Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Danish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro

,

Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Neuroscience. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 23.22.76.170, User IP: 23.22.76.170, User IP Hex: 387337386

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro

Bodea, G. O., Blaess, S. Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro. J. Vis. Exp. (59), e3350, doi:10.3791/3350 (2012).

Abstract: Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro

Musen er en fremragende model organisme for at studere pattedyr hjernens udvikling på grund af den overflod af molekylære og genetiske data. Men udviklingslandene musen hjernen er ikke egnet for nem manipulation og billedbehandling in vivo, da musen fosteret er utilgængelige og uigennemsigtig. Organotypiske skive kulturer af embryonale hjerner er derfor i vid udstrækning anvendes til at studere murine hjernens udvikling in vitro. Ex-vivo manipulation eller anvendelse af transgene mus giver mulighed for ændring af genekspression, så delpopulationer af neuronale eller gliaceller kan være mærket med fluorescerende proteiner. Den adfærd mærkede celler kan derefter ses ved hjælp af time-lapse billeddannelse. Time-lapse billeddannelse har været særdeles vellykket for at studere celle adfærd, der ligger bag udviklingen af hjernebarken på sene embryonale stadier 1-2. Embryonale organotypiske skive kultur systemer i hjernen regioner uden for forhjernen er mindre godt establisHED. Derfor er det væld af time-lapse imaging data, der beskriver neuronal cellemigration begrænset til forhjernen 3,4. Det er endnu ikke kendt, hvorvidt principperne opdaget for dorsale hjernen gælde for ventral områder i hjernen. I den ventrale hjernen, er neuroner organiseret i neuronal klynger snarere end lag og de ofte nødt til at gennemgå komplicerede vandrende baner for at nå deres endelige holdning. Den ventrale midthjernen er ikke kun en god model system til ventrale hjernens udvikling, men indeholder også neuronale populationer som dopaminerge neuroner, der er relevante i sygdom processer. Mens funktion og degeneration af dopaminerge neuroner er blevet undersøgt i detaljer i den voksne og aldrende hjernen, er meget lidt viden om opførsel af disse neuroner i løbet af deres differentiering og migration fase 5. Vi beskriver her den generation af skive kulturer fra den embryonale dag (e) 12,5 musen ventrale midthjernen. Disse skive kultninger er potentielt egnede til overvågning af dopaminerge neuroner udvikling over flere dage in vitro. Vi fremhæver de vigtige skridt i at generere hjernen skiver på disse tidlige stadier af fosterudviklingen og drøfte de nødvendige betingelser for at opretholde en normal udvikling af dopaminerge neuroner in vitro. Vi har også præsentere resultater fra tid bortfalder billeddannelse eksperimenter. I disse forsøg blev ventrale midthjernen prækursorer (inklusive dopaminerge prækursorer) og deres efterkommere er mærket i en mosaik måde ved hjælp af en Cre / loxP baseret inducerbare skæbne mapping system 6.

Protocol: Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro

Dele af denne protokol er ændret fra Daza et al., 2007 7.

1. Forberedelser

  1. Kan være forberedt på én dag i forvejen
    1. Forbered 1X Krebs buffer (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH 2 PO 4: H 2 O, 1,2 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl 2, 11 mM glucose, 25 mM NaHCO 3, justere pH til 7,4. Filter sterilisere (0,22 mm porestørrelse) og opbevares ved 4 ° C.
    2. Forbered dyrkningsmediet (20 ml): 5 mL HBSS, 9 mL DMEM højt glukose, 850 μL af 30% glucose, 5 mL hest serum (25%). Tilsæt 200 μL 100X Penicllin / Streptomycin. Opbevares ved 4 ° C.
  2. Forbered inden du starter dissektion
    1. Fremstilling af 100 ml 4% lavtsmeltende agarose (LMP agarose) i 1X Krebs buffer: mikroovn den løsning, indtil agarose er helt opløst, og derefter placere agarose i en 45 ° C vandbad.
    2. Fyld op vibrationertome buffer bakke med iskolde 1X Krebs buffer, og start køleelement (hold ved 4 ° C). Løs et barberblad i vingen transportøren og set-up af vibratome område med en skalpel, en fin pensel og en mini perforeret ske til at afhente skiver. Forbered sterile petriskåle (35 x 10 mm) med 1x Krebs buffer til opsamling af skiver. Hold på is.
    3. Opsætning af dissektion området med sterile petriskåle (100 x 15 mm) til dissektion og mindre sterile petriskåle (35 x 10 mm) til indlejring, lille saks, to fine pincet (Dumont 5), en mini perforeret ske, et glas Pasteur pipette brand poleret med en rund lukket spids og 1 L 1X Krebs buffer på is. Tør alle dissektion værktøjer med 70% ethanol.
    4. Tilføj kultur medium til brønde på en seks-brønds plade (1,5 ml / hul) og læg den i et 37 ° C inkubator.
    5. Forbered en seks-brønds plade med 1,5 ml / hul steril 1X Krebs buffer og 15 μL Penicilin / streptomycin (100X) / godt. Under sterile forhold, sted Millicell Cell Kultur indsætter ind i brøndene. Placer de seks-brønds plade ved siden af ​​vibratome, så hjernen skiver kan overføres på filteret membranerne umiddelbart efter sektionering.

2. Dissektion og forankring af embryonale hjerner

  1. Bedøver en gravid kvindelig mus ved hjælp af isofluran og ofre musen ved dislokation af halsen (embryoner skal være på scenen E12.5). Dissekere ud af livmoderen på musen ved at trække op i livmoderen med en pincet. Brug andre tang til at adskille mesometrium væk fra livmoderen. Placer livmoderen i iskolde 1X Krebs buffer. Brug en fin pincet til at adskille muskuløse væg af livmoderen, Reichert er membran og visceral blommesækken fra embryoet. Fjern embryoner fra livmoderen. Placer dissekerede embryoner i en separat petriskål med sterilt 1X Krebs buffer.
  2. Dissekere hjernen under et stereomikroskop. At dissekere hjernen, først huggede hovedet af embryoet. Fix hovedetved piercing fine tang gennem hovedet (øjenhøjde). Brug et andet par pincet til forsigtigt at fjerne skindet og kraniet. Brug pincet til at forsigtigt løfte hjernen ud og overføre den til en petriskål med steril 1X Krebs buffer. Det er meget vigtigt, at integriteten af ​​hele hjernen opretholdes under dissektion, da skader på hjernevævet vil skabe problemer (som f.eks væv neddeling) i løbet af sektionering på vibratome.
  3. Vask hjerner gang i 4% lavt smeltepunkt (LMP) agarose. Integrer 2-3 hjerner på et tidspunkt i frisk 4% LMP agarose. Placer indlejring retter på is så lige som muligt. Brug en Pasteur pipette med en brand-poleret rund spids til at løfte hjerner, indtil bunden af ​​agarose er størknet. Den hjerner skal bosætte sig i en flad position vandret til bunden af ​​agarose blok.
  4. Efter agarose er helt størknede (efter ca 3 min), trimme agarose omgiver hjerne og lim den agarose blokken på prøvestativaf vibratome. Ved limning af blokke, skal du sørge for, at den ventrale side af hjernen er parallel til platformen, da hjerner skal skæres i et horisontalt afsnit plan.

3. Vibratome sektionering

  1. Brug et barberblad for sektionering. For at opnå intakt skiver er det meget vigtigt at holde temperaturen ved 4 ° C i løbet af sektionering.
  2. § 300 μm tykke vandrette skiver med en frekvens på 50 Hz, klinge amplitude på 1,1 mm og en hastighed på 25 mm / sek.
  3. Brug den fine pensel til at skubbe den skive i en mini perforeret ske til at indsamle hjernen skiver og overføre dem til en skål med sterilt iskolde 1X Krebs buffer. Vælg den skive, der indeholder ventrale midthjernen væv (se figur 1). I en E12.5 mus hjerne er der kun én 300 μm vandret skive, der indeholder ventrale midthjernen væv inklusive dopaminerge neuroner.

4. Slice kultur

Trin 4,2-4,5 bør udføres under sterile forhold.

  1. Overfør hjernen skiver på en Millicell cellekultur membran indsætte i en seks-brønds plade med 1x Krebs buffer (se punkt 1.2.5). Hvis du vil overføre den skive bruge mini perforerede skeen (Fine Science Tools) og en fin pensel. Op til 3 skiver kan placeres på en membran.
  2. Overførsel membranen med skive til de seks-brønds plade med naeringssubstrat (se punkt 1.2.5). Toppen af ​​membranen bør ikke være omfattet af medium. Hjernen skive modtager medium nedefra og luft fra oven.
  3. Placer de seks-brønds plade i en inkubator med 5% CO 2 ved 37 ° C. Det er meget vigtigt, at skiverne er placeret i rugemaskinen inden for 2 timer efter de første trin i dissektion. En mere udvidet forberedelsestid kan resultere i dårlig overlevelse i skiver.
  4. Skiver kan opretholdes in vitro op til 3 dage. Ændring 50% af den kultur, medie på 2. dagen.

  1. Lad skiverne komme i rugemaskinen i 4-5 timer før start time-lapse billeddannelse.
  2. For time-lapse billeddannelse, holde skiverne på membranen indsætte og overføre indsætte i en 35 mm Ibidi μ-parabol (bunden af ​​fadet består af materiale med høj optisk kvalitet).
  3. Tilsæt 1 ml naeringssubstrat plus 1,5 μL ascorbinsyre (200 mM) til fadet. Ascorbinsyre beskytter skiver mod fototoksicitet.
  4. Inkuber skiver i en miljø-kammer ved 37 ° C med 5% CO2 under time-lapse billeddannelse.

6. Repræsentative resultater

Figur 1 illustrerer udarbejdelsen af organotypiske skive kulturer fra E12.5 musen hjernen. Figur 2 viser vandret organotypiske skiver (akut og efter flere dage i kultur), som fås form, E12.5 musen hjernen. Til sammenligning, frosne hjerne sektioner på den tilsvarende udviklingstriner vist. Midthjernen dopaminerge neuroner er visualiseret med immunhistokemi for tyrosin hydroxylase (TH). Midthjernen dopaminerge neuroner projekt til mål i forhjernen. Disse fremskrivninger begynder at formen på E12.5 og strække sig mod forhjernen løbet af de efterfølgende dage. Vi anser udviklingen af ​​forhjernen fremskrivninger som en god indikation for den normale udvikling af dopaminerge neuroner i kultur. I den horisontale skiver midthjernen dopaminerge neuroner udvide projektioner mod deres rette forhjernen målområdet. Efter 3 DIV (dage in vitro), eller når forhjernen indsatsområder er beskadiget, udvide afvigende fremskrivninger mod ryg midthjernen. Eksempler på koronale skiver af E12.5 midthjernen er vist i Figur 3. Dopaminerge neuroner visualiseres med immunfarvning for TH udvide afvigende fremskrivninger til det dorsale midthjernen. Figur 4 viser en analyse af prolifererende, nekrotiske og apoptotiske celler i organotypiske skive kulturer. BrdU immunostaining at visualisere prolifererende celler viser, at cellerne formere under dyrkningsbetingelserne efter 1 DIV. Spredning er reduceret efter 4 DIV. Efter 3 DIV undergår mange celler i den ventrale midthjernen nekrose (propidium iodid farvning) og apotosis (immunfarvning for kløvet caspase-3). Figur 5 viser vandrende stier YFP-mærkede neuroner overvåget i en tid-lapse billeddannelse eksperiment i en akut skive .

Figur 1
Figur 1. Skematisk illustrerer udarbejdelsen af organotypiske skive kulturer. 300 μm vandret hjernen skiver er forberedt ved at inddele en E12.5 hjerne ved hjælp af en vibratome. (A) Skematisk sagittal henblik på en E12.5 mus hjernen. Niveauer af sektioner er angivet. Området indeholder dopaminerge neuroner er afbildet i pink, er fremskrivninger angivet med blåt. (B) Skematisk af de tre skiver, der kan opnås fra ryggen til ventrale og THAt indeholder både forhjernen (Fb) og midthjernen (Mb). Bemærk, at kun én skive rummer dopaminerge neuroner (skive b). De relevante skive kan identificeres baseret på positionen af ​​hjertekamrene og kontinuitet i midthjernen og forebrain væv (pile, sammenligne afsnit B til afsnit A og C). Området indeholder dopaminerge neuroner er angivet i pink, er det område, der indeholder dopaminerge prækursorer afbildet i grøn, blå pile angiver at udvikle fremskrivninger. (C) Den skive indeholder dopaminerge neuroner er dyrket på membran indstik. Forkortelser: VMB, ventrale midthjernen, dmb, bryst midthjernen, Hyp, hypothalamus, Hb, baghjernen.

Figur 2
Figur 2. Fremskrivninger af midthjernen dopaminerge neuroner i organotypiske skive kulturer er afhængige af integriteten af forhjernen. Immunhistokemi for tyrosin hydroxylase (TH) til at mærke dopaminerge neuroner. (A) Akut slice (0 DIV)Viser den normale placering af dopaminerge neuroner i det ventrale midthjernen. Den hvide pilespids angiver det område, der er vist i større forstørrelse i det indsatte. Fremskrivninger til forhjernen har endnu ikke udviklet. Efter 1 DIV, skal du starte fremskrivninger til forhjernen til at danne. Fremskrivninger går ind i forhjernen på 2-3 DIV. Hvid pilespidser angiver placeringen af ​​den celle organer vist i større forstørrelse i mellemværker (hvid ramme). Gule pile fremhæve de normale fremskrivninger i intakte skiver vist i større forstørrelse i mellemværker (gul ramme). Afvigende fremskrivninger udvikle sig i skiver med beskadiget forhjernen. Røde pile viser afvigende fremskrivninger til det dorsale midthjernen vist i større forstørrelse i mellemværker (rød ramme). Skader er indikeret med røde stjerner. Efter 3 DIV, (n = 5 / 7) de fleste skiver var afvigende fremskrivninger mod ryg midthjernen. (B) TH immunfarvning på vandrette frosset hjernen sektioner på de forskellige udviklingsstadier at vise udviklingenaf dopaminerge projektioner in vivo. Hvid pilespidser angiver placeringen af ​​den celle organer vist i større forstørrelse i mellemværker (hvid ramme). Gule pile fremhæve placeringen af ​​fremskrivningerne vist i større forstørrelse i mellemværker (gul ramme). Niveauet for den frosne sektioner blev valgt til nøje at matche niveauet for den organotypiske skive kulturer. Bemærk, at en enkelt frosne vævssnit (12 μm) ikke repræsenterer hele organotypiske slice (300 m). Derfor blev prognoser vist på E13.5 og E14.5 observeret på afsnit 120 μm mere ventral end de afsnit, der indeholder den celle organer (gul stjerne).

Figur 3
Figur 3. Midthjernen koronale skive kulturer farvet for tyrosin hydroxylase (TH) som markør for dopaminerge neuroner. (AC) Skiver efter 1, 2 eller 3 DIV. Dopaminerge neuroner udvikle afvigende fremskrivninger mod dorsale midthjernen (red pile). Pilespidser viser placeringen af ​​den dopaminerge celle organer.

Figur 4
Figur 4. Celledeling og celle levedygtighed i midthjernen organotypiske skive kulturer. (A) prolifererende celler blev mærket ved tilsætning af BrdU (50 ng / ml, Sigma) til dyrkningsmediet for 18 h. Skiver blev efterfølgende immunostained for BrdU. Efter 1 DIV, er BrdU mærkede celler beliggende i den ventrikulære zoner (røde pile). Efter 4 DIV, er prolifererende celler mere spredt og en tydelig ventrikulær zone ikke længere opretholdes. (B) Nekrotisk celler blev mærket ved tilsætning af propidium iodid (1μg/μL, Sigma) til dyrkningsmediet for 2 timer og visualiseres ved fluorescens mikroskopi. Efter 1 DIV, er den ventrale midthjernen (VMB) ikke nekrotisk, men mange propidium iodid mærkede celler kan ses i ryg midthjernen og forhjernen. Efter 3 DIV cellen levedygtighed fald i ventrale midbrai. Skala bar: 500 m (C) Immunostaing for kløvet caspase-3 til at visualisere apoptotiske celler. Ved 1 eller 2 DIV, er kun få dopaminerge neuroner (TH) apoptotiske. Efter 3 DIV, begynder dopaminerge neuroner til at gennemgå apoptose. Paneler i midten og til højre er højere forstørrelser af de indrammede område i venstre-paneler. De højere forstørrelser Billederne er maksimal intensitet fremskrivninger af z-stakke på 14-16 frames. Billeder blev taget hver 0,5 μm med et Zeiss Apotome set-up.

Figur 5
Figur 5. Trækrute af YFP-mærkede neuroner i en akut skive. (A) Vandret skive bruges til tidsindstilling billeddannelse af YFP-mærket neuroner. Den skive blev inkuberet i 5 timer forud for billeddannelse. Cellerne var mærket ved hjælp af en inducerbare Cre / loxP system 6. Shh CreER mus 8 og ROSA loxP-STOP-loxP-EYFP reporter mus 9 Vire anvendes. Rekombination af ROSA reporter allel (og EYFP udtryk) er induceret i celler, der udtrykker CreER (Shh-udtrykkende celler), men kun efter administration af tamoxifen (Sigma). I dette eksempel blev Tamoxifen (3 mg/40 g legemsvægt) givet til drægtige mus ved E8.5. Denne eksperimentelle set-up resulterer primært i mærkningen af forstadier til dopaminerge neuroner og deres efterkommere i den ventrale midthjernen 10,11. Skala bar: 500 μm. (B) Sporing af migrerende rute YFP-mærkede neuroner i en akut skive. Time-lapse billeder af YFP-mærket skæbne, kortlagt neuroner blev erhvervet hver 30 min i alt på 5 timer 30 min på en Zeiss Axio-Observer mikroskop (objektiv EF PlnN 10x / 0,3). Skiver blev inkuberet i et miljømæssigt kammer (kuvøse XLS1 Pecon) ved 37 ° C og leveres med 5% CO 2 i løbet af billeddannelse. Den oprindelige position af cellerne er markeret med røde pile, migration positioner er markeret med røde stjerner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro

Den organotypiske skive kultur metode præsenteret her giver et system på kort sigt in vitro analyse af udviklingen af dopaminerge neuroner og deres træk og projektion ruter i embryonale ventrale midthjernen. Vi fandt, at der er en række kritiske trin i den protokol, bør nøje deltog i for at opnå skiver, der tillader den normale udvikling af ventrale midthjernen dopaminerge neuroner. Det mest kritiske skridt er dissektion af embryonale hjernen, som skal være både hurtig og præcis. I modsætning til den generation af voksne hjerne skiver, er det afgørende at afsnittet hjernerne på en vibratome udstyret med et kølesystem og til at bruge en lav frekvens kombineret med en høj hastighed for at få intakte skiver E12.5 hjerner. Endelig har vi observeret, at skiver skal være sektioneret i det vandrette plan, således at der ud over de ventrale midthjernen forebrain indsatsområder i det dopaminerge fremskrivninger er inkluderet i den skive.Vi har også bemærket, at forhjernen skal være intakt i disse skiver, for normal dopaminerge projektioner at udvikle sig. I koronale skiver, er de forhjernen indsatsområder af dopaminerge neuroner fraværende og neuroner formularen afvigende fremskrivninger til det dorsale midthjernen.

Vi viser, at skiverne opnået efter vores protokol kan opretholdes in vitro for op til 3 dage, og at dopaminerge neuroner fastholde deres normale position og forhjernen fremskrivninger. Desuden er proliferativ kapacitet i den ventrikulære zone prækursorer opretholdes under hele den skive. Men efter mere end 3 dage i kultur, formindsker levedygtighed skiver dramatisk. Derfor kan skivekulturer fra E12.5 hjerner skal anvendes ved vurderingen tidligt trin i dopaminerge neuronal migration og differentiering, men de kan ikke bruges til langtidsforsøg. At vurdere senere stadier af midthjernen udvikling, generation af skiver fra lidt Older embryoner kunne være et alternativ.

Vi viser endvidere, at organotypiske skive kulturer kan bruges til time-lapse billeder af ventrale midthjernen prækursorer og deres efterkommere, som var mærket in vivo ved hjælp af en genetisk skæbne kortlægning tilgang. Siden mærkning metode præsenteres her kun markerer celle organer, har vi brugt skiverne til at spore neuronal migration. Kunne dog forskellige reporter linjer, der også mærke aksonal fremskrivninger være nyttigt at overvåge aksonal udvækst af ventrale midthjernen neuroner in vitro-12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgements: Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro

Vi takker Martine Emond og Isabel Brachmann for deres hjælp med at etablere de organotypiske skive kultur-system og Wolfgang Hübner og Liviu Gabriel Bodea til kritisk læsning af manuskriptet. Vi vil gerne takke Frank Costantini for R26 reporter mus og Cliff Tabin for Shh CreER mus. Denne undersøgelse blev finansieret af et Research Award fra Ministeriet for Videnskab og forskning i delstaten Nordrhein-Westfalen (Programm zur Förderung der Rückkehr des wissenschaftlichen Spitzennachwuchses aus dem Ausland).

Materials: Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro

Name Company Catalog Number Comments
Table of specific reagents and equipment
DMEM Sigma-Aldrich D6429
Glucose 30% Sigma-Aldrich G7528-250
Horse Serum Invitrogen 26050-088
DMEM (4,5g/L Glc., with L-Gln, Na Pyr, NaHCO3) Sigma-Aldrich D6429-500
Penicillin/Streptomycin 100x Sigma-Aldrich P4333-20
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A4403 prepare 200mM stock and store at -20°C
UltraPure LMP agarose Invitrogen 15517-022
Millicel inserts EMD Millipore PICMORG50
µ-dish 35 mm, low Ibidi 80136
Vibratome Microm International HM 650V
Razor Blade Plano GmbH 121-6
Histoacryl glue BRAU9381104 Braun Aesculap
Perforated Spoon Dia diameter 15 mm Fine Science Tools 10370 -18
Forceps 5 Dumoxel Fine Science Tools 11252 - 30
Antibodies used for immunostainings:
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase EMD Millipore AB152 Dilution 1:500
Mouse anti-tyrosine hydroxylase EMD Millipore MAB318 Dilution 1:500
Mouse anti-BrdU BD Biosciences 555627 Dilution 1:200
Rabbit anti-cleaved caspase 3 Cell Signaling Technology 9661 Dilution 1:200
Donkey anti-rabbit IgG-Alexa 488 Invitrogen A21206 Dilution 1:500
Donkey anti-mouse IgG-Cy3 Jackson ImmunoResearch 715-165-150 Dilution 1:200

References: Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro

  1. Noctor, S.C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., & Kriegstein, A.R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 7 (2), 136 (2004).
  2. Martini, F.J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136 (1), 41 (2009).
  3. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., & Tsai, L.H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (2), a001834 (2010).
  4. Ayala, R., Shu, T., & Tsai, L.H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29 (2007).
  5. Smidt, M.P. & Burbach, J.P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron. Nat. Rev. Neurosci. 8 (1), 21 (2007).
  6. Legue, E. & Joyner, A.L. Genetic fate mapping using site-specific recombinases. Methods. Enzymol. 477, 153 (2010).
  7. Daza, R.A., Englund, C., & Hevner, R.F. Organotypic slice culture of embryonic brain tissue. CSH Protoc., pdb.prot4914 (2007).
  8. Harfe, B.D., et al. Evidence for an expansion-based temporal Shh gradient in specifying vertebrate digit identities. Cell. 118 (4), 517 (2004).
  9. Srinivas, S., et al., Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev. Biol. 1, 4 (2001).
  10. Joksimovic, M., et al. Spatiotemporally separable Shh domains in the midbrain define distinct dopaminergic progenitor pools. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (45), 19185 (2009).
  11. Blaess, S., et al. Temporal-spatial changes in Sonic Hedgehog expression and signaling reveal different potentials of ventral mesencephalic progenitors to populate distinct ventral midbrain nuclei. Neural. Dev. 6 (1), 29 (2011).
  12. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3 (5), e159 (2005).

Ask the Author: Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter