Name: 热酚水提取纯化及革兰氏阴性菌脂多糖的可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: 学习热酚水提取法纯化革兰氏阴性菌脂多糖，通过SDS-PAGE和Western免疫印迹进行可视化分析。该方法可获得高纯度LPS样品，用于研究细菌致病机制和免疫应答。

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本工作得到了美国国立卫生研究院和囊性纤维化基金会资助项目的资助。

1. LPS 提取用细菌的制备
<ol>
	<li>在5 mL的Luria肉汤（LB）中接种过夜培养物，必要时加入抗生素。在37 °C、200 rpm条件下，于摇床培养箱中培养12-18小时。</li>
	<li>用LB将菌液按1:10稀释，并在分光光度计中测定OD600值。根据OD600测定结果，将细菌重悬于1.5 mL LB中，调节菌液浓度至OD600为0.5。</li>
	<li>在微型离心机中以10,600×g离心10分钟，收集菌体沉淀。弃去上清液。若不立即提取脂多糖（LPS），可将菌体沉淀保存于-20 °C。</li>
</ol>
2. LPS 的提取
<ol>
	<li>首先，配制 2x SDS 缓冲液。在 50 mL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 6.8）溶液中加入 4% β-巯基乙醇（BME）、4% SDS 和 20% 甘油，混匀。加入少量溴酚蓝以染色溶液。通过将 2x 储液与无菌去离子 H2O 按 1:1 比例稀释，制备 1x SDS 缓冲液。该溶液可在室温下保存。</li>
	<li>分别用无菌去离子 H2O 配制 10 mg/mL 的 DNase I、RNase 和 Proteinase K 溶液，共三种。</li>
	<li>将步骤 1.3 中获得的菌体沉淀重悬于 200 μl 的 1x SDS 缓冲液中。通过缓慢吹打确保沉淀完全重悬。切勿涡旋。</li>
	<li>将重悬的菌液在水浴中煮沸 15 分钟。随后在室温下冷却 15 分钟。</li>
	<li>加入 5 μl 步骤 2.2 中配制的 DNase I 和 RNase 溶液。将样品在 37 °C 下孵育 30 分钟。*此步骤为可选；核酸酶处理与未处理样品之间的 LPS 质量差异极小。</li>
	<li>加入 10 μl 步骤 2.2 中配制的 Proteinase K 溶液。将样品在 59 °C 下孵育 3 小时。如有时间限制，此步骤可过夜进行。</li>
	<li>向每个样品中加入 200 μl 冰冷的 Tris 饱和酚（若无 Tris 饱和酚，可用水饱和酚替代）。确保管盖紧闭，每个样品涡旋约 5 至 10 秒。</li>
	<li>将样品在 65 °C 下孵育 15 分钟，期间偶尔涡旋。孵育后冷却至室温，然后向每个样品中加入 1 mL 室温的乙醚并涡旋 5 至 10 秒。操作乙醚时务必在通风橱中进行，因其具有挥发性。</li>
	<li>将样品在 20,600x g 下离心 10 分钟。小心从离心机中取出样品，收集底部蓝色层。注意避免吸取上层透明层。宁可残留少量蓝色层，也不可被上层污染。</li>
	<li>通过重复步骤 2.7 至 2.9 对样品进行再次提取。通常两次提取已足够。若样品仍浑浊，可进行更多次提取。在进行 SDS-PAGE 分离前，向各提取后的样品中加入 200 μl 的 2x SDS 缓冲液。样品可在 8%–15% 的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。通常，使用该方法制备的 5–15 μl LPS 即足以实现可视化。</li>
</ol>
3. 代表性结果
按照上述方法制备的LPS样品，可在SDS-PAGE分离后通过标准的银染方法或商用LPS染色试剂盒进行直接染色观察。 Alternatively，可在聚丙烯酰胺凝胶上分离LPS后将其转印至硝酸纤维素膜，并使用LPS特异性抗血清进行Western免疫印迹分析。在本实验方案中，我们采用了Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit（Molecular Probes），并按照制造商提供的说明进行操作。
图1显示的是用Pro-Q Emerald 300染色的12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶。每条泳道含有15 μl来自不同菌株的Burkholderia dolosa脂多糖（LPS），这些菌株分离自囊性纤维化患者的痰液样本。通过该方法可明显观察到不同的LPS条带梯状模式，反映了连接在核心寡糖上的O-抗原重复单元数量的不同；例如，第1道和第6道的样品具有相似的条带模式（以红色框标出）。
<img alt="显示DNA条带分离的凝胶电泳结果；蛋白质纯化分析。" src="/files/ftp_upload/3916/3916fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 临床分离株Burkholderia dolosa的LPS经Pro-Q Emerald 300染色结果。从囊性纤维化患者爆发疫情中分离的七株B. dolosa菌株提取LPS，提取方法如本实验方案所述。取15 μl样品在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，并根据生产商说明书用Pro-Q Emerald 300染色。箭头所示为LPS核心区域，具有相似O-抗原重复条带模式的LPS用红色框标出。M = 分子量标记物。

<ol><li>Raetz, C. R., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+endotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide endotoxins.</a> Annu. Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).</li>
<li>Valvano, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+O-specific+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci%22%5BJournal%5D)">Export of O-specific lipopolysaccharide.</a> Front. Biosci. 8, 452-471 (2003).</li>
<li>Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide%3A+a+major+virulence+factor%2C+initiator+of+inflammation+and+target+for+effective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide: a major virulence factor, initiator of inflammation and target for effective immunity.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297, 277-295 (2007).</li>
<li>Freudenberg, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+lipopolysaccharide+susceptibility+in+the+innate+immune+response+to+Salmonella+typhimurium+infection%3A+LPS%2C+a+primary+target+for+recognition+of+Gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Role of lipopolysaccharide susceptibility in the innate immune response to Salmonella typhimurium infection: LPS, a primary target for recognition of Gram-negative bacteria.</a> Microbes Infect. 3, 1213-1222 (2001).</li>
<li>Jann, K., Jann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+antigens+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide antigens of Escherichia coli.</a> Rev. Infect. Dis. 9, Suppl 5. S517-S526 (1987).</li>
<li>McCallum, K. L., Schoenhals, G., Laakso, D., Clarke, B., Whitfield, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-weight+fraction+of+smooth+lipopolysaccharide+in+Klebsiella+serotype+O1%3AK20+contains+a+unique+O-antigen+epitope+and+determines+resistance+to+nonspecific+serum+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-weight fraction of smooth lipopolysaccharide in Klebsiella serotype O1:K20 contains a unique O-antigen epitope and determines resistance to nonspecific serum killing.</a> Infect. Immun. 57, 3816-3822 (1989).</li>
<li>Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+isolates+from+patients+with+cystic+fibrosis%3A+a+class+of+serum-sensitive%2C+nontypable+strains+deficient+in+lipopolysaccharide+O+side+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis: a class of serum-sensitive, nontypable strains deficient in lipopolysaccharide O side chains.</a> Infect. Immun. 42, 170-177 (1983).</li>
<li>Gupta, S. K., Masinick, S., Garrett, M., Hazlett, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+lipopolysaccharide+binds+galectin-3+and+other+human+corneal+epithelial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide binds galectin-3 and other human corneal epithelial proteins.</a> Infect. Immun. 65, 2747-2753 (1997).</li>
<li>Hitchcock, P. J., Brown, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+heterogeneity+among+Salmonella+lipopolysaccharide+chemotypes+in+silver-stained+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels.</a> J. Bacteriol. 154, 269-277 (1983).</li>
<li>Westphal, O., Jann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lipopolysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Carbohyr.+Chem%22%5BJournal%5D)">Bacterial lipopolysaccharides.</a> Methods Carbohyr. Chem. 5, 83(1965).</li>
<li>Lieberman, T. D. Parallel bacterial evolution within multiple patients ties novel genes to pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieberman%2C+TD+%22Nat+Genet%22">Nat Genet</a>. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

我们已描述了一种将脂多糖（LPS）与其他细胞组分（包括核酸和蛋白质）分离的纯化方法。该方法可获得高质量的LPS，可用于多种不同的可视化技术，例如对SDS-PAGE凝胶进行碳水化合物染色，如图1所示。该方法可用于利用特异性抗血清对多种菌株的LPS进行血清分型，或通过直接可视化来显示不同分离株之间的相关性。例如，最近一项全基因组测序研究结合一次 B. dolosa 疫情暴发中分离菌株的LPS表征，发现了一个单核苷酸多态性（SNP），该多态性与这些菌株中LPS的存在或缺失相关11。我们认为，该方法优于Hitchcock和Brown9所描述的对全细胞裂解物进行蛋白酶处理的方法，因为本方法相对快速，且足够严谨，能够获得适用于进一步分析的高质量LPS。
虽然我们仅展示了一个使用该方法的示例 洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia dolosa），本方案也可适用于其他革兰氏阴性菌物种。我们已成功应用此方案从其他物种中提取并可视化脂多糖（LPS） 伯克霍尔德菌属 sp.， 大肠杆菌、幽门螺...

<table><tbody><tr><td>重组DNase I，无RNase</td><td>Roche Group</td><td>04716728001</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Roche Group</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1700</td><td></td></tr><tr><td>Tris饱和酚</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1750-100</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Thomas Scientific</td><td>C313K31</td><td></td></tr><tr><td>Pro-Q Emerald 300 脂多糖凝胶染色试剂盒</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>P20495</td><td></td></tr></tbody></table>

通过热酚-水法提取纯化和可视化革兰氏阴性菌脂多糖

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要成分。它是一种三部分结构的分子，包括嵌入外膜中的脂质A、核心寡糖以及从细胞表面向外延伸的重复O-抗原单位。1, 2LPS 是一种免疫优势分子，对包括多种细菌在内的许多细菌物种的毒力和致病性具有重要作用， 铜绿假单胞菌，沙门氏菌 物种，以及 大肠杆菌3-5，而LPS O-抗原组成上的差异是菌株血清型分类的基础。LPS在感染初期参与细菌与宿主细胞的黏附，并提供对补体介导杀伤的保护；缺乏LPS的菌株其毒力可能减弱6-8因此，对脂多糖（LPS）进行可视化尤为重要，特别是来自临床分离株的LPS。通过观察LPS的条带模式及其被特异性抗体识别的情况，可有效用于鉴定菌株谱系并表征各类突变体。 
本报告中，我们描述了一种采用热酚水法从革兰氏阴性菌细胞中分离和纯化脂多糖（LPS）的方法。该方案能够将LPS与核酸和蛋白质有效分离，避免因使用时间较短、强度较低的提取方法而导致的LPS可视化干扰9。采用此方法制备的LPS可通过十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行分离，并直接使用碳水化合物/糖蛋白染色或标准银染方法进行染色。许多抗LPS抗血清中含有与外膜蛋白或其他抗原靶标发生交叉反应的抗体，这会干扰在SDS-PAGE分离的粗制细胞裂解液进行Western免疫印迹后所观察到的反应性。单独对粗制细胞裂解液进行蛋白酶处理，并不总能有效消除此类背景干扰，无论使用本方法或其他可视化方法均如此。此外，过度的蛋白酶处理虽旨在去除背景干扰，却可能导致LPS质量下降，无法通过上述任何方法获得良好分辨。基于这些原因，我们认为以下改编自Westpahl和Jann10的实验方案是LPS提取的理想选择。

我们介绍一种改良的热酚水法，用于从革兰氏阴性菌中纯化脂多糖（LPS）。提取后的LPS可通过SDS-PAGE进行分析，并通过直接染色或Western免疫印迹进行检测。

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要组分。它是一种三部分结构的分子，包括脂质A，该部分……

本实验的总体目标是从革兰氏阴性菌中提取脂多糖（LPS）。首先，在适宜培养基中培养5毫升细菌过夜培养物，并将培养物在600纳米处的光密度调整至0.5。接着，通过微量离心将细菌沉淀，然后将菌体细胞重悬于含有SDS以及巯基乙醇或巯基乙醇的Tris缓冲液中。然后将细胞裂解物煮沸，并用蛋白酶和核酸酶处理。最后，依次使用热的水饱和酚和乙醚进行两次抽提，小心地去除并保留水相蓝色层。最终，通过SDS-PAGE分离及使用LPS特异性抗体进行Western印迹分析，或对凝胶中的多糖直接染色，可以获得结果，以显示LPS的存在与否、细菌菌株的差异以及O抗原链长度的分布情况。与 Hitchcock 和 Brown 的蛋白酶处理法相比，该技术的优势在于能够获得纯度更高的脂多糖（LPS）样品，从而在 SDS-PAGE 和蛋白质印迹（Western blotting）中实现更清晰的分离。该方法可深入了解脂多糖在革兰氏阴性菌中的合成与调控机制，适用于几乎所有革兰氏阴性菌，包括大肠杆菌（e coli）和沙门氏菌（salmonella），以及分别作为生物防御和新发传染病病原体的艾拉菌（Ella）和醋杆菌（Acetobacter）。培养细菌以进行 LPS 提取时，需在 5 毫升 LB 培养基中接种革兰氏阴性菌，并添加抗生素，过夜培养。如有需要，在200 rpm、37摄氏度的摇床培养箱中过夜培养。用LB培养基按1:10比例稀释菌液，然后根据结果在600纳米处测定其光密度。制备1.5毫升细菌悬液，使其在600纳米处的终末光密度为0.5。在微型离心机中以10,600 × g离心10分钟，使细菌沉淀。然后移除并弃去上清液。为提取LPS，配制以下溶液：1×SDS缓冲液，含4% β-巯基乙醇（BME）、4% SDS和20%甘油的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 6.8），加入少量溴酚蓝，并分别配制10 mg/mL的DNA酶、RNA酶和蛋白酶K溶液，均用无菌蒸馏水溶解重悬。将200微升的1倍XSDS缓冲液中的菌体沉淀通过上下吹打确保完全重悬。将重悬的细菌在水浴中缓慢煮沸15分钟，然后在室温下冷却15分钟。作为可选步骤，向每份 DNA1 和 RNA 溶液中各加入 5 µL，并将样品在 37°C 下孵育 30 分钟。加入 10 µL 蛋白酶 K 溶液，并将样品在 59°C 下孵育 3 小时。随后在每份样品旁加入 200 µL 冰冷的 Tris 饱和酚。盖紧管盖，每管涡旋振荡5到10秒。将样品在65摄氏度孵育15分钟。孵育期间，偶尔涡旋振荡并冷却至室温。然后在通风橱中，向每个样品加入1 mL室温乙醚，涡旋5至10秒。将样品以20,600 ×g离心10分钟，并小心从离心机中取出。吸取每个样品的下层蓝色液体，避免接触上层透明液体。向每个试管中再加入 200 微升冰上预冷的 Tris 饱和酚，并重复提取。加入 200 微升 2×SDS 缓冲液。在 8% 至 15% 的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶上分别点样 5 至 15 微升的每种 LPS 样品。图中显示的是从囊性纤维化患者痰液样本中分离的不同布氏冷杆菌（Burkholderia dolosa）菌株制备的LPS样品在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的结果。不同的条带模式反映了连接在核心寡糖上的O抗原重复单元数量的差异。样品1和样品6中可见相似数量的重复单元。请注意，使用苯酚二甲醚时可能存在危险，应采取预防措施，例如穿戴防护性的个人防护装备，如实验服、手套和护目镜，且该实验操作必须在通风橱中进行。在执行此步骤时，应迅速完成萃取，以避免在处理过程中损失样品。在此步骤完成后，需采用蛋白质印迹法（Western blotting）或银染法（silver stain）及其他可视化方法来检测脂多糖，以分析菌株间的相关性。

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