通过热酚-水法提取纯化和可视化革兰氏阴性菌脂多糖

本实验的总体目标是从革兰氏阴性菌中提取脂多糖（LPS）。首先，在适宜培养基中培养5毫升细菌过夜培养物，并将培养物在600纳米处的光密度调整至0.5。接着，通过微量离心将细菌沉淀，然后将菌体细胞重悬于含有SDS以及巯基乙醇或巯基乙醇的Tris缓冲液中。

然后将细胞裂解物煮沸，并用蛋白酶和核酸酶处理。最后，依次使用热的水饱和酚和乙醚进行两次抽提，小心地去除并保留水相蓝色层。最终，通过SDS-PAGE分离及使用LPS特异性抗体进行Western印迹分析，或对凝胶中的多糖直接染色，可以获得结果，以显示LPS的存在与否、细菌菌株的差异以及O抗原链长度的分布情况。

与 Hitchcock 和 Brown 的蛋白酶处理法相比，该技术的优势在于能够获得纯度更高的脂多糖（LPS）样品，从而在 SDS-PAGE 和蛋白质印迹（Western blotting）中实现更清晰的分离。该方法可深入了解脂多糖在革兰氏阴性菌中的合成与调控机制，适用于几乎所有革兰氏阴性菌，包括大肠杆菌（e coli）和沙门氏菌（salmonella），以及分别作为生物防御和新发传染病病原体的艾拉菌（Ella）和醋杆菌（Acetobacter）。培养细菌以进行 LPS 提取时，需在 5 毫升 LB 培养基中接种革兰氏阴性菌，并添加抗生素，过夜培养。

如有需要，在200 rpm、37摄氏度的摇床培养箱中过夜培养。用LB培养基按1:10比例稀释菌液，然后根据结果在600纳米处测定其光密度。制备1.5毫升细菌悬液，使其在600纳米处的终末光密度为0.5。

在微型离心机中以10,600 × g离心10分钟，使细菌沉淀。然后移除并弃去上清液。为提取LPS，配制以下溶液：1×SDS缓冲液，含4% β-巯基乙醇（BME）、4% SDS和20%甘油的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 6.8），加入少量溴酚蓝，并分别配制10 mg/mL的DNA酶、RNA酶和蛋白酶K溶液，均用无菌蒸馏水溶解重悬。

将200微升的1倍XSDS缓冲液中的菌体沉淀通过上下吹打确保完全重悬。将重悬的细菌在水浴中缓慢煮沸15分钟，然后在室温下冷却15分钟。

作为可选步骤，向每份 DNA1 和 RNA 溶液中各加入 5 µL，并将样品在 37°C 下孵育 30 分钟。加入 10 µL 蛋白酶 K 溶液，并将样品在 59°C 下孵育 3 小时。随后在每份样品旁加入 200 µL 冰冷的 Tris 饱和酚。

盖紧管盖，每管涡旋振荡5到10秒。将样品在65摄氏度孵育15分钟。孵育期间，偶尔涡旋振荡并冷却至室温。

然后在通风橱中，向每个样品加入1 mL室温乙醚，涡旋5至10秒。将样品以20,600 ×g离心10分钟，并小心从离心机中取出。吸取每个样品的下层蓝色液体，避免接触上层透明液体。

向每个试管中再加入 200 微升冰上预冷的 Tris 饱和酚，并重复提取。加入 200 微升 2×SDS 缓冲液。在 8% 至 15% 的 SDS 聚丙烯酰胺凝胶上分别点样 5 至 15 微升的每种 LPS 样品。

图中显示的是从囊性纤维化患者痰液样本中分离的不同布氏冷杆菌（Burkholderia dolosa）菌株制备的LPS样品在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的结果。不同的条带模式反映了连接在核心寡糖上的O抗原重复单元数量的差异。样品1和样品6中可见相似数量的重复单元。

请注意，使用苯酚二甲醚时可能存在危险，应采取预防措施，例如穿戴防护性的个人防护装备，如实验服、手套和护目镜，且该实验操作必须在通风橱中进行。在执行此步骤时，应迅速完成萃取，以避免在处理过程中损失样品。在此步骤完成后，需采用蛋白质印迹法（Western blotting）或银染法（silver stain）及其他可视化方法来检测脂多糖，以分析菌株间的相关性。