Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, organotypische Schnitte aus dem embryonalen Mittelhirn von E 12,5-Neuronen zur Analyse sich entwickelnder dopaminergener Neuronen herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst das embryonale Gehirn präpariert wird. Anschließend wird das Gehirn in niedrigschmelzendes Agarose eingebettet.

Der dritte Schritt besteht darin, die Gehirnschnitte mit einem Vibratom zu sezieren. Der letzte Schritt ist die Auswahl des geeigneten Gehirnschnitts für die Kultur und die Zeitrafferaufnahme. Letztendlich werden Zeitrafferaufnahmen und Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um die frühen Schritte dopaminerger Neuronen, ihr Migrationsverhalten und ihre Differenzierung darzustellen.

Mit dieser Methode können zentrale Fragen im Bereich der neurodevelopmentalen Forschung beantwortet werden, beispielsweise die Verfolgung von Neuronen und ihres Migrationsverhaltens während der Entwicklung des ventralen Gehirns. Einen Tag vor der Dissektion je eine Lösung des X-Krebs-Puffers und des Kulturmediums gemäß der beigefügten Publikation etwa zwei Stunden vor der Dissektion vorbereiten. 100 Milliliter einer 4 %igen Lösung von Low-Melting-Agarose in Krebs-Puffer herstellen, indem die Lösung in der Mikrowelle erhitzt wird, bis die Agarose vollständig gelöst ist.

Stellen Sie anschließend die Aros in ein Wasserbad mit 45 Grad Celsius. Füllen Sie danach die Vibram-Pufferwanne mit eiskaltem Krebs-Puffer. Schalten Sie das Kühlelement ein und halten Sie es bei vier Grad Celsius.

Danach befestigen Sie eine Rasierklinge im Klingenhalter. Bereiten Sie ein Skalpell, einen feinen Pinsel und einen kleinen perforierten Löffel zum Aufheben der Schnitte im Vibratorschneidbereich für die spätere Schnittführung vor. Geben Sie anschließend Krebs-Puffer in die sterilen Petrischalen und stellen Sie diese auf Eis.

Bereiten Sie im Bereich der Dissektion drei große sterile Petrischalen für die Dissektion und zwei kleine sterile Petrischalen zum Einlegen eines kleinen Scherenpaares, zwei Paar feiner Pinzetten, eines miniaturisierten perforierten Löffels, einer gläsernen Pasteurpipette mit feuerpolierter, runder und geschlossener Spitze sowie einem Liter Krebs-Puffer auf Eis vor. Wischen Sie alle Dissektionswerkzeuge mit 70 %igem Ethanol ab. Geben Sie anschließend Kulturmedium in die Vertiefungen einer 6-Loch-Platte und inkubieren Sie diese zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie anschließend unter sterilen Bedingungen 1,5 Milliliter Krebs-Puffer mit Penicillin-Streptomycin in jedes Loch einer weiteren sechslöchrigen Platte hinzu. Setzen Sie die Milli-Zellmembran-Einsätze in die Löcher ein. Stellen Sie die sechslöchrige Platte neben das Vibratom, damit die Gehirnschnitte auf die Filtermembranen übertragen werden können.

Unmittelbar nach dem Einlegen opfern Sie eine trächtige weibliche Maus mit Embryonen im Stadium E 12,5 und entfernen den Uterus, indem Sie ihn mit einer Pinzette anheben. Anschließend lösen Sie mit einer weiteren Pinzette das Myometrium vom Uterus. Danach bringen Sie den Uterus in kalter Eis-Krebs-Pufferlösung unter dem Mikroskop.

Verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Muskelschicht der Gebärmutter, die Riker-Membran und die viszerale Dottersackmembran vom Embryo zu trennen. Entfernen Sie anschließend die Embryonen aus der Gebärmutter und überführen Sie den Embryo in eine separate Petrischale mit steriler Krebs-Lösung. Danach schneiden Sie den Kopf jedes Embryos ab.

Befestigen Sie den Kopf, indem Sie ihn auf Augenhöhe mit einer feinen Pinzette durchstechen. Entfernen Sie mit einer weiteren Pinzette vorsichtig die Haut und den Schädel. Heben Sie dann das Gehirn vorsichtig an und überführen Sie es in eine Petrischale mit steriler Krebs-Pufferlösung.

Anschließend spülen Sie die Gehirne in 4 % Low-Melting-Point-Agarose. Eingeben Sie zwei bis drei Gehirne gleichzeitig in 4 % frische, Low-Melting-Point-Agarose unter Verwendung einer Pasteurpipette mit feinpolierter, runder Spitze.

Dann stellen Sie die Einbettungsschalen so eben wie möglich auf Eis. Heben Sie anschließend die Gehirne an, bis der Boden des Agaroseblockes erstarrt ist, damit sich die Gehirne gleichmäßig absetzen und parallel zum Boden des Agaroseblockes liegen. Wenn die Agarose vollständig erstarrt ist, schneiden Sie die Agarose rund um die Gehirne zurecht.

Danach den Aros-Block auf die Probenebene des Vibrators kleben. Beim Verkleben des Blocks sicherstellen, dass die ventrale Seite des Gehirns parallel zur Plattform liegt. Schneiden Sie horizontale Schnitte mit einer Dicke von 300 Mikrometer bei einer Frequenz von 50 Hertz, einer Schwingungsamplitude des Messers von 1,1 Millimetern und einer Geschwindigkeit von 25 Millimetern pro Sekunde.

Sammeln Sie die Gehirnschnitte, indem Sie mit einem feinen Pinsel den Schnitt auf einen kleinen perforierten Löffel schieben. Überführen Sie sie dann unter dem Mikroskop in eine Schale mit steriler, eiskalter Krebs-Pufferlösung. Wählen Sie den Schnitt aus, der ventrale Mittelhirngewebe enthält.

Verwenden Sie in diesem Schritt einen kleinen perforierten Löffel und einen feinen Pinsel, um die Gehirnschnitte auf Milli-Cell-Membraneinsätze in einer sechswelligen Platte mit zuvor hergestelltem Krebs-Puffer zu übertragen. Überführen Sie anschließend die Membranen mit den Schnitten in eine andere sechswellige Platte mit Kulturmedium und halten Sie die Oberseite der Membranen trocken, sodass die Gehirnschnitte das Medium von unten und Luft von oben erhalten.

Legen Sie die Schnitte in einen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Es ist sehr wichtig, dass die Schnitte innerhalb von zwei Stunden nach dem ersten Schritt der Dissektion in den Inkubator gebracht werden. Diese Schnitte können in vitro drei bis vier Tage lang aufrechterhalten werden.

Nach vier bis fünf Stunden der Erholung können die Schnitte unmittelbar vor der Bildaufnahme für die Zeitrafferaufnahmen verwendet werden. Geben Sie 1,5 Mikroliter 200 Millimolar Ascorbinsäure zur Schale hinzu, um die Schnitte vor Phototoxizität zu schützen.

Inkubieren Sie die Schnitte in einer Umweltkammer bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid während der Zeitrafferaufnahmen. Hier ist ein akuter Schnitt zu sehen, der die normale Lage dopaminerger Neuronen im ventralen Mittelhirn zeigt, bei dem die Projektionen zum Vorderhirn noch nicht entwickelt sind. Nach einem Tag in der Kultur beginnen sich die Projektionen zu den Vorderhirnen zu bilden, wie durch den gelben Pfeil angezeigt.

Der weiße Pfeil zeigt die Lage der Zellkörper an, die in den Einlagen in höherer Vergrößerung dargestellt sind. Hier befindet sich die migratorische Wurzel der mit YFP markierten Neuronen. In einem akuten horizontalen Schnitt wird die Ausgangsposition der Zellen mit einem roten Pfeil markiert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man genotypische Schnitte aus dem embryonalen Mittelhirn von E 12,5-Mäusen präpariert, um lebensfähige und intakte Schnitte zu erhalten. Es ist wichtig, die Dissektion des embryonalen Gehirns sorgfältig durchzuführen und nach dem Schneiden am Vibroschneider den richtigen Gehirnschnitt für die Kultivierung und die Zeitrafferaufnahme auszuwählen.