7,0</td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
Autoklav bei 121°; C 20 Minuten lang sterilisieren. Bei 4°C.
Wenn Sie Röhrchen für das Pour-Plate-Verfahren vorbereiten, lassen Sie den Agar auf ~55° abkühlen; C fügen Sie dann 2,0 ml 50 mg/ml Cycloheximid hinzu. 18,0 ml des geschmolzenen Agars pro 18 mm Röhrchen werden aseptisch dosiert und bei 4 °C gelagert. Der Agar verfestigt sich und muss vor der Verwendung in einem Dampfgarer oder einer Mikrowelle geschmolzen werden.
2. Minimaler Salz-Agar (MSA) + 0,1 % (w/v) Kohlenstoffquelle
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH2HPO4&bull; 2H2O</td>
			<td>2,14 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1,09 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>0,2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kohlenstoffquelle*</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spurensalzlösung**</td>
			<td>10,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>15,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destilliertes Wasser</td>
			<td>bis zu 1000,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7,0</td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
Autoklav bei 121°; C 20 Minuten lang sterilisieren. Bei 4°C.
* Zu den für die in Abbildung 13 dargestellten Experimenten verwendeten Kohlenstoffquellen gehören Acetamid, Laktose und Glycin.
** Die Spurensalzlösung wird in 0,1 N HCl wie folgt hergestellt. Es wird vor der Sterilisation auf die Basis gegeben (Autoklav bei 121°; C für 20 Minuten).
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>FeSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>300,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&bull; 4H2O</td>
			<td>180,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co(NO3)2&bull; 6H2O</td>
			<td>130,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>40,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2MoO4</td>
			<td>20,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&bull; 5H2O</td>
			<td>1,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1000,0 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (0,1 N)</td>
			<td>bis zu 1000,0 ml</td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
3. EHA-Weich-Agar (0,65 % w/v)
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>6,5 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Trypton</td>
			<td>13,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>NaCl</td>
			<td>8,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Na Citrat&bull; 2H2O</td>
			<td>2,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Glukose</td>
			<td>3,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Destilliertes Wasser</td>
			<td>bis zu 1000,0 ml</td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
Autoklav bei 121°; C 20 Minuten lang sterilisieren. Bei 4°C.
4. EHA-Hartagar (1,2 % w/v)
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>12,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>13,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td> 8,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Citrat&bull; 2H2O</td>
			<td> 2,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukose</td>
			<td> 3,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destilliertes Wasser</td>
			<td>bis zu 1000,0 ml</td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
Autoklav bei 121°; C 20 Minuten lang sterilisieren. Bei 4°C.
5. 1X Middlebrook Top Agar (MBTA weiches Agar, 0,5 % w/v)
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>100 mM CaCl2 Lager*</td>
			<td> 1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 flüssiges Medium: Sauber **</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2XTA ***</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
Schmelzen Sie 50 ml 2XTA und lassen Sie es auf ~55°C abkühlen. Fügen Sie mit aseptischer Technik die CaCl2 und 7H9 Brühe zum geschmolzenen Agar hinzu. 4,5 ml der Mischung pro 13 mm Röhrchen aseptisch dosieren und in einem 55°; C Brutkasten &#8804; 7 Tage. Abkühlen von MBTA auf Raumtemperatur oder 4°; C führt dazu, dass das CaCl2 aus der Lösung ausfällt.
* 100 mM CaCl2. Das Lager muss bei Raumtemperatur gelagert werden, um zu verhindern, dass CaCl2 außerhalb der Lösung ausfällt.
** 7H9 flüssiges Medium: Ordentlich
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>7H9 Brühe Boden</td>
			<td>4,7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Glycerinbestand</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destilliertes Wasser</td>
			<td>bis zu 900,0 ml</td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
Mischen Sie die Basis mit Wasser und fügen Sie dann das Glycerin unter Rühren hinzu. Autoklav bei 121°; C 20 Minuten lang sterilisieren. Bei 4°C.
*** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1,0 % w/v)
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>7H9 Brühe Boden</td>
			<td>4,7 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destilliertes Wasser</td>
			<td>bis zu 1000,0 ml </td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
Autoklav bei 121°; C 20 Minuten lang sterilisieren. 50 ml Aliquots in 100 ml Flaschen abfüllen und bei 4 °C lagern. 
6. Middlebrook 7H10 Agarplatten (MHA-Hartagar, 1,9 % w/v)
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>7H10 Agar-Basis</td>
			<td>19,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Glycerinbestand</td>
			<td>12,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destilliertes Wasser</td>
			<td>887,5 ml</td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
Mischen Sie die Agarbasis mit Wasser und fügen Sie dann das Glycerin unter Rühren hinzu. Erhitzen Sie die Lösung zum Sieden und rühren Sie dann eine Minute lang, um das Basispulver vollständig aufzulösen. Autoklav bei 121°; C 20 Minuten lang sterilisieren. Lassen Sie den Agar auf ~55° abkühlen; C fügen Sie dann aseptisch die folgenden Reagenzien hinzu: 
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			Zugabe <td>AD (vorgewärmt auf 37°; C)*</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mg/ml Carbenicillin **</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg/ml Cycloheximid **</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
* AD Ergänzung
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>NaCl > </td>
			<td>17 g > </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (Fraktion V)> </td>
			<TD>100 g> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-Glukose)> </td>
			<td>40 g> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destilliertes Wasser> </td>
			<td>bis zu 2000,0 ml> </td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
Sterilisieren Sie diese Lösung; Nicht autoklavieren. Bei 4°C.
** Filtersterilisieren und lagern Sie diese Lösungen bei 4°; C für &le; 60 Tage.
7. LB-Agar (1,5 % w/v) + X-Gal (60 &mu; g/ml)
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>10,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hefeextrakt</td>
			<td>5,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>10,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>15,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Destilliertes Wasser</td>
			<td>bis zu 1000,0 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH 7,5 bei 25°; C</td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
Autoklav bei 121°; C 20 Minuten lang sterilisieren. Lassen Sie den Agar auf ~55° abkühlen; C dann aseptisch 3,0 ml 20 mg/ml X-Gal-Lösung zugeben. Bereiten Sie die X-Gal-Brühe frisch zu, indem Sie 400 mg X-Gal in 20 ml Dimethylformamid (DMF) auflösen. </S>
Tabelle der spezifischen Reagenzien:
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>Name des Reagenzes</td>
			<td>Unternehmen</td>
			<td>Katalognummer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hefeextrakt</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>212750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypton</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>211705</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Becton Dickenson</td>
			<td>214030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>123340010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH2HPO4&bull; 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30435</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP 303-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetamid</td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>A-0500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laktose</td>
			<td>Fisher Scientific </td>
			<td>L6-500 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-7126</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&bull; 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8048</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&bull; 4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3634</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Co(NO3)2&bull; 6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2MoO4</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>213621000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&bull; 5H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>209198 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>038K1561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>46-100-RG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na Citrat&bull; 2H2O</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S279-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glukose (Dextrose)</td>
			<td>BD</td>
			<td>215530</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H9 Brühe Boden</td>
			<td>BD</td>
			<td>271310</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7H10 Agar-Basis</td>
			<td>BD</td>
			<td>262710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerin</td>
			<td>Shelton</td>
			<td>IB15760</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin (Fraktion V)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S71907</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-&#946;-D-galactopyranosid) </td>
			<td>Teknova</td>
			<td>X1205</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamid (DMF)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4551</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CDA19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorbleiche</td>
			<td>Chlorox</td>
			<td>02490/06644884</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CiDecon (Desinfektionsmittel)</td>
			<td>Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td>8504</td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle>
Tabelle der spezifischen Ausrüstung:
<table border="1">
	< Körper>
		<tr>
			<td>Name des Geräts</td>
			<td>Unternehmen</td>
			<td>Katalognummer</td>
			<td>Experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallschlaufen</td>
			<td>Amerikanische Bildungsprodukte</td>
			<td>S17352</td>
			<td>Streifenbeschichtung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Einweg-Plastikschlaufen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-602</td>
			<td>Streifenbeschichtung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holzstäbchen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>23-400-104</td>
			<td>Streifenbeschichtung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flache Zahnstocher</td>
			<td>Amerikanische Bildungsprodukte</td>
			<td>S67859</td>
			<td>Streifenbeschichtung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drehteller</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-758Q</td>
			<td>Spread-Plattierung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasstäbe</td>
			<td>Bellco Glas</td>
			<td>NC9004380</td>
			<td>Spread-Plattierung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 mm Glasperlen</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>11-312B</td>
			<td>Spread-Plattierung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samttuch</td>
			<td>Bel-Art Produkte</td>
			<td>09-718-2</td>
			<td>Replica-Beschichtung</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zylindrischer Block</td>
			<td>Bel-Art Produkte</td>
			<td>09-718-1</td>
			<td>Replica-Beschichtung</td>
		</tr>
	</Körper>
</Tabelle></td></tr></tbody></table>

aseptische labortechnik: Überzug methoden

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Mikroorganismen sind auf allen unbelebten Oberflächen schaffen allgegenwärtigen Quellen möglicher Kontamination im Labor. Experimentelle Erfolg beruht auf der Fähigkeit eines Wissenschaftlers auf Arbeitsflächen und Geräte zu sterilisieren sowie deren Kontakt mit sterilen Instrumenten und-Lösungen mit unsterilen Oberflächen. Hier präsentieren wir Ihnen die Schritte für mehrere Plating Verfahren routinemäßig im Labor verwendet werden, um zu isolieren, zu vermehren, oder aufzählen Mikroorganismen wie Bakterien und Phagen. Alle fünf Methoden integrieren aseptischen Technik oder Verfahren, die die Sterilität der experimentellen Materialien zu erhalten. Beschriebenen Verfahren umfassen (1) streifenfreie Beschichtung Bakterienkulturen, um einzelne Kolonien zu isolieren, (2) gießen-Plating und (3) Spread-Plating, lebensfähige Bakterien-Kolonien aufzählen, (4) Soft-Agar-Overlays zu Phagen-Plaques und enumerate isolieren, und ( 5) Replica-Plattierung, um Zellen aus einer Platte zur anderen in einer identischen räumlichen Muster zu übertragen. Diese Verfahren können bei t durchgeführt werdener Labortisch, vorausgesetzt, sie beinhalten nicht-pathogene Stämme von Mikroorganismen (Biosafety Level 1, BSL-1). Wenn die Arbeit mit BSL-2 Organismen, dann werden diese Manipulationen muss in einer biologischen Sicherheitswerkbank nehmen. Wenden Sie die aktuellste Ausgabe der Biosicherheit in mikrobiologischen und biomedizinischen Laboren (BMBL) sowie Material Safety Data Sheets (MSDS) für infektiöse Substanzen, um die Biohazard Klassifikation sowie die Sicherheitshinweise und Rückhalteeinrichtungen für den Mikroorganismus in Frage erforderlich zu bestimmen. Bakterienstämme und Phagen-Aktien können von der Forschung Forscher, Unternehmen und Sammlungen von bestimmten Organisationen wie der American Type Culture Collection (ATCC) bezogen werden beibehalten. Es wird empfohlen, nicht-pathogenen Stämme verwendet werden, wenn das Erlernen der verschiedenen Beschichtungsverfahren werden. Durch Befolgen der Verfahren in diesem Protokoll beschrieben, sollten die Studierenden in der Lage: <ul><li> Führen Plating Verfahren ohne eingeschleppte Verunreinigungenng Medien. </li><li> Isolieren Sie einzelne Bakterienkolonien von der Streak-Plating-Verfahren. </li><li> Verwendung Pour-Plattierung und Excel Plattierungsverfahren, um die Konzentration der Bakterien zu bestimmen. </li><li> Führen Weichagar Overlays bei der Arbeit mit Phagen. </li><li> Übertragen von Bakterienzellen aus einer Platte zur anderen unter Verwendung der Replika-abgeschieden werden. </li><li> Da eine experimentelle Aufgabe, wählen Sie den entsprechenden Beschichtungsverfahren. </li></ul>

Beim Arbeiten mit und Reagenzien zur Kultur von Mikroorganismen, muss aseptischen Technik praktiziert, um sicherzustellen, Kontamination zu minimieren werden. Eine Vielzahl von Beschichtungsverfahren werden routinemäßig verwendet, um zu isolieren, verbreiten oder aufzuzählen Bakterien und Phagen, die alle Verfahren, die die Sterilität der experimentellen Materialien zu erhalten übernehmen.

Aseptische Labortechnik: Überzug Methoden

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

[Erzähler] Dieses Protokoll beinhaltet aseptische Techniken bei Anzuchtmethoden, die zur Isolierung, Vermehrung oder Zählung von Mikroorganismen wie Bakterien und Phagen verwendet werden. Zu den Verfahren gehören Strichverimpfungen bakterieller Kulturen zur Isolierung einzelner Kolonien, Gießplatten zur Bestimmung der Bakterienkonzentration und Aufstrichplatten zur Zählung lebensfähiger bakterieller Kolonien. Weiche Agarüberlagerungen dienen der Isolierung von Phagen und der Zählung von Plaques, während Abdruckverimpfungen Zellen von einer Platte auf eine andere in einem identischen räumlichen Muster übertragen. Letztendlich reichen die praktischen Anwendungen dieser Techniken zur Kultivierung von Mikroorganismen von der Identifizierung von Bakterien in Umgebungen bis hin zu technologischen Fortschritten in der molekularen Genetik und Hochdurchsatz-Bioassays.– Personen, die mit diesen Ausstrichmethoden unerfahren sind, haben in der Regel Schwierigkeiten, da die Handgriffe sorgfältige und koordinierte Bewegungen erfordern, um Kontakt mit nicht sterilen Oberflächen zu vermeiden. Das Erlernen dieser Routineverfahren erfordert Schulung und Übung. Die Demonstration der Verfahren übernimmt meine Laborleiterin, Dr. Kris Reddi.- [Erzähler] Beginnen Sie die Arbeit mit Mikroorganismen, indem Sie die Laborregeln und Sicherheitsvorkehrungen kennen, einschließlich der Biohazard-Klassifizierung, der Dekontamination und Entsorgung von Abfällen. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte, Lösungen und Medien für die Ausplattierungsverfahren steril sind. Richten Sie außerdem einen aufgeräumten Arbeitsplatz ein und reinigen Sie ihn mit Desinfektionsmittel. Stellen Sie einen Bunsenbrenner mit einem an eine Gasleitung angeschlossenen Schlauch auf, ordnen Sie die benötigten Materialien an und beschriften Sie diese ordnungsgemäß. Waschen Sie anschließend gründlich Hände mit antiseptischer Seife und warmem Wasser. Befeuchten Sie zunächst die Hände mit warmem, fließendem Wasser, tragen Sie dann Seife auf und verteilen Sie sie gründlich. Reiben Sie die Hände kräftig, wobei Sie Reibung auf allen Flächen erzeugen, einschließlich Daumen, Finger- und Handrücken sowie unter den Fingernägeln. Spülen Sie anschließend gründlich, um die restliche Seife zu entfernen, und trocknen Sie die Hände mit aus einem Halter entnommenen Papiertüchern ab. Schalten Sie schließlich den Wasserhahn mit einem frischen Papiertuch aus. Das Strichstrich-Verfahren dient dazu, reine Kulturen von Bakterien oder Kolonien aus gemischten Populationen durch einfache mechanische Trennung zu isolieren. Entnehmen Sie eine Agarplatte aus einem Kühlschrank mit vier Grad Celsius und temperieren Sie sie auf Raumtemperatur vor. Wählen Sie ein Werkzeug aus dem Sortiment an Instrumenten zur Ausstrichplatten-Behandlung aus. Stellen Sie sicher, dass die Platte trocken ist und keine Kondensation auf dem Deckel vorhanden ist. Beschriften Sie den Boden einer Agarplatte am Rand. Wenn Sie geübt sind, verwenden Sie eine einzelne Platte für mehrere Proben. Zünden Sie dann einen Bunsenbrenner an, um die Metallöse zu flammen. Beginnen Sie drei bis vier Zoll von der Metallöse entfernt, indem Sie den Draht in die Spitze des blauen Kegels halten, dem heißesten Teil der Bunsenbrenner-Flamme. Wenn das Metall rotglühend ist, bewegen Sie den Draht so, dass die Flamme sich der Öse nähert. Zum Abkühlen der Öse berühren Sie den Rand des Agarmediums, wodurch ein Zischgeräusch entsteht. Nehmen Sie anschließend den Inokulum mit der Öse auf. Heben Sie die untere Hälfte der Platte an. Bewegen Sie die Öse im ersten Quadranten der Platte im Zickzackmuster vom Rand zur Mitte. Stellen Sie die umgedrehte Platte wieder auf den Deckel. Flammen Sie die Metallöse erneut. Drehen Sie die Petrischale um 90 Grad. Berühren Sie die Öse nahe dem Ende des letzten Strichs, verwenden Sie das Zickzackmuster, kreuzen Sie die letzte Hälfte der Striche im ersten Quadranten und bewegen Sie sich dann in den leeren zweiten Quadranten. Sobald der zweite Quadrant gefüllt ist, stellen Sie die Platte ab. Wiederholen Sie den Ausstrichvorgang für den dritten und vierten Quadranten, wobei Sie den Kontakt mit dem ersten Quadranten vermeiden. Bei der Ausstrichung mit einem sterilen, flachen Holzstäbchen halten Sie das schmale Ende vorsichtig zwischen Daumen und Ringfinger in einem Winkel von 10 bis 20 Grad zum Medium und verwenden das breite Ende, um die Quadranten auszustreichen. Drehen Sie die Platte zwischen den Quadranten wieder auf den Deckel und entsorgen Sie das Holzstäbchen ordnungsgemäß. Inkubieren Sie die ausgestrichenen Platten anschließend verkehrt herum. Das Gießplatten-Verfahren dient der Zählung der Gesamtanzahl koloniebildender Einheiten auf der Oberfläche und innerhalb des Agars einer einzelnen Platte. Stellen Sie einen Timer auf 10 Minuten, überführen Sie dann 18 Milliliter geschmolzenes Agarmedium aus einem Wasserbad mit 55 Grad Celsius in einen Wärmespeicher mit 48 Grad Celsius und lassen Sie es 10 Minuten lang einklimatisieren. Beschriften Sie den Boden einer sterilen Petrischale. Falls zutreffend, geben Sie den Verdünnungsfaktor an. Dispensieren Sie nun ein Milliliter Probe in die Mitte der Petrischale. Schließen Sie den Deckel. Entfernen Sie die Kappe vom Rohr mit geschmolzenem Agar und führen Sie den Rand des offenen Rohrs durch eine Flamme. Gießen Sie das Agar vorsichtig in die Petrischale. Schließen Sie den Deckel und mischen Sie die Probe mit dem Agar, indem Sie die Platte sanft schwenken. Warten Sie 30 Minuten, bis das Agar erstarrt ist. Sobald das Agar erstarrt ist, drehen Sie die Platte um und stellen Sie sie in einen warmen Raum. Beim Ausstreichen soll die Verteilung von Mikroorganismen innerhalb eines kleinen Probenvolumens bewirkt werden, sodass die resultierenden Kolonien gleichmäßig über die Agaroberfläche verteilt sind. Einklimatisieren Sie eine Platte auf Raumtemperatur und beschriften Sie sie entsprechend. Platzieren Sie die Platte auf dem Drehteller. Pipettieren Sie 0,1 Milliliter Probe in die Mitte des Agars und schließen Sie den Deckel. Entsorgen Sie die Pipettenspitze in einen Abbehälter. Tauchen Sie die Metallstange in einen Becher mit 70 %igem Ethanol, sodass der gesamte untere Teil des Ausstreichers und der erste Zoll des Stiels bedeckt sind, und lassen Sie sie abtropfen. Entzünden Sie überschüssigen Ethanol, indem Sie die Stange durch die Flamme eines Bunsenbrenners führen. Öffnen Sie anschließend den Deckel der Agarplatte und kühlen Sie den Ausstreicher, indem Sie ihn am Rand nahe der Peripherie auf das Agar setzen. Drehen Sie den Drehteller langsam. Halten Sie den Ausstreicher vorsichtig auf der Oberfläche des Agars und verteilen Sie die Probe gleichmäßig über die gesamte Platte mit einer Zickzackbewegung, während sich der Drehteller dreht. Schließen Sie den Deckel und lassen Sie die Probe mindestens fünf Minuten lang vollständig eindringen. Inkubieren Sie anschließend die umgedrehte Platte. Beschriften Sie zunächst die Agarplatte entsprechend. Öffnen Sie den Deckel der Agarplatte. Öffnen Sie dann den Behälter mit vorsterilisierten Glaskügelchen und flammen Sie den Rand ab. Geben Sie vorsichtig 10 bis 12 sterile Glaskügelchen auf eine Agarplatte. Schließen Sie den Deckel der Platte und flammen Sie den Rand des Glaskügelchenbehälters ab, bevor Sie die Kappe wieder aufsetzen. Pipettieren Sie nun die Probe in die Mitte des Agars. Schütteln Sie die Kügelchen im horizontalen Bewegungsablauf siebenmal sanft über die Oberfläche des Agars. Wenn dies korrekt ausgeführt wird, klingt der Vorgang wie das Schütteln von Maracas. Drehen Sie die Platte um 60 Grad und schütteln Sie erneut horizontal siebenmal. Drehen Sie die Platte erneut um 60 Grad und wiederholen Sie das Schütteln. Überprüfen Sie, ob die Probe vollständig eingezogen ist. Gießen Sie anschließend die kontaminierten Kügelchen in einen markierten Sammelbecher mit 10 % Chlorbleiche. Inkubieren Sie die umgedrehte Platte. Der Plaque-Assay wird häufig zur Detektion und Quantifizierung von Bakteriophagen verwendet. Kultivieren Sie die Indikatorbakterien bis zur exponentiellen Phase und lagern Sie sie auf Eis. Beschriften Sie anschließend zwei sterile Mikrozentrifugenröhrchen als Phage und Kontrolle und geben Sie jeweils 50 Mikroliter Phagenprobe oder Puffer hinein. Schwenken Sie anschließend die Bakterienkultur im Kolben, überführen Sie ein Aliquot Bakterien in ein steriles Röhrchen, vortexen Sie die Indikatorbakterien vorsichtig und geben Sie 500 Mikroliter Bakterien in jedes Absorptionsröhrchen. Mischen Sie durch vorsichtiges Anflicken der Röhrchen. Vortexen oder pipettieren Sie Phagenproben niemals heftig. Inkubieren Sie das Phagen-Bakterien-Gemisch bei einer für den Indikatorstamm geeigneten Temperatur 20 Minuten lang. Überführen Sie inzwischen zwei Weichagar-Röhrchen aus einem Wasserbad mit 55 Grad Celsius in einen Wärmespeicher mit 48 Grad Celsius. Lassen Sie sie 10 Minuten lang einklimatisieren. Beschriften Sie zwei kondensationsfreie Nährstoff-Agar-Platten, die zuvor auf Raumtemperatur vortemperiert wurden. Entnehmen Sie ein Weichagar-Röhrchen aus dem Wärmespeicher und prüfen Sie, ob der Inhalt nicht zu heiß zum Anfassen ist. Überführen Sie anschließend das Gemisch aseptisch aus dem Phagen-Absorptionsröhrchen in das Weichagar-Röhrchen. Drehen Sie das Röhrchen rasch zwischen den Handflächen, um den Inhalt zu mischen. Halten Sie das Röhrchen in einer Hand und öffnen Sie mit der anderen Hand den Deckel der harten Agarplatte. Gießen Sie sofort den gesamten Inhalt des Röhrchens auf die Oberfläche einer harten Agarplatte. Schwenken Sie die Platte rasch und sanft. Schließen Sie den Deckel und stellen Sie die Platte 30 Minuten lang waagerecht, bis der Weichagar erstarrt ist. Wiederholen Sie den Vorgang anschließend für das Kontroll-Absorptionsröhrchen, indem Sie das Kontrollgemisch in ein Weichagar-Röhrchen überführen, es mischen, den Inhalt auf eine harte Agarplatte gießen, diese schwenken und den Weichagar 30 Minuten lang erstarrten lassen. Prüfen Sie die Platten auf Plaque-Bildung. Um eine Plaque aus einer heterogenen Mischung zu isolieren, stechen Sie vorsichtig mit einem sterilen Holzstäbchen in das Zentrum und überführen das Inokulum in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 Mikroliter Phagenpuffer. Reinigen Sie diesen Lysat weiter, indem Sie den Plaque-Assay drei bis sechs Mal mit seriellen Verdünnungen wiederholen, falls erforderlich. Das Replikaplatieren nutzt ein selektierbares Phänotyp aus, indem es den Zellwachstumsvergleich zwischen einer Primärplatte und Sekundärplatten ermöglicht. Markieren Sie ein Raster auf der Unterseite der Platte, beschriften Sie die Primärplatte und nummerieren Sie die entstandenen Quadrate. Entnehmen Sie nun mit aseptischer Technik ein vorsterilisiertes Holzstäbchen aus dem Becher, tupfen Sie die Mitte jedes Quadrats mit einer Zellprobe an und entsorgen Sie das Holzstäbchen in einen geeigneten Abbehälter. Inkubieren Sie die Primärplatte. Stapeln Sie die Primärplatte und alle Sekundärplatten. Setzen Sie eine Orientierungsmarkierung an die Seite der unteren Hälfte der Platten. Entnehmen Sie nun ein steriles Samttuch aus der Verpackung und legen Sie es auf den zylindrischen Block. Platzieren Sie anschließend den Halter, wobei Sie die Markierungen am Halter mit denen am Block ausrichten. Beachten Sie die Orientierungsmarkierung am Block und am Halter. Entfernen Sie nun den Deckel der Primärplatte. Richten Sie die Orientierungsmarkierungen an Platte und Block aus. Senken Sie die Platte ab, sodass die Oberfläche des Agars mit dem Samttuch in Kontakt kommt. Drücken Sie mit den Fingerspitzen leicht, aber gleichmäßig auf die Rückseite der Primärplatte und heben Sie sie anschließend vorsichtig vom Block ab. Stellen Sie sicher, dass der Abdruck der Zellen auf dem Samt sichtbar ist. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Platte. Wiederholen Sie nun nacheinander das Protokoll auf dem Samttuch mit jeder der Sekundärplatten. Verwenden Sie den Samt-Abdruck der Zellen von der Primärplatte, um bis zu acht Sekundärplatten in der Reihenfolge von der am wenigsten bis zur am meisten begünstigenden Substanz zu beimpfen. Verwenden Sie schließlich als positiven Kontrollversuch für die letzte Platte in der Serie ein Agarmedium, auf dem alle getesteten Stämme wachsen sollten. Verbinden Sie die umgedrehten Platten mit Klebeband und inkubieren Sie sie. Prüfen Sie die Sekundärplatten auf Wachstum. Schalten Sie den Bunsenbrenner aus und räumen Sie alle Materialien weg. Stellen Sie kontaminierte Laborkleidung, Glaswaren und gefährliche Abfälle in die dafür vorgesehenen Entsorgungsbehälter. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desinfektionsmittel. Waschen Sie abschließend gründlich Hände mit antiseptischer Seife und warmem Wasser. Serratia marcescens ist ein gramnegatives, stabförmiges Proteobakterium, das ein rötliches Pigment namens Prodigiosin produziert. Es tritt häufig in Badezimmern und an Duschvorhängen auf. In diesem Beispiel erzeugt die Strichstrich-Technik einzelne Kolonien im vierten Quadranten. Diese Analyse von Bakterien in einer Wasserprobe aus einem öffentlichen Trinkbrunnen verwendet die Gießplatten-Technik. Beachten Sie den Unterschied im Erscheinungsbild der Kolonien. Oberflächenkolonien sind groß und kreisförmig, während einige Oberflächenkolonien sehr klein und unregelmäßig geformt sind. Die Ausstreichplatten-Technik ist ein wichtiger Bestandteil von Anreicherungs-, Selektions- und Screening-Experimenten. Beispielsweise ist die Copacabana-Methode ein Differenzierungsverfahren im klassischen blau-weiß-Screen in der rekombinanten DNA-Technologie. Phage T4 ist ein virulenter, doppelsträngiger DNA-Phage, der seinen Wirt Escherichia coli infiziert, um diesen zu lysieren und Nachkommen-Phagen freizusetzen. Dieser Plaque-Assay auf EHA-Agar zeigt Phagen in klaren Zonen mit einem Durchmesser von etwa einem Millimeter. In Abwesenheit infizierender Phagenpartikel führt das bakterielle Wachstum zu einer trüben Zellsuspension im Weichagar, in der keine diskreten Kolonien sichtbar sind. Bei der Weichagar-Überzugstechnik variieren die Plaque-Morphologien. Beispielsweise erzeugt hier der gleiche Mycobacterium-Wirtsstamm unterschiedliche Plaque-Morphologien in Gegenwart von Mycobacterium-Phagen „Destroyers“ im Vergleich zu Mycobacterium-Phagen MSSS. Die Stärke des Replikaplatierens liegt in der gleichzeitigen Untersuchung einer großen Anzahl von Mikroorganismen. In diesem Fall wurden vier Pseudomonas-Stämme dupliziert auf drei verschiedene Kohlenstoffquellen getestet: Acetamid, Lactose und Glycin. Hier ist die Primärplatte ein komplettes YTA-Medium, das mit den vier Stämmen wie angegeben beimpft wurde. Die Stämme zeigen variable Wachstumsmuster auf Replikaplatten aus minimalem MSA-Medium, das mit einer einzelnen Kohlenstoffquelle – Acetamid, Lactose oder Glycin – ergänzt wurde. Alle Stämme wachsen auf der letzten positiven Kontrollplatte, was bestätigt, dass die Zellen in dieser Serie auf alle Sekundärplatten übertragen wurden. Die tabellarische Auswertung dieser Replikaplatte-Ergebnisse zeigt die gleichzeitige Untersuchung verschiedener Wildtyp-Stämme hinsichtlich ihrer charakteristischen Wachstumsanforderungen.– Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür entwickelt haben, wie man Ausstrichverfahren durchführt, ohne Medien oder Kulturen zu kontaminieren, und wie man die geeignete Ausstrichmethode für eine gegebene experimentelle Aufgabe im Labor auswählt. Die Beherrschung dieser Techniken erfordert Übung. Mit ausreichender Schulung werden die in diesem Video beschriebenen Ausstrichverfahren jedoch beim Arbeiten am Laborplatz zur Selbstverständlichkeit.

aseptic-laboratory-techniques-plating-methods

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Bei der Arbeit in einem Labor, ist es zwingend notwendig, um Quellen der Kontamination zu minimieren. Aseptische Technik bezieht sich auf Verfahren, die Übertragung von Kulturen und Reagenzien ermöglichen, während der Kontakt mit nicht-sterilen Oberflächen. Serologische Pipetten und Mikroliterpipetten werden verwendet, um genaue Volumen, ohne dabei die Sterilität der Lösungen in Versuchen verwendet zu messen.

Aseptische Labortechnik: Volume Transfers mit serologischen Pipetten und Mikropipetten

Dieses Manuskript beschreibt die richtigen Vibrio Cholerae-Instandhaltungstechniken zusätzlich zu einer Reihe von biochemischen Assays, die gemeinsam für eine schnelle und zuverlässige Differenzierung zwischen klinischen und ökologischen V verwendet werden. Cholerae-Biotypen im Laborbereich.

Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Klinische und umweltliche Isolate

Dieses Protokoll ermöglicht dem Leser, Galle Salz-induzierte Biofilmbildung in magensaftresistenten Krankheitserreger mit einem vielschichtigen Ansatz, um die dynamische Natur der bakteriellen Biofilmen zu erfassen, durch die Beurteilung der Einhaltung der extrazellulären Polymeren Stoffes Matrixbildung zu analysieren, und Dispersion.

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Antimikrobielle Synergie Prüfung dient zur Bewertung der Wirkung von zwei oder mehr Antibiotika in Kombination eingesetzt und erfolgt in der Regel durch eine von zwei Methoden: die schachbrettartige Anordnung oder die Zeit-Kill-Assay. Hier präsentieren wir eine automatisierte, Inkjet-Drucker unterstützt Schachbrett Array Synergie-Technik und eine klassische Zeit-Kill-Synergie-Studie.

Antimikrobielle Synergie Tests durch Tintenstrahldrucker-gestützte, automatisierte schachbrettartige Anordnung und die manuelle Zeit-Kill-Methode

Mikrobielle Gemeinschaften in Natur und Labor - Interview

Erfolgreicher Einsatz von Zell-Tracking Farbstoffe Immunzellfunktion und Proliferation zu überwachen umfasst mehrere wichtige Schritte. Wir beschreiben Methoden zur: 1) Erhalten hell, einheitliche, reproduzierbare Label-ten mit Membran Farbstoffe; 2) Auswählen Fluorochrome und Datenerfassung Bedingungen, und 3) der Auswahl eines Modells, die Zellproliferation auf Farbstoffdilution zu quantifizieren.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Viele verschiedene Methoden existieren für die Messung der extrazellulären Vesikeln (EVs) mittels Durchflusszytometrie (FCM). Mehrere Aspekte sollten bei der Bestimmung der am besten geeignete Methode, um zu verwenden. Zwei Protokolle zur Messung EVs präsentiert werden, unter Verwendung von entweder einzelnen Detektions oder einen Wulst-basierten Ansatz.

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Wir demonstrieren die Verwendung verschiedener Mikroskopiemethoden, die nützlich sind, um die Verkalkung eines Röhrenwurms, Hydroides elegans, zu beobachten sowie das erste verkalkte Material zu lokalisieren und zu charakterisieren. Lebendmikroskopie und Elektronenmikroskopie werden zusammen verwendet, um funktionelle und materielle Informationen zu liefern, die für die Untersuchung der Biomineralisation wichtig sind.

Charakterisierung von Verkalkungen Events Verwendung von Live-optische und Elektronenmikroskopie-Techniken in einem Marine-Tubeworm

Zelluläre Seneszenz, der irreversible Zustand der Zellzyklusarrest, kann durch verschiedene Zellspannungen induziert werden. Hier beschreiben wir Protokolle zelluläre Seneszenz und Methoden zu induzieren Marker für Seneszenz zu beurteilen.

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von Endosymbionten aus der Whitefly Bemisia tabaci durch Dissektion und Filtration. Nach der Amplifikation eignen sich die DNA-Proben für die anschließende Sequenzierung und Untersuchung des Mutualismus zwischen Endosymbionten und Whitefly.

Methoden zur Extraktion von Endosymbionten aus der Whitefly<em&gt; Bemisia tabaci</em

Lernen Sie aseptische Labortechniken zur Isolierung, Vermehrung und Quantifizierung von Mikroorganismen wie Bakterien und Phagen. Diese Methoden ermöglichen präzise mikrobiologische Analysen ohne Kontamination.

Aseptische Labortechnik: Überzug Methoden

Weitere Videos entdecken