Purificação e visualização de lipopolissacarídeo de bactérias Gram-negativas por extracção aquosa de fenol-Hot

1. Preparação de bactérias para Extração de LPS

1. Iniciar uma cultura durante a noite em 5 mL de caldo de Luria (LB) suplementado com antibióticos, se necessário. Crescer a cultura durante a noite (12-18 horas) em uma agitação incubadora a 37 ° C e 200 rpm.
2. Diluir a 1:10 com cultura LB e tomar uma OD ₆₀₀ leitura em espectrofotômetro. Com base na OD ₆₀₀ leitura, fazer uma suspensão de 1,5 mL dos seus bactérias para uma _DO600 de 0,5.
3. Sedimentar as bactérias numa microcentrífuga a 10.600 x g durante 10 minutos. Remova e descarte o sobrenadante. O sedimento pode ser armazenada a -20 ° C, se LPS não vai ser extraído imediatamente.

2. Extracção de LPS

1. Primeiro, prepara 2x tampão de SDS. Fazer uma solução de 50 mL de 4% β-mercaptoetanol (BME), SDS 4% e glicerol a 20% em 0,1 M de Tris-HCl, pH 6,8. Adicionar uma pitada de azul de bromofenol para tingir a solução. Faça um estoque 1x SDS-tampão diluindo 2X stac 1:1 em destilada estéril H ₂ O. Isto pode ser armazenado à temperatura ambiente.
2. Faça três separadas 10 mg / mL de soluções de DNase I, RNase, e proteinase K em destilada estéril H ₂ O.
3. Ressuspender as bactérias peletizadas a partir do passo de 1,3 em 200 ul de SDS-1x buffer. Assegurar que o pelete é ressuspenso completamente por pipetagem a solução cima e para baixo lentamente. Não vórtice.
4. Ferver as bactérias em suspensão em um banho de água durante 15 minutos. Permitir que a solução a arrefecer à temperatura ambiente durante 15 minutos.
5. Adicionar 5 uL de ambos DNase I e soluções RNase preparado em 2,2. Incubar as amostras a 37 ° C durante 30 minutos. * Este passo é opcional, não há diferença mínima na qualidade de LPS entre as amostras de nuclease-tratados e não tratados.
6. Adicionar 10 ul da solução de proteinase K preparado em 2,2. Incubar as amostras a 59 ° C durante 3 horas. Esta etapa pode ser realizada durante a noite, se existem restrições de tempo.
7. Para cada amostra de anúncio,d uL 200 de gelo-frio de Tris-fenol saturado (saturado de água fenol pode ser utilizado como um substituto se Tris-fenol saturado não está disponível). Garantir as tampas nos tubos são fechados hermeticamente, e cada amostra de vórtice durante cerca de 5 a 10 segundos.
8. Incubar as amostras a 65 ° C durante 15 minutos, vortex ocasionalmente. Após incubação arrefecer à temperatura ambiente, em seguida, adicionar 1 mL de temperatura ambiente éter dietílico para cada amostra e vortex durante 5 a 10 segundos. Certifique-se de realizar éter pega em um exaustor, como ele é volátil.
9. Centrifugar as amostras a 20.600 X g durante 10 minutos. Remover cuidadosamente as amostras da centrífuga e extrair a camada de fundo azul. Certifique-se de evitar a camada superior, claro. Deixando para trás uma pequena quantidade da camada de azul é preferível a contaminação com a camada superior.
10. Re-extrair as amostras, repetindo os passos 2,7-2,9. Duas extracções são normalmente suficientes. Se as amostras de aspecto turvo, extrações mais pode ser performed. Adicionar 200 ul de 2x tampão SDS-a cada uma das amostras extraídas antes de separar por SDS-PAGE. As amostras podem ser executados em 8% -15% de poliacrilamida SDS-géis. Cinco a 15 ul de LPS preparados usando este método é geralmente suficiente para visualização.

3. Os resultados representativos

As amostras de LPS preparadas como acima pode ser visualizada por coloração directa após a separação por SDS-PAGE utilizando coloração de prata de um protocolo padrão ou um kit de coloração comercialmente disponível LPS. Alternativamente, o LPS separados num gel de poliacrilamida pode ser transferida para uma membrana de nitrocelulose e sujeitas a Western immunoblotting utilizando LPS-específico anti-soros. Para este protocolo, foi utilizado o Pro-Q Emerald 300 Kit Gel Stain lipopolissacarídeo (Molecular Probes), e seguiu as instruções do fabricante.

Mostrada na Figura 1 é um Pro-Q Emerald 300 manchado 12% de gel de SDS-poliacrilamida. Cada pista contém 15 uL de LPS preparados a partir de dicepas diferentes de Burkholderia dolosa isolado de amostras de escarro de pacientes com fibrose cística. LPS diferentes padrões de bandas de escada, reflectoras de números diferentes de antigénios S-unidades de repetição ligados ao núcleo oligossacárido, são evidentes utilizando este método, por exemplo, as amostras em pista 1 e 6 têm padrões de bandas semelhantes um ao outro (disponível comercialmente em vermelho).

Figura 1. Pro-Q Esmeralda 300 LPS manchadas de isolados de Burkholderia dolosa clínicos. LPS de B. sete cepas dolosa de um surto em pacientes com fibrose cística foram isoladas como descrito neste protocolo. Quinze uL foram separados num gel de 12% SDS-poliacrilamida, e coradas com Pro-Q Emerald 300, segundo as instruções do fabricante. LPS núcleo é indicado uma flecha, e LPS que mostram padrões similares de bandas de O-antígeno repete são embalados em vermelho. M = marcador de peso molecular.

Nós descrevemos um método de purificação de LPS de distância a partir de outros componentes celulares, incluindo ácidos nucleicos e proteínas. Este método proporciona alta qualidade LPS que podem ser utilizados num certo número de métodos de visualização diferentes, incluindo coloração de hidratos de carbono géis de SDS-PAGE, como mostrado na Figura 1. Este método pode ser usado para serotipar LPS a partir de uma variedade de estirpes, utilizando anticorpos específicos anti-soros, ou para mostrar parentesco entre isolados por visualização directa. Por exemplo, um recente projeto de seqüenciamento do genoma em combinação com LPS caracterização de um surto de B. dolosa levou à descoberta de um único polimorfismo de nucleótidos (SNP) que se correlaciona com a presença e na ausência de LPS nestas ¹¹ estirpes. Acreditamos que este método é preferível ao tratamento com protease de célula inteira lisados ​​descritos por Hitchcock e Brown ^9, como é um relativamente rápida, ainda suficientemente rigorosas para se obter alta qualidade LPS para analisar ainda maiss.

Enquanto que apenas mostram um exemplo usando o dolosa Burkholderia, este protocolo pode ser adaptado a outras espécies Gram-negativas, bem. Temos utilizado com sucesso este protocolo para extrair e visualizar LPS de outros Burkholderia spp., Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella spp. Se os resultados do protocolo em pouca ou nenhuma produção de LPS, pode ser que o LPS fraciona para uma camada diferente nas etapas de extracção, 2,7-2,9. Para solucionar isso, repita o protocolo e guardar uma amostra de cada camada durante as etapas de extração, estes podem ser visualizados através da coloração de um gel de SDS-PAGE, a fim de determinar onde o fraciona LPS, e do protocolo pode ser alterado em conformidade. Deve também ser notado que este protocolo, enquanto ideal para fins analíticos, não produz LPS que é apropriado para outras aplicações, tais como as análises estruturais.