Reinigung und Visualisierung von Lipopolysaccharid aus Gram-negativen Bakterien durch heiße wäßrige-Phenol-Extraktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, LPS aus gramnegativen Bakterien zu extrahieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine fünf Milliliter große Bakterienkultur über Nacht in einem geeigneten Medium gezüchtet und die Kultur auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 eingestellt wird. Anschließend werden die Bakterien durch Mikrozentrifugation pelletiert und die Zellen in einem Tris-Puffer resuspendiert, der SDS und Strahl- oder Capto-Ethanol enthält.

Dann werden die Zelllysate gekocht und mit Protease und Nuklease behandelt. Schließlich werden zwei aufeinanderfolgende Extraktionen durchgeführt, bei denen heißes wässriges Phenol und Dylether die wässrige blaue Schicht vorsichtig entfernen und zurückhalten. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die sowohl die Menge als auch das Vorhandensein oder Fehlen von LPS und Bakterienstämmen sowie die Modalität der O-Antigenkettenlänge durch Trennung durch SDS-Seite und westliche Blutanalysen mit LPS-spezifischen Antikörpern oder direkte Färbung der Polysaccharide im Gel zeigen.

Der Vorteil dieser Technik gegenüber der Proteasebehandlung nach Hitchcock und Brown besteht darin, dass diese Technik zu reinen LPS-Proben führt, die durch SDS-Page und Western Blotting besser aufgelöst werden können. Diese Methode kann Einblicke in die Synthese und Regulation von Lipopolysacchariden in VIR in praktisch alle gramnegativen Bakterien, einschließlich E-Coli und Salmonellen, sowie in die Bioabwehr und neu auftretende Krankheitserreger wie Ella und Acetobacter bzw. zum Züchten von Bakterien geben. Richten Sie für die LPS-Extraktion über Nacht eine Kultur mit gramnegativen Bakterien in fünf Millilitern LB ein, die mit Antibiotika ergänzt wurden.

Lassen Sie die Kultur bei Bedarf über Nacht in einem Schüttelbrutkasten bei 200 U/min und 37 Grad Celsius wachsen. Verwenden Sie LB, um die Kultur um eins bis 10 zu verdünnen, und messen Sie dann die optische Dichte bei 600 Nanometern basierend auf dem Ergebnis. Bereiten Sie eine 1,5-Milliliter-Suspension der Bakterien mit einer endgültigen optischen Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 vor.

Pelletieren Sie die Bakterien in einer Mikrozentrifuge bei 10, 600 mal G für 10 Minuten. Entfernen Sie dann den Überstand und entsorgen Sie ihn. Zur Extraktion von LPS bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: einen XSDS-Puffer, 4 % Betta me Capto Ethanol oder BME 4 % SDS und 20 % Glycerin in 0,1 molaren Tris HCL pH 6,8 mit einer Prise Bromphenolblau und 10 Milligramm pro Milliliter Lösungen von DNA, eins, RNAs und Proteinase K in sterilem destilliertem Wasser, resuspendiert.

Die pelletierten Bakterien in 200 Mikrolitern eines XSDS-Puffers sorgen dafür, dass das Pellet vollständig resuspendiert wird, indem die Lösung auf und ab pipettiert wird. Kochen Sie die suspendierten Bakterien langsam 15 Minuten lang in einem Wasserbad. Lassen Sie die Lösung dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen.

Als optionaler Schritt fügen Sie jeweils fünf Mikroliter der DNA-, Eins- und RNA-Lösungen hinzu und inkubieren die Proben 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Geben Sie 10 Mikroliter der Protease-K-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Proben drei Stunden lang bei 59 Grad Celsius. Fügen Sie neben jeder Probe 200 Mikroliter eiskaltes Tris, gesättigtes Phenol, hinzu.

Schließen Sie die Kappen fest und wirbeln Sie jedes Röhrchen fünf bis 10 Sekunden lang ein. Inkubieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Vortexen, gelegentlich auf Raumtemperatur abkühlen lassen.

Geben Sie dann unter einem Abzug einen Milliliter Ethylether bei Raumtemperatur zu jeder Probe und wirbeln Sie sie fünf bis 10 Sekunden lang ein. Zentrifugieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 20.600 mal G und nehmen Sie sie vorsichtig aus der Zentrifuge. Extrahieren Sie die untere blaue Schicht aus jeder Probe und vermeiden Sie die obere klare Schicht.

Fügen Sie weitere 200 Mikroliter eiskaltes Tris, gesättigtes Phenol, hinzu und wiederholen Sie die Extraktion in jedes Röhrchen. Fügen Sie 200 Mikroliter mit zwei XSDS-Puffern hinzu. Trennen Sie fünf bis 15 Mikroliter jeder LPS-Probe auf acht bis 15 % SDS-Polyacrylamid-Gelen.

Hier ist ein 12%iges SDS-Seitengel von LPS-Proben, die aus verschiedenen Stämmen von Bur Cold Area de losa hergestellt wurden, isoliert aus Sputumproben von Mukoviszidose-Patienten. Die verschiedenen Bandenmuster spiegeln die unterschiedliche Anzahl von O-Antigenen wider, sich wiederholende Einheiten, die an die Kern-Oligosaccharide gebunden sind. Eine ähnliche Anzahl von sich wiederholenden Einheiten ist in den Proben eins und sechs zu sehen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Phenol-Dathylether gefährlich sein kann, wenn Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. das Tragen von schützender, persönlicher Schutzausrüstung wie einem Laborkittel, Handschuhen und einer Schutzbrille, und diese Experimente sollten in einem Abzug durchgeführt werden, während Sie dieses Verfahren versuchen. Es ist wichtig, die Extraktionen schnell durchzuführen, damit Sie die Proben während der Verarbeitung nicht verlieren. Nach diesem Verfahren müssen westliche Immunblottings oder Methoden zur Visualisierung des Lipo-Polysaccharids durch Silber-STR oder andere Methoden angewendet werden, um die Verwandtschaft zwischen den Stämmen sichtbar zu machen.