JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

1

1Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Biology. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.166.8.138, User IP: 54.166.8.138, User IP Hex: 916850826

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Bakteriler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini etkileme potansiyeline sahip salgılanan bileşikler üretirler. Burada katı ortam üzerinde Bacillus subtilis flüoresan raportör transkripsiyon suşlar ile toprak mikrop karıştırılarak gibi kimyasal olarak aracılık edilen türler arası etkileşimlerin saptanmasına imkan veren bir kokültürü ekran tarif eder.

    Date Published: 10/31/2013, Issue 80; doi: 10.3791/50863

    Cite this Article

    Shank, E. A. Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions. J. Vis. Exp. (80), e50863, doi:10.3791/50863 (2013).

    Abstract

    Doğada, bakteriler nadiren izolasyon var, onlar yerine metabolitler salgılayarak yerel çevreyi değiştiren diğer mikroorganizmaların çeşitli bir dizi ile çevrilidir. Bu metabolitler kendi mikrobiyal komşularının fizyolojisini ve farklılaşmayı modüle potansiyeline sahip ve kurulması ve kompleks mikrobiyal toplulukların bakım muhtemel önemli faktörlerdir. Biz, kimyasal olarak aracılık edilen mikrobiyal etkileşimleri belirlemek için bir flüoresan bazlı kokültürü ekran geliştirdik. Ekran katı ortam üzerinde çevresel mikroplarla bir flüoresan raportör transkripsiyon gerginlik birleştiren ve ortak kültürü koloniler büyümeye izin gerektirir. Bu ilgi belirli bir fenotip ifade edildiğinde, seçilen bakteri suşu fluoresces böylece flüoresan raportör transkripsiyon tasarlanmıştır (yani biyofilm oluşumu, sporulasyon, hastalık oluşturma faktörü üretimi, vs.) Tarama büyüme koşulları altında gerçekleştirilir wheBu fenotip yeniden ifade (ve dolayısıyla haberci soy tipik nonfluorescent olan) değildir. Çevresel bir mikrop bu fenotip aktive eden bir metaboliti salgılar, bu agar boyunca yayılır ve flüoresan raportör konstruktunu aktive eder. Bu, indükleyici-metabolit üreten mikrop tespit edilmesini sağlar: bu floresan koloniler en yakın nonfluorescent koloniler bulunmaktadır. Bu nedenle, bu ekran, bir haberci soyuna özel bir fizyolojik tepkiyi harekete geçirilen bir yayılabilir metabolitleri üreten çevre mikropların belirlenmesini sağlar. Bu yayın için nasıl anlatılır: a) Uygun kokültürü tarama koşullarını seçmek, b) muhabiri ve tarama için çevresel mikropların hazırlamak, c) kokültürü ekranı gerçekleştirmek, d) varsayılan organizmaların uyaran izole, ve e) ikincil ekranda faaliyetlerini onaylayın. Biz Bacillus subtilis biyofilm matris üretimini aktive toprak organizmaları için ekran için bu yöntemi geliştirdi

    Introduction

    Biz bakterilerin salgıladığı metabolitler komşu mikropların fizyolojisini ve gelişimini nasıl etkilediğini anlamak ilgilendi. Birçok metabolitler diğer mikropların üzerindeki etkileri için biyolojik olarak aktif karakterize edilmiştir. İki iyi tarif edilen örnekler, diğer mikropların küresel gen ekspresyonunu değiştiren diğer mikropların büyümesini inhibe antibiyotikler, ve çoğunluk algılama molekülleri içerir. Bununla birlikte, bakteriler bilinen biyolojik aktiviteye 1 diğer birçok küçük molekül doğal ürünler üretmek. Biz bakteri gelişti ve onları en çok bakteri var, içinde kompleks mikrobiyal toplulukların kendi mikrobiyal komşularının hücresel fizyolojisini modüle izin çünkü bu metabolitlerin bazı üretmek için yeteneği korunmuş olması varsayımında.

    Bacillus subtilis hücre tipleri

    Biz bacil içeren kimyasal olarak aracılık mikrobiyal etkileşimleri konusunda çalışmalar yoğunlaşmıştırlus subtilis. Bu sadece, çünkü Gram-pozitif bakteri modeli ve manipülasyon için uygun edilen genetik araçlar olarak durumu, aynı zamanda, çünkü, özelliği hücre tiplerine ayırt kabiliyetini taşımaktadır. Örnekler hücreler bulunmaktadır:; sağlam biyofilm oluşumu için gerekli olan hücre dışı matrisi üretmek; çevre DNA almak için yetkin, yüzme ve diğer 2 arasında, sporlanan. Bu hücre tipleri, her biri onları, fizyolojik ve / veya fiziksel olarak ayrı bunların genetik olarak özdeş kardeşler yapan bir vasıftır, transkripsiyon regulon ifade eder. Birçok büyüme koşulları altında, birden fazla hücre tipi B. Tek bir koloni içerisinde gibi çeşitli alt-popülasyonunu arada subtilis hücreleri 3. Bakteri birçok türün benzer hücre tipi heterojen gösterebilirler, ancak, bu olgu özellikle de B. incelenmiştir subtilis.

    EPD olan belirli genlerdeBu özel B. her biri içinde egulated subtilis hücre türleri tespit edilmiştir. Bu ilgi mikrobiyal fenotipleri çok doğrudan gözlemlemek zor veya imkansız olduğu için bu tür yukarı düzenlenen genlerin belirlenmesi burada açıklanan çalışma için gereklidir. Örneğin, görsel, böyle katı (% 1.5) ağar plakaları üzerinde yüzme gibi bir özellik tespit edemez bile B'nin ICSI'nin subtilis hücreleri bu koşullar altında 3 flagella'yı üretirler. Başka bir örnek biyofilm matris-üretimidir. Matriks üretimi (bu makroskopik kırışık koloniler ile sonuçlanır gibi) koloni morfolojisi ile görselleştirilmiştir, ancak bazı büyüme ortamında ve sadece büyüme 4 birden fazla gün sonra olabilir. Bununla birlikte, genlerin farklılaşması sırasında düzenlenen hangi bilerek, bu hücre tiplerinin içine hücresel farklılaşma belirteçleri olarak hareket kopyalayıcı gazetecilere inşa edebilirsiniz.

    Raportör

    Bu floresan transcriptional muhabir hücre tipi özel bir flüoresan protein genleri, örneğin, bir raportör genin üretimini tahrik etmek için promotörler içerir. Örnekler P x x gen için promotör bölge gösteren P (hücreler yüzme) YY-YFP, P Tapa-YFP (biyofilm matrisi üreten hücreler için) ve (sporlanan hücreler için) P-YFP SSPB içerir. Fenotip yerli düzenleme değişmeden kalır, böylece bu raportör kromozom üzerinde bir nötr lokusuna entegre (Şekil 1 ve aşağıya bakınız) vardır. Bir hücre bu fenotip ifade Ancak, şimdi, o da bir floresan proteini ifade eder. Bu bize, bu fizyolojik yanıtı aktive mikroplar taranması sağlayan, belirli fenotipik davranış aktivasyon kolayca görsel Okuması sağlar. Böyle gazetecilere yaygın mikrobiyoloji kullanılmasına rağmen, onlar geniş identif ekranları uygulanan edilmemiştirBu yöntemle önce mikroplar arasında y metabolik etkileşimler 5 nitelendirildi.

    Hücre-tipi-spesifik haberci soylarının tasarımı ve kurulmasında önemli hususlar vardır. Yapıları diğer türleri kesinlikle mümkün olmasına rağmen biz sadece transkripsiyon floresan gazetecilere kullanmıştır. Biz iki nedenden dolayı, ancak, bizim ekranda hücre tipi farklılaşması için belirteç olarak öteleme füzyonların kullanımını vazgeçirmek: soğukkanlı yerel hücre türüne özgü protein ayrılmak 1) arzu, ve 2) tanıma bir diffüz, hücre- Geniş floresan (çeviri füzyonlarmı ile ortak) hücreler içinde lokalize puncta daha tespit etmek daha kolay olacaktır.

    Muhabir gen seçimi

    Bir okuma olarak transkripsiyon kullanmak için karar verdikten sonra, raportör geni (örneğin LacZ, floresan ya da lusiferaz) seçilmelidir. LacZ en özel ihtiyaç avantajına sahiptiralgılamak ekipman uluslararasılaûtırırken, ancak çevresel mikropların arasında yanlış pozitif çok daha yüksek bir ihtimal. Bizim ellerde, Lac toprak mikroplar arasında organizmaların + arka plan seviyesi (; veriler gösterilmemiştir toprak mikropların% 10 X-gal plakalar üzerine) Lac + (mavi idi >>) yasaklı yüksek oldu. Bu girişimi yoktu, ancak bu, ortam içinde X-gal konsantrasyonunu titre edilmesi ile, bu X-gal habercisinin kullanımına izin vermek için optimize edilmiş olması olasıdır. Lüsiferaz algılama için yüksek hassasiyet sağlar ve en dik muhabir: çevresel mikropların doğal ışıltılı olmanın neredeyse hiç şansı yoktur. Bununla birlikte, en çok oyuklu plakalar içerisinde sadece bölgesel bölgeleri taramak için tasarlanmış olduğu gibi zor, tüm Petri levhalar arasındaki ışıldama tespit izin bizim kurumunda aletleri tespit bulunmuştur. Ayrıca eşzamanlı fiziksel olan izin verilen bir şekilde ışıldayan koloniler görselleştirme komplikasyonlar olabilirneden olan organizmaların olation. Fiduciaries kullanarak bu mümkün yapmış olsa da, yerine B. çalışmak için kanıtlanmış olan floresan transkripsiyonel gazetecilere, kullanmak seçildi subtilis, algılama ve toprak organizmalar arasında düşük yanlış pozitif oranları yeterli duyarlılık sağlanan ve görselleştirme ve izolasyon prosedürleri hem de kolayca kullanılabilir enstrümantasyon kullanmak için izin.

    Fluoroforun seçimi

    Seçilen özel fluoroforun sizin bakteri türlerinin bağlıdır, kullandığınız agar büyüme ortamı ve özellikle floresan filtre kullanılabilir olması ayarlar. Bizim enstrümantasyon, bulduğumuz B. hem subtilis kendilerini ve YFP (sarı floresan protein) filtreler kullanıldığı zaman onlar bizim ellerde GFP (yeşil floresan protein) bu muhabir üstün yapım, daha az sergilediklerini eşiğe yetiştirilmiştir agar kolonilerinin. Floresan proteinler kodon kullanımı olanya da sık sık da bakteri türleri çalışmak için ya da bir kurucu promoter kullanılarak açık bir şekilde test etmek için, literatürde bilinen bir flüorofor seçmek için önemli hale ökaryotlar için optimize edilmiştir. Sürekli gelişen floresan protein varyantları sayıda kaynağa açıkça deney 9 için uygun bir floresan proteini seçiminde rehberlik bazıları 7,8, bir dizi gözden edildiği, 6 mevcut.

    Yarışmayı seçimi

    Bir promotörün seçimi büyük ölçüde bir hücre tipi ya da ilgi fenotipe bağlıdır. Örneğin B olarak organizmalar için subtilis, bir hücre tipi özel raportör genler, literatürde kurulmuştur. Diğer bakteriyel suşlar için, bir mikro ya da transkripsiyonel verileri temelinde yüksek koşullar altında yukarı regüle olan genler hakkında bilgi temin etmek için gerekli olacaktır burada ilgi i da hücre tipis tezahür. Yeni bir çalışma B. transkripsiyonunu Katalogda fayans mikrodizinleri 10 kullanarak 104 farklı büyüme koşulları altında subtilis. Bu kağıt genler son derece az-iyi-fenotip için çok değerli olan, farklı koşullar altında regüle edildiği hakkında kapsamlı bilgi sağlar.

    Aksine ilgi her gen için promotör bölge kesin haritalama yerine, tipik olarak sadece promoter olarak, genin üst akışında 200-500 bp dizisi kullanır. Tam dizi uzunluğu genomik koşullara bağlıdır: Gerekli açık okuma çerçevelerini komşu yukarı kodlama bölgeleri de dahil olmak üzere önlemek için daha kısa zaman bölgeleri kullanılır.

    Nötr loci ve entegrasyon

    Da bakteri soyundaki haberci yapı, bir flüoresan raportör transkripsiyon gerilme tasarımı nihai soru olur korumak için. Bakterilerde, ilgi konusu genler sıklıkla korunurantibiyotik seçimi kullanarak plazmidler üzerinde. Bununla birlikte, çevresel mikrop öldürmeden ortak kültürü sırasında antibiyotik kullanmak mümkün olmayabilir. Plazmidler istikrarlı bir şekilde bakteri türlerinde muhafaza edilir, bu da bakteri taraması için raportör hazırlamak için antibiyotiklerin varlığında bir plazmid-kaynaklı reporter içeren büyümesi mümkündür ve daha sonra umuduyla kokültür kendisi sırasında antibiyotik ortadan kaldırabilir bu plasmid olacak yeterince floresan izin vermek için muhafaza edilebilir. Plazmidler kolayca bakteri içinde kaybolur, ya da stres şartları altında kaybolur, ancak bu uygun bir seçenek olmayacaktır. Birçok durumda, en iyi çözüm daha seçim yokluğunda muhabir kararlı bakımına olanak bakteriyel kromozomu üzerinde raportör yapıyı entegre olacaktır. Ilgi genin normal ifadesini veya düzenlemeyi bozmayacak entegrasyon açısından, biz kromozom üzerinde ektopik site içine entegre tavsiye ettiklerini can olarak hareket "nötr odağının." B. In subtilis bu entegrasyon siteler genler olduğunu - mutasyona uğradığı zaman - (entegranlarm antibiyotik seçimi olmadan tespit edilmesi sağlayan) belli minimal medyada bir fenotip iletmek, henüz zengin medya büyüme veya sporulasyon oranlarını değiştirmez, ve amyE, Laca gibi genlerini içerir, thrC, Pird, Glta ve saca (nişastayı kullanma yeteneği taşıma, β-galaktozitler, treonin, urasil, glutamat, ve sükroz, sırasıyla), 11-13.

    Bu genlerin entegrasyon B'de yıllardır güvenilir kullanılmış olsa da subtilis (özellikle amyE Laca ve at), benzer bilgiler birçok diğer bakteri türlerinde genler için uygun olmayabilir. Faj bağlanma sitelerinin kullanımı nötr kromozom olarak entegrasyonu siteler için büyük alternatiflerdir: çok türe özel 14-16, hem de bu tür Tn7 birleşme bölgesi (att Tn7) gibi genel entegrasyon sitelerinbir çok bakteri türleri 17,18 tespit ve gen eklemeleri için kullanılmıştır.

    Çevre mikroplar

    Biz kokültürü ekran için çevresel mikropların doğrudan kaynağı olarak toprak kullanın. Toprak mikropların yüksek çeşitlilik içerir ve bu organizmaların bir çok doğal ürün zengin bir kaynağıdır. (Topraktan bakterilerin önceden izole edilmeden) fluoresan transkripsiyonel raportör türü ile plakalar üzerine yerleştirilir toprağın sıvı süspansiyonlar kullanarak, büyük ölçüde deneysel yaklaşım basitleştirir. Toprak ya da hemen sonra hasat kullanılabilir ya da gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C de dondurulabilir. Hemen kullanımı sanayide iyi donma hayatta olmaz olanlar dahil olmak üzere, mikrop daha büyük bir çeşitlilik potansiyel olarak yetiştirilebilir avantajı vardır. Bu kullanılmalıdır ekran plakalarının sayısının artırılması, bu örneklerden ekilebilir toprak organizmaları konsantrasyonu bilinmeyen dezavantajına sahiptir. Delayed kullanımı koloni optimize edilmiş bir sayıda, her ekran plaka üzerinde büyümüş izin vererek, her bir toprak kaynağı için cfu / ml önceden belirlenebilir bir avantajı vardır. Ancak, toprak organizmaları dondurma kalan yeteneğine sahip olması gerekir.

    Büyük filogenetik çeşitlilik olarak matris-indüksiyon ekranında tanımlanan isabet görülmemiştir: (toprak kaynaklarının yani) incelenmektedir indükleyici havuz çeşitlendirilmesi aynı topraklar üzerinde derinlemesine tarama daha yeni türler arası etkileşimler belirlenmesi daha etkili gibi görünmektedir unutmayın Ek toprak kaynakları daha ziyade iyice aynı toprak kaynakları (EA Shank ve R. Kolter, Harvard Tıp Fakültesi, yayınlanmamış sonuçlar) tarama daha incelendi.

    Genel bakış

    Biz burada açıklamak yaklaşımı, teknik gereklilikler açısından basittir. Bu içerir: 1) B'deki bir flüoresan raportör transkripsiyon yapımında subtilis ya da birdiğer ilgi bakteri türleri, 2), bu muhabir aktif değil hangi şartlar altında belirlenmesi 3) (bizim durumumuzda toprakta, ancak diğer kaynaklar yerine kullanılan olabilir) bu muhabir gerginlik ve taranması organizmaların alikolarını hazırlanması 4) Bu karıştırma Katı ortam, 5) tanımlanması ve varsayılan organizmaları uyaran izole, ve 6) bu organizmalar gerçekten ikincil ekranda bu fenotip aktive edersiniz teyit mikropların iki takım. Belirlendikten sonra, bu organizmalar ve bunların metabolitleri bakteri fizyolojisi ve mikrobiyal etkileşimleri çalışmak için, bakteriyel davranışı modüle etmek ve potansiyel gelecek terapötik bileşikler gibi yeni iskeleler hareket kimyasal araçları ile bize.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Protocol

    1.. Bir raportör gen seçin ve bir floresan haberci yapı Transkripsiyonel

    B. subtilis için:

    1. Bacillus subtilis floresan transkripsiyonel raportörler, yapımını anlatan bir protokol için referans 19 JoVE makaleye bakın.

    Diğer bakteri türleri için:

    1. Ilgilenilen fizyolojik yanıt sırasında yukarı düzenlenen bir genin belirlenmesi. Bu, mevcut edebiyat ya da belirli koşullar altında mikrobun transkripsiyonel analizine dayalı olabilir.
    2. Fenotipindeki değişiklik için bir vekil olarak hareket etmek, bu gen için bir flüoresan raportör transkripsiyon oluşturun. Bu konstrukt, (bkz. Şekil 1), uygun bir floresan protein üretimini sürüş bu yukarı düzenlenmiş genin promoteri içermelidir.
    3. Kromozom üzerinde nötr bir lokus içine bu yapıyı entegre. Bu sayede bu doğal belgeliİlgi konusu genin ulation bozulur ve çevresel mikropların büyüme ile etkileşebilir plazmid seçimi mekanizmalar (örneğin antibiyotikler) ihtiyacını ortadan kaldırır değildir.

    2. Coculture Şartları belirleyin

    B. subtilis P Tapa-YFP muhabir için:

    1. Kullanım 0.1x LB, bu muhabir için Lennox (1 g tripton, 0.5 g maya özütü, litre başına 0.5 g NaCl) ortamı, B. tarihi subtilis matris-üretim Luria Broth on 20 az. Bu ortam sağlar: B. 5 büyümeye topraktan farklı takson izin verirken subtilis koloniler, submillimeter ancak gözlemlenebilir boyutu büyür.
    2. Potansiyel pH değişiklikleri en aza indirmek için 100 mM MOPS tamponu içerir.

    Diğer bakteri türleri için:

    1. Kullanın activatio transkripsiyonel verileri yayınlanmış veya ampirik mikrop büyür birini tanımlamak için çeşitli kültür koşullarını sınamak amafloresan haberci n (haberci soyu uyaran mikroplar ile birlikte-kültür yetiştirilir zaman onun aktivasyon tespit izin vermek için). önemsiz
    2. (Örneğin toprak gibi) oligotropik ortamlarda çevresel mikropların tarama sırasında yüksek besin koşulları 21 ile sunulduğunda birçok oligotropik bakteriler büyümek değil, çünkü (geleneksel zengin mikrobiyolojik medyaya göre) düşük besin içeriğine sahip bir ortamı kullanın. Düşük bir besleyici ortam ayrıca, ekranın artırıp, koloni oluşumunu azaltır.
    3. Düşük eşiğe ve iyi optik netliği ile bir ortam seçin.
    4. Muhabir gerginlik ve çevresel mikropların hem de aynı anda büyümeye izin vermek için büyüme sıcaklığı optimize.
    5. Bir tamponlama maddesi ilave edilmesini düşünün. Bu tür etkileşimler ilgi olmadıkça plakalarda tamponun kullanımı, fizyoloji 22 pH aracılı değişikliklerin tespit olasılığını azaltacaktır.

    3. Muhabir Alikolar hazırlayın

    B. subtilis P Tapa-YFP muhabir için:

    1. Steril bir kürdan veya aplikatör çubuk kullanarak taze LB plaka üzerine -80 ° C donmuş stoktan Streak muhabiri suşu.
    2. 30 ° C de bir gece boyunca büyütün
    3. Katı ortam üzerinde büyüme kaynaklanan arka plan floresan en aza indirmek için, sıvı kültür içinde bir seri seyreltmeleri yapın:
      1. LB, 5 ml sıvı kültürü inoküle ve 37 ° C'de çalkalama ile büyür
      2. Kültür OD 0,6 ~ 600 ulaştığı zaman, 0.02 OD 600 için 5 ml taze LB seyreltin.
      3. Kültürlerin OD 600 ~ 0,6 ulaşana kadar çalkalama ile tekrar 37 ° C'de büyür.
      4. Seri büyüme Dilüsyonlar 3x toplam tekrarlayın.
      5. Nihai seri seyreltme kültür 600 ~ 0,4 OD büyüsün.
    4. % 15-20 gliserol ekleyin.
    5. 50-200 kısım 0.5 ml mikrofüj tüplerine ul ve -80 ° C'de dondurularak
    6. Annemuhabiri nonfluorescent ana suşu için ke eşdeğer tümbölenleri (bunlar ikincil tarama sırasında istenecektir.)

    Diğer bakteri türleri için:

    1. Düşük arka plan floresan sahip hücreleri için (yani, muhabir kullanılan promotör çok az ifade olduğu koşullar altında yetiştirilir.)
    2. (Daha fazla bilgi için bakınız yukarıdaki bölüm) yapın ve koloni bir uygun sayıda, her kokültürü ekran plaka üzerinde yetiştirilebilir böylece muhabir soyun bilinen cfu / ml (mililitre başına koloni oluşturan üniteler) ihtiva eden alikotları dondurma.
    3. Nonfluorescent ana suşu için eşdeğer hacimde yapmak (bunlar ikincil tarama sırasında istenecektir.)

    4. Toprak Örnekleri Alınır

    1. Maruz kalan yüzey toprağının üst 0.5 cm atarak, steril konik tüpler veya bir spatula kullanarak steril torbalara toprak toplayın.
    2. 1 g başına 10 ml 'lik bir oranda, steril tuzlu su (% 0.85 NaCl) ekleyinBir toprak bulamaç yapmak için toprak.
    3. Toprak parçacıkları bakterilerin çıkarmak için bir yöntem seçin: taze bir numune) hemen kullanım veya numune dondurma sonra b) gecikmiş kullanımı.
      1. Acil kullanım için, 1 dakika boyunca vorteks bulamaç.
      2. Gecikmiş kullanım için, karıştırma döngüsü arasında 1 dakika boyunca buz üzerinde blender kavanoz destekleri yerleştirilmesi, üç dakika 1 döngü için karıştırıcı içinde toprak çamuru karışımı.
    4. Toprak çamuru ~ 1 dakika dinlendiriniz.
    5. , Yeni bir tüpe üst sulu katman hareket ettirin.
    6. % 15-20 arasında bir son konsantrasyona gliserol ekleyin.
    7. 50-200 kısım 0.5 ml mikrofüj tüplerine ul ve -80 ° C'de dondurularak

    5. Dondurulmuş Reporter Ve Toprak Alikotun kob / ml belirleyin

    1. Donmuş toprak ve muhabir kısım Çözülme. Toprak mikrop buz üzerinde çözülmüş olabilir. Çünkü B. 4 ° C'de lize subtilis, bunlar tam bölünen miktarları düşük bir sıcaklıkta harcanan zamanı en aza indirmek için oda sıcaklığında hızlı bir şekilde çözdürülmelidir.
    2. Iki suret Seria olun0,1 x LB veya başka bir izotonik tampon maddesi içinde l dilüsyonları (10 -8 için).
    3. Kokültürü tarama için kullanılacak olan aynı ortamın agar plakaları üzerine her bir seri seyreltme plaka 5 ul lekeler.
    4. RT (veya tarama için kullanıyor olacak sıcaklığında) büyür.
    5. Ertesi gün, her bir nokta içinde koloni sayısını saymak ve dondurulmuş alikotları her cfu / ml hesaplanır.

    6. Fark Ekran Tabaklar kısım Konsantrasyonları onaylamak

    1. Adım 5.1 'de olduğu gibi bir kısım donmuş çözülme.
    2. 5 x 10 5, 1 x 10 x 1, 10 5, 2.5 x 10 5 seyreltin 6 ve 2.5 x 10 7 cfu / ml.
    3. Bireysel plakalarının merkezi her bir seyreltinin 50 ul nokta ekleyin. Bunlar hesaplanan plaka başına 25,000 koloni optimum, hem de 2 ile plakaları verim gerekir - ve 5 - en gerçek seyreltme belirlenecek sağlayan, daha az kat.
    4. Yaklaşık 20 steril cam (3 mm) boncuk göre ekleyavaşça plaka üzerine dokunarak. Boncuk bükülmüş bir cam yayıcı göre daha plaka üzerinde kolonileri daha düzgün dağılımını sağlar.
    5. Sıvı absorbe edilene kadar, benchtop plakaları tutmak ve ileri geri sallayarak, çalışmak gibi çevirerek hücreleri yayılır. Plaka kuruduktan sonra boncuk sallamayın devam etmeyin, aksi takdirde bakterileri öldürmek için başlayacak.
    6. Üzerinde tabak çevirme ve etanol içeren atık behere boncuk atın.
    7. Plakaları (örneğin 24 ° C / RT) sizin tahlil için doğru sıcaklıkta deneyde (örneğin 24 saat) zaman büyümesine izin.
    8. Diseksiyon Stereoskop kullanma, görünüm, iki veya daha fazla alanda koloni sayısı.
    9. Alan başına koloni sayısını hesaplayın ve her plaka üzerinde kaç koloni belirler.
    10. Gerekli gelecekteki seyreltilerini ayarlayın. Kolonilerin gerçek sayısı her Benzer ekran plaka üzerinde aynı sayıda sahip olarak önemli değildir.

    1. Adım 5.1 'de olduğu gibi çözülme raportör kısım (ve eğer toprak dondurulmuş numune).
    2. 0.1x LB veya diğer düşük besin, izotonik çözelti içinde (6. bölümde optimize konsantrasyonlara) muhabiri seyreltin.
      1. Donmuş toprak için: 0.1x LB veya diğer düşük besin, izotonik çözelti içinde 6. bölümde optimize konsantrasyona seyreltilir.
      2. Taze toprak için: toprak bulamacın cfu / ml 10 -4 10 -9 cfu / ml aralığında olabilir tahmine dayalı bir taze toprak çamurunun dilüsyonları, olun.
    3. Nokta kokültürü ekran plakasının merkezinde üzerine toprak ve raportör dilüsyonlardan 50 ul. Ayrıca, plaka başına toprak ve tek başına kontrol olarak muhabir.
    4. Aşama 6.4-6.6 açıklandığı gibi cam boncuklar kullanarak yayıldı.
    5. Floresan muhabiri, çizgi etkinleştirmek veya bu koşullar altında muhabiri plaka ve tarama sırasında bir pozitif kontrol olarak kullanmak için büyüyebilir bilinen büyüme koşulları varsa. 28 saat (ya da raportör / deneyi için uygun şekilde) - 24 boyunca 24 ° C'de inkübe edin

    8. Floresan için ekran Coculture Tabaklar

    1. Koloniler keskin böylece aydınlık aydınlatma kullanarak, Stereoskop odaklanır.
    2. Senin toprak numunesi kolonileri autofluorescent olup olmadığını belirlemek için toprak sadece plakaları bak. Bu durumda, bu toprak (ikincil taramasında eşlik eden bir artış ile birlikte) yanlış pozitif yüksek oranda neden olabilir.
      1. Indükleyicisidir onlar yanlış pozitif olarak tespit edilecek şans (Şekil 2) azaltarak, birçok muhabir koloniler çevrili olacağını şansını artırmak için kokültürü plakaları toprak: muhabiri yüksek bir oranını kullanın.
      2. Farklı bir floresan protein (farklı bir kanalda yayan bir) kullanın.
    3. Tahlil zamanlamasını belirler. En yeni gazetecilere için de, potansiyel indüksiyonu zamanlama bilinmemektedir ve bu nedenle deneysel olarak tespit edilmelidir.
      1. Kısa sürede koloniler diseksiyon Stereoskop (büyütme ~ 30X) ile açıkça görülür hale gelir ve büyüme sona ermiştir ve / veya arka plan floresan çok yüksek olana kadar periyodik plakaları inceleyerek devam ederken floresan için tarama başlar.
      2. Potansiyel indüksiyonunun zaman penceresi, belirli bir muhabir için tespit edildikten sonra, bu ekran plakaların izlenmesini kolaylaştırmak, bu muhabir içeren tüm kokültürü levhalar için benzer olmalıdır. B. subtilis P tapa-YFP muhabiri, plakaları incelemek için uygun zaman hücreleri kaplama sonra 24-28 saat arasında, B. subtilis P SSPB-YFP muhabiri, bu büyümenin 26-32 saat arasındadır.
    4. Lütfen floresan maksimize etmek:
      1. Lütfen floresan diseksiyon kapsamı, karanlık bir odada ya da karartma perdeleri çevrili olun. İndüksiyon olasılıkla bir kurucu şekilde üretilen FP daha az yoğun ve daha büyük olması gerekmektedir sensi doyurmayaalgılamak için tivity.
      2. Floresan lamba stabilize etmek ve gözlerini kokültürü plakaları (en az 1-2 dk) floresan algılamak için denemeden önce karanlığa ayarlamak için zaman tanıyın.
    5. Bir pozitif kontrol kullanarak (eğer varsa), kullandığınız büyütme floresan algılamasına olanak sağlar emin olun. Büyütme genellikle iyi görüş alanınız yaklaşık tipik bir koloni çapı (200-400X) 30-50x ise.
    6. Parlak ışık kapatın ve floresan için kapağını açın.
    7. Gözlerini karanlığa ayarladıktan sonra, yavaş yavaş parlak noktalar arıyor, görüş alanınızda geri ve ileri plakasını taşıyın.
      1. Plakanın üst başlatın ve plakanın alt kısmına doğru hareket ederken plaka yan-yana hareket ettirmek için bir zigzag deseni kullanın.
      2. Pratik plaka taşımak için nasıl yavaş yavaş bir fikir edinmek için, ve tüm sur kapsayan emin olmak için aydınlık içinde plaka hareketlialana karşı karşıya.
      3. Yeterince yavaş koloniler bulanık olmazlar plakasını taşıyın. Daha çok özledim alanlarda daha yüzeyini oversample daha iyidir.
      4. Tam bir süpürme sonra, plaka 90 ° ve tekrar açın. İnsan gözü bu yöntemle bile sönük floresan tespit de oldukça iyi.
    8. Eğer floresan tespit ederseniz, plaka hareketli durdurmak ve geri dönün ve floresan alanı bulmak.
    9. Yavaş yavaş aydınlık dönüm, floresan bir bakteri kolonisi (ve autofluorescent toprak tortusu veya medya bileşenleri) ile ilişkili olup olmadığını belirlemek. Eğer öyleyse, floresan kolonisine yakın nonfluorescent kolonileri uyaran varsayımsal organizmalardır.

    9. Putatif Endükleyen Organizmalar izole

    1. Bir kez kaynaklı (flüoresan) koloniler tespit edilmiştir, indükleyici bileşiklerin salgılayan koloni izole eder.
      1. Raportör koloni yeterince yüksek bir konsantrasyon plaka üzerinde büyüyen ise(> 0.5:1 muhabir: toprak cfu), varsayılan oluşturmama kolonileri (yine, bakınız Şekil 2) Birden fazla floresan koloniler ile çevrili olacak.
      2. Olduğu durumlarda kokültürü büyüme karmaşıklığı, ettiricisi olan koloni o belirsiz kılan ikincil ekranda sonraki test için birden fazla potansiyel oluşturmama koloniler izole.
    2. Eğer görüş alanının merkezinde almak istiyorum koloniler yerelleştirilmesine.
      1. Bu plaka kenarına yakın ise, plakanın ağız (sağ elini ise, yani, soldaki plakanın ağız koymak) uzakta dominant elden böylece, plaka döndürün. Bu, toplama doğruluğunu artırır düşük bir açıyla koloniler yaklaşmasını sağlar.
    3. Kullanılan ipuçlarını içine atmak için yakındaki üzerine çizgi varsayımsal uyaran organizmalar, yanı sıra atık beher taze tabak yerleştirin.
    4. Üzerinde floresan lamba bırakarak, parlak ışık yavaşça açınEğer, (şekil ve pozisyona göre) floresan koloni ve çevresindeki varsayılan uyaran organizmaları tespit etmek mümkün olacak, böylece, üzerinde. Eğer hiçbir floresan ve sadece parlak ışık olduğunda almak istiyorum koloniler tespit edebilmek için ışık ile ileri geri birkaç kez gitmek gerekebilir.
    5. Steril, yuvarlak 200 ul jel yükleme ucu pick up ve bir kalem gibi tutmak için bir cam çubuk (200 mm uzunluğunda x 5 mm çapında) kullanın. Bu tek tek koloniler izole etmek için kullanacağınız toplama aracıdır.
    6. Çalışma yüzeyi üzerine stabilize aşamada karşı dış avuç dinlendirin. Lütfen toplama aracı stabilize etmek için elinizin iç, başparmak tarafındaki diğer elinizi koyun.
    7. Gerekirse, almak istediğiniz koloniler belirlemek için floresan ve aydınlık görünümleri arasında tekrar çevirin.
    8. Levha yüzeyi üzerinde pipet tutulması, görüş alanınızda içine taşımak ve almak istiyorum kolonisi üzerinde ortalamak. Ucu odak dışında olacaktır.
    9. (Mikroskop aşamasında veya çalışma yüzeyinin üzerinde dinlenme) elinizin dış kenarını kullanarak, yavaş yavaş aşağı çekilmesi için koloni pipet döndürün. Kaç diğer kolonileri uç temaslarını en aza indirmeye çalışırken, çok hafifçe dokunun.
    10. Taze bir plaka bir bölümünün üzerine toplama aracı, çizgi dönen olmadan. Oluk açma agar önlemek için yumuşak bir dokunuş ile yayıldı. Bu yöntem ile aktarılan hücrelerin sayısı (koloniler genellikle manipüle daha küçüktür) oldukça küçük olduğu için, tek bir sürekli çizgi izole edilmiş koloniler neden olur.
    11. Farzedilen diğer uyarım organizmalar ile bu işlemi tekrarlayın.
    12. 24 ° C (ya da tahlilin sıcaklığı) ile inkübe edin.

    10. Streak Putatif Endükleyen Organizmalar Isolated Tek koloniler elde etmek

    1. Bir Stereoskop kullanarak belirlemek - koloni yapısı veya morfolojiye göre - sizin farazi aldı ind her birinde bulunan farklı koloni türleri vardır olmadığınıorganizmaların ucing.
      1. Eğer potansiyel koloni farklılıkları tespit etmek için yukarıda yanı sıra alttan hem kolonileri aydınlatmak bir sahne kullanarak kolonileri bak.
    2. Taze bir plaka üzerine her biri farklı Morfotip Restreak ve büyüyene kadar kuluçkaya yatmaktadır.
    3. Bir kez daha Restreak ve büyümesine izin. Farklı morfotipler devam ederse, saflığa restreak devam ediyor.

    11. İkincil Ekranında Putatif Endükleyen Organizmalar sınayın

    1. Floresan transkripsiyonel muhabiri aktive olduğunu belirlemek için bir ikincil ekranda varsayılan uyaran organizmaların tüm sınayın. İkincil ekran varsayımsal uyarılması organizmalar yamalı veya tespit edilir, üzerine kontrol plakaları ile birlikte flüoresan raportör transkripsiyon suşunun mikrokoloniler bir çim, oluşur.
    2. Aynı konsantrasyonu da flüoresan raportör transkripsiyon gerginlik bir microcolony çim içeren (bir: da üç aynı plakaları ayarlamas) kokültürü tarama sırasında kullanılan ve hiç çim ihtiva eden bir, bir a microcolony bir floresan haberci olmadan vahşi tip ana suşu çim ihtiva etmektedir.
      1. Plaka yönünü belirlemek için her plakanın arka kısmının üst işaretleyin.
      2. Yamalar / noktalar için pozisyonel işaretçileri ekleyin; kadar on farazi uyaran organizmalar plakalarının her set (Şekil 3) üzerinde test edilebilir.
      3. Çözülme çim tümbölenler adım 5.1 olarak (muhabir ve nonfluorescent ana soy).
      4. Adım 6.4 'te olduğu gibi steril boncuklar kullanılarak çim plakaları (veya başka bir duruma seyreltiler) üzerine bir 5 x 10 5 hücre / ml dilüsyon 50 ul yayıldı.
      5. Plakalar kuru olsun.
    3. Patch ya da farazi organizmalar uyaran nokta:
      1. Bir daha kolay ve hızlı bir yaklaşım isteniyorsa yama seçin ve biriken hücre, daha az hassas bir sayı olması kabul edilebilir. Yama:
        1. Test koloni steril bir kürdan dokunun - tüm hücreleri almak etmeyin.
        2. Boş tabağa Patch (küçük bir çizgi olun).
        3. Muhabir levha üzerine taze kürdan ile yama tekrarlayın.
        4. Kontrol levha üzerine taze kürdan ile yama tekrarlayın.
      2. Nicel ve tekrarlanabilir bir yaklaşım isteniyorsa lekelenme seçin. Lekelenme biriken hücrelerin sayısı (tüm ayrıntılar için referans 5 e bakınız) normalize edilmesi sağlar ve karşılaştırılabilir, farklı uyarım organizmaların göreli gücünü verir. Nokta:
        1. Süspanse farazi bir steril plastik küvet içinde sıvı ortam içinde 1 ml organizmaların temin edilmesi.
        2. OD resuspensions 600 atın.
        3. Formülü X = 250 ÷ (OD 600-0,5) kullanarak, bir 600 OD 0.5 olan bir çözelti elde etmek için sıvı ortam içinde 500 ul her bir yeniden süspanse edilmesi için ses X ekleyin. Eğer aynı hacimde (50 kullanabilirsiniz, çünkü OD adlı normalleştirmek için birden dilüsyonlarını yaparken bu yöntem, gerekli pipetleme adımları kolaylaştırırLütfen sulandırıcı tümü için 0 ul).
        4. Üç plakalarının her biri için her bir OD normalleştirilmiş tabanda Noktası 1 ul.
    4. 24-28 saat (ya da raportör / deneyi için uygun olan) boyunca 24 ° C 'de büyümesine izin.
    5. Floresan muhabiri suşu ancak ebeveyn kontrol suşu etkinleştirmek farazi uyaran organizmaları tanımlamak için floresan mikroskop kullanın. Bu izolatlar pozitif isabet vardır - sizin ilgi fenotipi teşvik bileşikler salgılar çevre mikroplar.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Bu ekran B. fizyolojisini değiştirebilir bileşikleri salgılayan toprak organizmaları tanımlamak için kullanılan subtilis. Burada açıklanan sonuçlar B matrisi üreten hücre tipi odak Bu bakteri sağlam biyofilm oluşumu için gerekli olan protein ve eksopolisakarid üreten subtilis. Biz floresan raportör yapı (P Tapa-YFP) için Tapa-sipW-TASA operonunun destekleyicisi seçilmiş. Bu operon matrisin protein yapı bileşeni kodlar ve biyofilm matris 23 üretimi sırasında yukarı düzenlenen. Bizim matris muhabir (Şekil 1), daha önce 19 açıklandığı gibi inşa edilmiştir.

    Önceki çalışmaları göstermiştir ki B. subtilis kendi ürettiği çoğunluk algılama-benzeri molekül surfactin, hem de diğer toprak bakterileri tarafından üretilen arıtılmış, 20 metabolitlere karşılık olarak matrisi üretir. Biz genişleyen ilgilenmişlerdirToprak mikroplar B. matriks üretimini artırdığını metabolitleri yetenekli yapmak hangi daha geniş araştırılması se çalışmalar subtilis. Biz haberci soyu nonfluorescent bir büyüme durumu bize sağlayan, bu orta zaten zayıf matriks üretimi 20 yol açtığı bilinmektedir beri, büyüme için seyreltik LB kullanmak için seçildi. Daha sonra bu, büyüme koşulları altında, tarama için uygun koloni sayısını optimize edilmiştir. Her ekran plaka optimize etmek amacıyla, donmuş toprak ve muhabiri alikotlarından büyümek kaç koloni belirlemek için gerekli ve koloniler ve besin koşulları uygun konsantrasyonu ne vardır. Ve yakından, bireysel koloniler aralıklı olmak: İdeal her kokültürü plaka toprak ve raportör koloniler eşit sayıda (toprak muhabiri yani 1:1 oranı) içeren istiyorum. Muhabir kolonilerin Bu yüksek oran, bir indükleyici birden çevreleyen muhabiri kolonileri aktive olacağı olasılığını artırır. Birden çok ac olmasıGerçek neden olan organizmaya (Şekil 2) saptayarak bir varsayımsal koloni uyarıcı artar güven çevreleyen çıkartılır indükleyici kolonileri. Inokulum seyreltme elde edilen koloniler, uygun bir şekilde dağılmış olup olmadığını tespit eder ise besin içeriği büyüme / koloni oluşumunun ölçüde kontrol eder. Düşük besin ortamı ile bir standart 10 cm çapında Petri plakası günü, plaka başına yaklaşık 25.000 koloni total (5 x 10 5 hücre / ml dilüsyon 50 ul) B. en iyi ve en ayrılmasını temin bulundu 0.1x LB MOPS orta (Şekil 4) subtilis koloniler.

    Seri seyreltiler gelen hesaplanan cfu / ml alikotlar içinde bakteri konsantrasyonu yaklaşık sağlasa da, bir bütün plaka hücreleri ile yayılır, sonuçtaki koloniler konsantrasyonu uygun olduğundan emin olmak için gereklidir. Hesaplanan kob / plakası ve gerçek kob / plaka her zaman aynı değildir (Şekil 4

    Muhabir ve toprağın alikotları hazırlanması sonra, kokültürü ekran tabakalarına bunları karıştırıldı ve bir Stereoskop (Şekil 5) kullanılarak floresan için onları incelenmiştir. Ayrıca, sadece toprak ya da B ya da ile aşılanmıştır kontrol kaplama subtilis P tapa-YFP muhabiri suşu. B. subtilis Şekil 5'de kokültürü görüntüdeki floresan koloni tarafından görüldüğü gibi topraktan çok sayıda mikroplara karşı biyofilm matris (floresans) üretir. İncelediğimiz topraklar için, biz P tapa-YFP muhabir için yüksek bir isabet oranları vardı. (Altı farklı toprak örneklerinden) izolatların% 12-67 arasında referans 5, tarif edildiği gibi indu yeteneğine sahipP tapa-YFP muhabiri suşu ce floresan. Bu sporulasyonunu (P SSPB-YFP) ve yetkinlik (P comG-YFP) muhabirleri kullanarak benzer ekranlarından yayınlanmamış sonuçlar tersidir. Hiçbiri bu yetkinlik neden tespit ederken geniş taraması (her muhabir için> 200.000 koloniler) sonra, sadece iki organizma, bu sporulasyonunu neden tespit edilmiştir. Bu nedenle, farklı hücre tipleri için isabet oranları oldukça değişken olabilir ve önceden tahmin etmek zor olabilir.

    Biz daha sonra tek tek farazi oluşturmama koloniler aldı. Düşük besin ortamı biz (milimetreden çapı) tavsiye kokültürü ekran plakalar üzerinde koloniler oldukça küçük. Bununla birlikte, doğru bir şekilde karmaşık bir kokültürü ekran plaka içinde (Şekil 6) almak ve elle çok küçük koloniler izole etmek mümkündür. Kullandığımız manuel yöntem basittir ve özel araçlar ne de gerektirir alev sterilizasyon. Bu farazi indükleyici kolonileri daha sonra izolasyon restruck edilir. Kokültürü plakalar kolonileri ile kalabalık olduğundan, bu olağandışı değil - her farazi indükleyicisidir örnekten büyüyen birden fazla organizma var - hatta çok dikkatli toplama tekniği ile. Dikkatli muayene morfolojik farklı kolonilerin izolasyonuna izin vermelidir. Tüm farazi uyaran canlı sonra ikinci bir ekran olarak test edilir. Yama ve nokta yöntemi hem de pozitif ve negatif sonuçlar Şekil 3'te gösterilmiştir. Onların yoğun büyüme, fiziksel olarak bizim ikincil ekran gerçek pozitif olmanın incelenen kolonilerin yaklaşık% 50 ile oldukça iyi kokültürü plakaları koloniler edildi uyaran toplamak bizim yeteneği göz önüne alındığında. Ek Bu ekranda sonuçlarının yanı sıra ondan çıkan takip çalışmaları olmuştur, daha önce 5 nitelendirdi.

    / Ftp_upload/50863/50863fig1.jpg "/>
    Şekil 1. Floresan transkripsiyonel raportör yapı. Mavi oval bir bakteri hücresini temsil eder ve kesikli çizgi onun kromozomunu temsil eder. Bu örnek, matris içinde üretimi için bir flüoresan raportör transkripsiyon gösterir. Muhabir yapı (P matrix-YFP) nötr bir lokusunda kromozomda başka takıldığında ise yerli lokusu, ("P" ve ok promotör bölgesini gösteren P matris-matris) bozulmadan kalır.

    Şekil 2,
    Şekil 2. Çevresel mikropların: muhabiri farklı oranlarda kokültürü tarama sonuçları idealize örnekleri. A) düşük bir muhabir kullanma: çevre mikrop oranı daha farazi uyaran organizmaların belirlenmesinde daha fazla belirsizliğe yol açtığında B) Yüksek bir muhabir: çevre mikrop oranı kullanılır. Kahverengi çevreler kırmızı daireler mavi daireler indüklenmemiş raportör koloniyi temsil, uyaran toprak organizmaları temsil, toprak organizmaları temsil ve yeşil koloniler uyarılmış raportör koloniler temsil eder. Kesik kırmızı çizgiler uyaran metabolitin eylem yarıçapını gösterir. Floresan koloniler kendi yakınlığı göre - - farazi uyaran organizmalar ve aldı ve ikincil ekranda yeniden test edilmelidir Yıldız nonfluorescent kolonileri göstermektedir.

    Şekil 3,
    Şekil 3,. İkincil ekranı. Yamalı veya lekeli B., sırasıyla, ikincil ekran plakalar üzerinde izolatlarının dağıtmak için nasıl A ve B) Şeması subtilis matris muhabir. Daha cömert aralık diğer gazetecilere ya da uyaran izolatlar, dep için gerekli olabilirB uyarılması için sırasıyla negatif ve pozitif olan yamalı topraktan. C ve D) Örnek sonucu izole aktif metabolitlerinin yayınabilirliğinden sona eren subtilis P Tapa-YFP-muhabiri. Üst paneller aydınlık görüntüler, alt paneller floresan görüntüleri vardır. Ölçek bar 1 mm. E) Negatif ve benekli topraktan olumlu sonuçlar aynı muhabir için ayırır. Ölçek çubuğu 2 mm.

    Şekil 4,
    Şekil 4. Microcolony konsantrasyonunun belirlenmesi. Da kolonilerin dağılımı ve büyüklüğü besin ve hücre konsantrasyonları üzerindeki iki bağlıdır B. büyümesinde. A) farklar 0.08x LB (alt sıra) karşı 0.01x LB (üst satır) subtilis. 0.01x LB Hücreler, mikrokoloniler içine formu yok iken t0.08x LB hortum yapmak. (Bizim ekranlar için biz burada gösterilenlerden biraz besin düzeyleri artmıştır Not:. 0.08x LB 0.1x LB) Bu görüntüler bilinen kob / ml 'de ardışık 01:05 dilüsyonlarının 1 ul noktalar vardır. 3.200.000, 640.000 ve plaka başına 128.000 kob toplam: 10 cm Petri plaka üzerinde kolonilerin benzer dağılım elde etmek için, bu konsantrasyonlarda extrapolating kaplama (soldan) gerektirir. Bununla birlikte, eşit olmayan hücre dağılımı (bunlar nokta kenarlarında konsantre edilir) olarak tespit sonuçları, tüm plaka üzerinde hücrelerin yayılması ile karşılaştırıldığında. Bir besin konsantrasyonu seçilir kez Böylece, bu konsantrasyonlarda çeşitli yayılan plakalar incelenmesi önemlidir. . Scale bar) B 0.1 mm Bu paneller) soldan (50000 yayılma sonuçlarını gösterir; 25,000 ve 0.08x LB plakaları plaka başına 5,000 toplam CFU. Bu görüntülerin, biz cfu / plaka hedef sayısı olarak 25,000 seçilmiş. Ölçek çubuğu 0.1 mm.


    Şekil 5,. B. Coculture subtilis P tapa-YFP Topraktaki organizmalar ile karışık B'yi içeren bir kokültürü ekran plakadan aydınlık ve floresan görüntü. Yerleşimi Topraktaki organizmalar ile karışık subtilis P Tapa-YFP matris muhabiri. Ok floresan haberci mikrokoloniler çevrili farazi indükleyici gösterir. Ölçek çubuğu 1 mm.

    Şekil 6,
    Şekil 6,. Kokültürü plakalardan minik bakteri kolonileri izole fizibilite gösterilmesi. A ve B) Bu paneller topraktan karmaşık mikrobiyal toplulukları ihtiva eden agar plakaları bakış iki alanı gösterir. 0.1 mm kadar küçük koloniler açıklanan çekme tekniği kullanılarak izole edilebilirburada. Koloni toplama ve alt panel koloni toplama sonra görüş aynı alanları önce üst paneller görüş alanı vardır. Hücreler kaldırılmış yerde kırmızı bir ok ucu göstermektedir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Bu protokolün doğal sınırlamalar biri mikrobik organizmaların cultivability dayanıyor olmasıdır. De 24 belgelenmiştir gibi, gezegendeki en mikrobiyal yaşam (henüz) bugüne kadar araştırdı kültür koşullarında yetiştirilen olamaz. Böylece, doğal ortamlarında meydana gelen mikrobiyal türler arasındaki etkileşimleri çok sayıda bu yaklaşımı kullanarak tespit edilmeden gidecek. Arzumuz bu tür etkileşimlerin varlığını belirlemek, ama sonra da onlara aracılık eden mekanizmaları ve molekülleri çalışma değil sadece Ancak, bu mikropların yetiştirmek için yeteneği bir zorunluluktur. Hatta ekilebilir türler içinde, bu alanda kötü bir yaklaşım burada mikroplar arasında kimyasal olarak aracılık etkileşimleri belirlemek için bir yöntem olarak değerli bir katkı anlatıldığı yapım, araştırılmaktadır. Bu protokol, Bacillus subtilis, matrix-indüksiyonu taranması için optimize edilmiş olmasına rağmen, ayrıca, bu teorik olarak uygulanabilirHerhangi bir diğer bakteri türlerinde y transkripsiyonel flüoresan raportör.

    Bu yaklaşımın bir başka ilgili sınırlama (tanım olarak) bu ekran Coculture gerektirir. Farklı çevre niş istismar ederken, doğal ortamlarında, farklı büyüme oranları ile mikroplar hala mekansal yakınlığı bir arada bulunabilir. Bu tür mikrobiyal etkileşimler sadece besin gereksinimleri ve muhabir türlerin benzer büyüme oranları ile çevre mikropların büyümesini sağlayacak, ancak, bizim kokültürü ekranda tarafından tespit edilmeden gitmek istiyorum. Raportör suşunun büyüme potansiyel indükleyici organizmaların büyümesini ayrı olacaktır modifikasyonlar kesinlikle mümkündür. Toprakta yaygın - - ko-kültür ekranında zorluklara neden olabilir Ayrıca, mantarların hipal büyüme beklenmektedir. Iken B. ile ekranın kısa zaman ölçeği subtilis büyüme ortamına antifungal bileşikler ekleme az mantar tespit anlamına gelmektedir olabilir mBu endişe asgariye indirgenmesi.

    Flüoresan raportör yapısı için uygun bir fenotip ve gen seçme kabiliyeti, sıralama ve transkripsiyonel veri bir çok bakteri türleri için zaten mevcut veya kolayca elde edilebilen ya da zenginliği dikkate alınarak, zor olmamalıdır. Ancak, burada tarif edilen yaklaşım ile bir zorluk floresan indüksiyon saptanmasını sağlayan, raportör soyun floresan arka plan en aza indirmek büyüme koşullarını tanımlamak için ihtiyaç vardır. Transkripsiyonel verileri bu arama (örneğin B. subtilis büyümesi için mevcut olan döşeme mikroarray veri ilgi duyulan genler kötü 10 olarak ifade edilmiştir koşullarının tanımlanmasına izin verir) yardımcı olabilir, ancak bu koşulların belirlenmesi çoğu zaman, ampirik olarak yapılmalıdır. Birçok bakteri fenotipleri ifadesi heterojen olduğu için bazı muhabirler için bu ampirik arama bölümünde, zor olabilir. Diğer bir deyişle, bu c bulmak için nadirşartlarından nüfus içinde herhangi bir hücre alt-nüfuzu ve bu gen ekspresyonunun gücü içindeki hücrelerin sayısına bağlı olarak, Bu durumda Fenotipi X ifade edildiği, bu indüksiyon tespit izin vermek için yeterince düşük arka plan floresanı sağlamaktadır koşullarını tespit etmek zor olabilir . Ideal tarama koşulları için bu ampirik aramaya alternatif "geçimsiz" yönlendirilmiş muta kullanarak muhabiri ifade seviyeleri olabilir. Promotör bölgesini ve / veya raportör konstruktunun ribozomal bağlanma yeri değiştirerek, arka plan floresan seviyeleri azaltılabilir. Bu, bazı yapıcı aktivasyonuna bile genler indüksiyon için muayene izin vererek bu ekranın yararlılığını genişletmek olabilir.

    Bir kez uyarılması organizmaların tespit ve ikinci bir ekran da teyit edilmiş olup, bunlar filogenetik kendi 16S rRNA geninin dizilimi tarafından tespit edilebilir. Bu floresan boyutunu ölçmek de mümkündürCence ikincil ekranda 5 OD 600-normalize nokta kullanarak. Bu topluluğun üyesi muhabiri gerginlik etkileyecek ve ne ölçüde bileşikler üretmek hangi hakkında bilgi verebilir. Sonuç olarak, bu etkileşim, doğal mikrobiyal ayarlar ve bu üretim ve yanıt organizmaların potansiyel Birlikte evrimin varlığını araştırmak için yeteneği meydana olabilir hangi hipotezlerin yol açabilir. Diğer gelecek tarifi, salgılanmış molekülün kendisinin yapısını ortaya koyan yanıt organizma bu bileşiğin algılar hangi mekanizma (lar) belirlemek, ve bakteriyel fenotipleri modüle edilmesi için bir kimyasal araç olarak kullanmayı içerir.

    Yukarıda belirtilen hususlar olsa bile, burada açıklanan yöntem, önemli bir katkıdır. Bu çevresel mikropların bir kütüphane montaj dahil emek önler, ancak katı ortamı kullanarak fiziksel ayırma ve izolasyon sağlar. Bu kokültürü ekranın gücü olduğunubirçok bakteri türleri ve fenotipleri için geçerli olurken ilgi biyolojik olarak aktif bileşiklerin salgılar olanlar belirlemek için mikrop türleri binlerce taranması için bir kavramsal ve teknik olarak basit bir yöntem sağlar.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

    Acknowledgements

    Yazar sayesinde, onun değerli tavsiye ve bu kokültürü ekranın geliştirilmesi sırasında yardım için Roberto Kolter (Harvard Medical School). O Şekil 6 elde yardım için de netlik için el yazması okuma teşekkür Matthew Powers, Chia-yi Cheng.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Spectrophotometer Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
    Luria broth, Lennox VWR 80017-484 Alternative media sources may be necessary.
    Glass beads, 3 mm VWR 26396-508
    Gel loading tips, round VWR 29442-666
    Glass rods VWR 59060-069
    Fluorescence dissecting stereoscope Zeiss N/A The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.

    References

    1. Berdy, J. Bioactive microbial metabolites. J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).
    2. Lopez, D., Vlamakis, H., & Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).
    3. Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., & Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
    4. Branda, S.S., Gonzalez-Pastor, J.E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., & Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
    5. Shank, E.A., et al. Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, E1236-1243 (2011).
    6. Piston, D.W., Patterson, G.H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N.S., & Davidson, M.W. Introduction to Fluorescent Proteins. (2013).
    7. Chudakov, D.M., Matz, M.V., Lukyanov, S., & Lukyanov, K.A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).
    8. Shaner, N.C., Patterson, G.H., & Davidson, M.W. Advances in fluorescent protein technology. J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
    9. Shaner, N.C., Steinbach, P.A., & Tsien, R.Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).
    10. Nicolas, P., et al. Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis. Science. 335, 1103-1106 (2012).
    11. Middleton, R. & Hofmeister, A. New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis. Plasmid. 51, 238-245 (2004).
    12. Shimotsu, H. & Henner, D.J. Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis. Gene. 43, 85-94 (1986).
    13. Guerout-Fleury, A.M., Frandsen, N., & Stragier, P. Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis. Gene. 180, 57-61 (1996).
    14. Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., & Papp, P.P. Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera. J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).
    15. Charpentier, E., et al. Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).
    16. Yang, H.Y., Kim, Y.W., & Chang, H.I. Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1. J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).
    17. Choi, K.H. & Schweizer, H.P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).
    18. Craig, N.L. Tn7: a target site-specific transposon. Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).
    19. Garcia-Betancur, J.C., Yepes, A., Schneider, J., & Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796, doi:10.3791/3796 (2012).
    20. Lopez, D., Fischbach, M.A., Chu, F., Losick, R., & Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
    21. Vartoukian, S.R., Palmer, R.M., & Wade, W.G. Strategies for culture of 'unculturable' bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).
    22. Romano, J.D. & Kolter, R. Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival. J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).
    23. Branda, S.S., Chu, F., Kearns, D.B., Losick, R., & Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
    24. Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter