Reinigung und Visualisierung von Lipopolysaccharid aus Gram-negativen Bakterien durch heiße wäßrige-Phenol-Extraktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, LPS aus gramnegativen Bakterien zu isolieren. Dazu wird zunächst eine Übernachtkultur von fünf Milliliter Bakterien in einem geeigneten Medium angezüchtet und die optische Dichte der Kultur bei 600 Nanometern auf 0,5 eingestellt. Anschließend werden die Bakterien durch Mikrozentrifugation pelletiert und die Zellen in einem Tris-Puffer, der SDS sowie Beam oder Captoethanol enthält, resuspendiert.

Anschließend werden die Zelllysate erhitzt und mit Protease und Nuklease behandelt. Schließlich erfolgen zwei aufeinanderfolgende Extraktionen mit heißem wässrigem Phenol und Dyl-Ether, wobei vorsichtig die wässrige blaue Phase entfernt und aufbewahrt wird. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Menge sowie Vorhandensein oder Fehlen von LPS und Bakterienstämmen sowie die Modalität der O-Antigen-Kettenlänge durch Trennung mittels SDS-Page und Western-Blot-Analysen mit LPS-spezifischen Antikörpern oder durch direkte Färbung der Polysaccharide im Gel zeigen.

Der Vorteil dieser Technik im Vergleich zur Proteasebehandlung nach Hitchcock und Brown besteht darin, dass mit ihr reine LPS-Proben gewonnen werden können, die mittels SDS-Page und Western Blotting besser aufgetrennt werden können. Diese Methode kann Einblicke in die Synthese und Regulation von Lipopolysacchariden in VIR in nahezu jede gramnegative Bakterienart ermöglichen, einschließlich E. coli und Salmonella, sowie in Biodefense- und neu auftretende Pathogene wie beispielsweise Ella und Acetobacter. Um Bakterien anzuziehen, bereiten Sie für die LPS-Extraktion eine Übernachtkultur gramnegativer Bakterien in fünf Millilitern LB-Medium, ergänzt mit Antibiotika, vor.

Falls erforderlich, kultivieren Sie die Kultur über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 200 U/min und 37 Grad Celsius. Verdünnen Sie die Kultur mit LB im Verhältnis 1:10 und messen Sie dann die optische Dichte bei 600 Nanometern entsprechend dem Ergebnis. Bereiten Sie eine 1,5-Milliliter-Suspension der Bakterien mit einer endgültigen optischen Dichte bei 600 Nanometern von 0,5 vor.

Zentrifugieren Sie die Bakterien in einer Mikrozentrifuge bei 10.600 × g für 10 Minuten. Anschließend den Überstand abgießen und verwerfen. Zur Extraktion von LPS bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: eine XSDS-Pufferlösung, 4 % Beta-Mercaptoethanol (BME) 4 % SDS sowie 20 % Glycerin in 0,1-molarer Tris-HCl-Pufferlösung, pH 6,8, mit einer Spur Bromphenolblau sowie 10 Milligramm pro Milliliter Lösungen von DNAase, RNAase und Proteinase K in steriler destillierter Wasser resuspendieren.

Die pelletierten Bakterien in 200 Mikroliter eines XSDS-Puffers sicherstellen, dass das Pellet durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren vollständig resuspendiert wird. Die resuspendierten Bakterien anschließend 15 Minuten lang langsam in einem Wasserbad erhitzen. Danach die Lösung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen lassen.

Optional fügen Sie je fünf µL der DNA-1- und RNA-Lösungen hinzu und inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 30 Minuten. Geben Sie 10 µL der Protease-K-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Proben bei 59 °C für drei Stunden. Geben Sie anschließend neben jeder Probe 200 µL eiskaltes Tris, gesättigt mit Phenol, hinzu.

Schließen Sie die Deckel fest und wirbeln Sie jedes Gefäß fünf bis 10 Sekunden lang. Inkubieren Sie die Proben bei 65 Grad Celsius für 15 Minuten. Während des Wirbelns kühlen Sie sie gelegentlich auf Raumtemperatur ab.

Danach unter einem Abzug ein Milliliter Ethylether mit Raumtemperatur zu jeder Probe hinzufügen und fünf bis zehn Sekunden lang verwirbeln. Die Proben zehn Minuten lang bei 20.600 ×g zentrifugieren und vorsichtig aus der Zentrifuge entnehmen. Die untere blaue Schicht aus jeder Probe entnehmen, wobei die obere klare Schicht vermieden wird.

Geben Sie zusätzlich 200 µL eiskaltes Tris-phenolgesättigtes Phenol zu jedem Röhrchen hinzu und wiederholen Sie die Extraktion. Geben Sie 200 µL 2x SDS-Puffer hinzu. Trennen Sie fünf bis 15 µL jeder LPS-Probe auf 8–15 %igen SDS-Polyacrylamid-Gelen.

Hier ist ein 12 % SDS-Page-Gel von LPS-Proben gezeigt, die aus verschiedenen Stämmen von Burkholderia dolosa gewonnen wurden, die aus Sputumproben von Patienten mit zystischer Fibrose isoliert wurden. Die unterschiedlichen Bandenmuster spiegeln die verschiedenen Anzahlen an O-Antigen-Wiederholungseinheiten wider, die an die Kernoligosaccharide angehängt sind. Eine ähnliche Anzahl von Wiederholungseinheiten ist in den Proben eins und sechs zu erkennen.

Beachten Sie, dass das Arbeiten mit Phenoldathylether gefährlich sein kann; Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzausrüstung, persönlicher Schutzausrüstung wie einem Laborkittel, Handschuhen und Schutzbrille, sollten getroffen werden, und diese Experimente sollten in einem Abzug durchgeführt werden, während Sie dieses Verfahren durchführen. Es ist wichtig, die Extraktionen schnell durchzuführen, um während der Verarbeitung keine Proben zu verlieren. Nach diesem Verfahren sind Western-Immunoblotting-Methoden oder andere Methoden zur Visualisierung des Lipopolysaccharids mittels Silberfärbung (STR) oder anderen Verfahren erforderlich, um die Verwandtschaft zwischen Stämmen sichtbar zu machen.