The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Molecular Oncology Research Institute, Department of Medicine, Tufts Medical Center
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Xu, K., Buchsbaum, R. J. Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture. J. Vis. Exp. (62), e3760, doi:10.3791/3760 (2012).
Mentre enormi sforzi sono andati ad identificare vie di segnalazione e le molecole coinvolte in comportamenti di cellule normali e maligne 1-2, gran parte di questo lavoro è stato effettuato utilizzando classici bidimensionali modelli di coltura cellulare, che consentono la manipolazione cellulare facile. E 'diventato chiaro che vie di segnalazione che sono influenzati da forze extracellulari, tra cui dimensionalità e tensione superficiale delle cellule 3-4. Molteplici approcci sono state prese per sviluppare modelli tridimensionali che rappresentano il tessuto più accuratamente l'architettura biologica 3. Mentre questi modelli incorporano multidimensionalità e sollecitazioni architettoniche, lo studio degli effetti conseguenti sulle cellule è meno facile rispetto a bidimensionale coltura tissutale a causa dei limiti dei modelli e la difficoltà di estrazione di cellule per la successiva analisi.
L'importante ruolo del microambiente intorno tumori nella tumorigenesi e il comportamento del tumore is sempre più riconosciuta 4. Stroma tumorale è composta da più tipi di cellule e molecole extracellulari. Durante lo sviluppo del tumore sono segnali bidirezionali tra cellule tumorali e cellule stromali 5. Sebbene alcuni fattori che partecipano stroma del tumore-co-evoluzione sono stati identificati, vi è ancora la necessità di sviluppare tecniche semplici per identificare sistematicamente e studiare la gamma completa di questi segnali 6. I fibroblasti sono il tipo cellulare più abbondante nei tessuti normali stromali o tumore-associato, e contribuire alla deposizione e alla manutenzione della membrana basale e fattori di crescita paracrini 7.
Molti gruppi hanno utilizzato tre sistemi di coltura tridimensionale per studiare il ruolo dei fibroblasti su varie funzioni cellulari, compresa la risposta del tumore alle terapie, il reclutamento delle cellule immunitarie, le molecole di segnalazione, la proliferazione, l'apoptosi, l'angiogenesi e l'invasione 8-15. Abbiamo ottimizzato un metodo semplice per assessing gli effetti di fibroblasti mammarie su cellule epiteliali mammarie utilizzando un modello disponibile in commercio matrice extracellulare per creare tridimensionali colture miste di popolazioni cellulari (co-colture) 16-22. Con continua co-coltura delle cellule formano sferoidi con il raggruppamento fibroblasti all'interno e le cellule epiteliali ampiamente sulla parte esterna degli sferoidi e formando multicellulari sporgenze nella matrice. Manipolazione dei fibroblasti che porta alla alterato l'invasività delle cellule epiteliali possono essere facilmente quantificato dai cambiamenti del numero e la lunghezza delle proiezioni epiteliali 23. Inoltre, abbiamo sviluppato un metodo per isolare le cellule epiteliali di tridimensionale co-cultura che facilita l'analisi degli effetti dell'esposizione fibroblasti sul comportamento epiteliale. Abbiamo trovato che gli effetti della co-coltura persistere per settimane dopo l'isolamento delle cellule epiteliali, consentendo tempo sufficiente per effettuare saggi multipli. Questo metodo è adattabile a cellulevariabile potenziale maligno e non richiede attrezzature specializzate. Questa tecnica permette di valutazione rapida dei modelli in vitro di cellule in condizioni diverse, ed i corrispondenti risultati possono essere confrontati con tessuto in modelli animali in vivo così come campioni di tessuti umani.
Il metodo qui presentato rappresenta un approccio semplice per analizzare gli effetti di fibroblasti stromali sulle cellule epiteliali, comprese le cellule tumorali. Esso consente diretto cellula-cellula interazione all'interno di un contesto tridimensionale supportato da matrice extracellulare membrana basale, pur consentendo una facile estrazione delle celle della matrice per ulteriori analisi. Questo può essere applicato allo studio del tumore-associato stroma, come linee di fibroblasti possono essere manipolati per influenzare vie di segnalazione di scelta e linee epiteliali possono variare in potenziale invasivo, come mostrato nella Figura 1. Il 3D co-coltura e consente di effettuare la verifica visiva che i cambiamenti nella invasività delle cellule sono state indotte. Il protocollo di isolamento consente di estrazione di cellule dalle colture 3D con un minimo di movimentazione ed evita l'uso di tripsina o matrice di dissoluzione agenti che potrebbero influenzare le proprietà delle cellule. Gli effetti dell'esposizione ai fibroblasti in 3D co-coltura persistono nelle cellule epiteliali di poppaer isolamento da 3D co-coltura, facilitando successiva analisi (Figura 4). Mentre l'esempio illustrato illustra effetti sulla migrazione cellulare, qualsiasi saggio applicabile a cellule in crescita in 2D può essere utilizzato sulle cellule isolate. Abbiamo utilizzato questo metodo per analizzare gli effetti delle variazioni fibroblasti Tiam1 espressione sul comportamento di cellule epiteliali mammarie associati. Tiam1 carenza di fibroblasti mammari promuove l'invasione e metastasi delle cellule tumorali in coltura 3D e modelli tumorali animali 23. Questo metodo ci ha permesso di analizzare i potenziali meccanismi coinvolti con saggi molecolari, biochimici e funzionali (Liu e Buchsbaum, in corso di stampa).
È importante utilizzare solo linee cellulari in salute ottima e di aderire alla rigorosa tecnica sterile per evitare contaminazione di culture durante il processo. I migliori risultati sono ottenuti utilizzando cellule di inizio anziché passaggi ritardo (numero passaggio precisa varierà a seconda del specific cellula cellule line) e da raccolte a densità tra il 50-80% di confluenza. Movimentazione precisa di Matrigel secondo il protocollo è fondamentale al fine di facilitare sia liquefazione completa prima di stabilire i co-colture e per garantire completa solidificazione della matrice prima dell'aggiunta delle cellule. Quantità insufficiente o solidificazione della matrice si tradurrà in cellule in crescita come un monostrato piuttosto che sferoidi nelle culture. La prima volta che istituisce la sferoide co-culture, il posizionamento di un primo 50 plug microlitri nel pozzetto permette di solidificazione ancoraggio solido e più uniforme della matrice finale, che è la chiave per la formazione sferoide uniformemente distribuito. La rimozione di tutti sferoidi fantasma a livello post-isolamento passaggi passaggio è critico se selezione delle cellule automatizzato deve essere utilizzato per separare popolazioni miste. Gli esempi riportati qui utilizzare fenolo-rosso con Matrigel libera composizione proteica di circa 10 mg / ml. Il rosso fenolo libero permette la preparazione per la rilevazione del colore in ASSAys, come fluorescenza.
Questa tecnica può essere applicata a una vasta gamma di tipi di cellule, al fine di studiare gli effetti dei fibroblasti stromali di tumori associati cellule epiteliali o, al contrario degli effetti di cellule tumorali su fibroblasti associati. Questa tecnica permette di valutazione rapida dei modelli in vitro di cellule in condizioni diverse, ed i corrispondenti risultati possono quindi essere confrontati con tessuto in modelli animali in vivo così come campioni di tessuti umani.
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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356237 | Phenol-red free |
| Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | |
| Hyclone Bovine Calf Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH3007303 | |
| Insulin | EMD Millipore | 407709 | Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter |
| EGF | Sigma-Aldrich | E9644 | Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter |
