في وقت واحد متعدد الألوان التصوير من الهياكل البيولوجية مع الإسفار تنشيط ضوئي توطين المجهر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير أنواع متعددة من البروتينات في آن واحد وبدقة نانومترية في الخلايا المثبتة أو الحية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال ضبط موضع الكاميرا والبصريات حتى يتم إسقاط صورة مركزة من المجهر على شريحة الكاميرا. وتتمثل الخطوة الثانية في ترتيب حزم الليزر بحيث تكون محاذية مباشرة للعينة الموجودة على منصة المجهر.

بعد ذلك، يتم إضاءة عينة الخلايا المُحضرة واختيار خلية تعبر عن البروتينات المطلوبة. وتتمثل الخطوة النهائية في تصوير الخلية باستخدام مجهر تحديد الموقع بالتنشيط الضوئي الفلوري عن طريق إضاءة العينة بأشعة الليزر، ثم توجيه الفلورة الخلوية إلى شريحة الكاميرا للحصول على مجموعة بيانات. وفي النهاية، يُستخدم مجهر تحديد الموقع بالتنشيط الضوئي الفلوري لإظهار تموضع أنواع متعددة من البروتينات على المقياس المكاني للنانومتر في الخلايا المثبتة أو الحية، وسواء في المجال الواسع أو عند استخدام فلورة الانعكاس الداخلي الكلي لعزل منطقة رقيقة من العينة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المجهر البؤري (confocal) أو المجهر الإلكتروني، في إمكانية تصوير بروتينات متعددة في آن واحد بدقة نانومترية في الخلايا المثبتة أو الحية. تشير الخطوات التالية إلى نظام ترقيم كما هو موضح هنا، والذي يمثل مخططاً لإعداد F Om متعدد الألوان الوارد كشكل رقم واحد في البروتوكول النصي المرفق. لمحاذاة المجهر، ابدأ بوضع مقياس معايرة أو علامة شعاعية على منصة المجهر مع وضع عدسة شيئية 10x وضبط المصباح على الضوء النافذ. قم بتوسيط الخط الرأسي في مركز مجال الرؤية.

بعد ذلك، قم بضبط المجهر للحصول على إضاءة متمركزة عن طريق إغلاق فتحة الحقل والنظر عبر العينات العينية إلى العمود الرأسي. إذا كانت حواف فتحة الحقل خارج نطاق التركيز، فقم بضبط ارتفاع المكثف حتى يصبح كل من فتحة الحقل والمسطرة في نطاق التركيز. ثم اضبط الموضع الجانبي لفتحة الحقل حتى تتمركز بالنسبة لمجال الرؤية، وأغلق فتحة الحقل حتى تضاء الشبكة المركزية الموجودة على المسطرة فقط.

عند تجميع هذه المكونات للمرة الأولى، قم بضبط أطوال المسارات لكل قناة لتكون متساوية. ولإنجاز هذا المشروع، قم بضبط المرآتين السابعة والتاسعة على شريحة الكاميرا وأغلق فتحة الكشف لمنع التداخل المكاني بين القناتين. بعد ذلك، قم بتركيز صورة الجذر في قناة الضوء المنعكس وتحقق مما إذا كانت مركزة أيضاً في قناة الضوء النافذ.

إذا لم تكن الصورة في قناة الضوء النافذ مضبوطة البؤرة، فقم بتحريك المرآة تسعة حتى تصبح صورة الجذر مضبوطة البؤرة في كلتا القناتين في وقت واحد. ابدأ بمحاذاة الليزرات عن طريق إزالة العدسة واحد من مسار الليزر وحجب حزم التنشيط والقراءة. بعد ذلك، ضع بطاقة بيضاء بشكل ملاصق للمرآة أربعة، وافتح غالق المجهر واضبط البؤرة حتى تسقط صورة الجذر على البطاقة الموجودة أمام المرآة أربعة.

بعد ذلك، قم بإزالة الحجب عن شعاع القراءة واضبط المرآة الأولى لتوسيط ليزر القراءة على خطوط التقاطع لصورة الجذر في المرآة الرابعة. وبمجرد التوسيط، قم بإسقاط صورة الجذر على المرآة الخامسة واضبط المرآة الرابعة حتى يصبح الشعاع متمركزاً على خطوط تقاطع الصورة في المرآة الخامسة. يجب أن يكون شعاع القراءة الآن متمركزاً عند كل من M four و M five.

بعد ذلك، قم بحجب شعاع القراءة عن طريق إغلاق الغالق الأول. ثم، قم بإسقاط الصورة الجذرية على المرآة الثالثة. قم بإزالة موسع الشعاع من مسار الليزر وفك حجب ليزر التنشيط.

الآن، قم بضبط المرآة الثانية لتركيز شعاع التنشيط على خطوط التقاطع لصورة الجذر الموجودة على المرآة الثالثة. وبمجردما يتم التمركز، استبدل موسع الشعاع بين المرآتين الثانية والثالثة واضبط موضع موسع الشعاع حتى يتمركز الشعاع على خطوط التقاطع لصورة الجذر. على المرآة الثالثة، قم بإسقاط صورة الجذر على المرآة الخامسة ثم اضبط التركيز.

باستخدام مقبض التركيز الخاص بالمجهر، اضبط زاوية المرآة ثنائية اللون رقم واحد حتى يتم تمركز شعاع التنشيط على الصورة الحمراء. بعد ذلك، قم بحجب ليزر التنشيط عن طريق إغلاق الغالق رقم اثنين مع التأكد من عدم وجود عدسة شيئية في مكانها وبقاء غالق المجهر مفتوحاً. افتح غالق القراءة رقم واحد وقم بإسقاط الليزر عبر الفتحة الخلفية للمجهر.

اضبط المرآة الخامسة حتى يخرج الشعاع من المجهر، بحيث يخرج الشعاع من المجهر عمودياً مع إعادة العدسة الأولى والشيئية إلى مكانهما. ضع عينة تحتوي على 100 micromolar من bromine B على المنصة مع حجب ليزر التنشيط. سدد ليزر القراءة عبر شيئية 60 x إلى داخل الصبغة.

مع تعطيل كسب مضاعفة الإلكترونات. أرسل هذه الصورة إلى الكاميرا. بعد ذلك، قم بضبط بؤرة العدسة الشيئية على العينة.

افتح الفتحة بشكل كافٍ للسماح بتصوير المقطع العرضي الكامل للحزمة. ثم حرك الفتحة جانبياً بحيث يصبح مركز المقطع العرضي للحزمة والفتحة متمركزين. باستخدام برنامج الكاميرا، اختر المنطقة ذات الأهمية للسماح بأصغر منطقة قراءة للكاميرا تشمل القناتين، ثم سجل هذه الإحداثيات.

في هذه المرحلة، سجل لقطة واحدة لتمثيل ملف شعاع القراءة. بعد ذلك، احجب ليزر القراءة عن طريق إغلاق الغالق الأول وفتح الغالق الثاني. لبدء قياس ملف شعاع التنشيط، قم بتسليط ليزر التنشيط على العينة، وإذا لزم الأمر، استخدم كسب مضاعف للإلكترونات أقل من 100 وقم بضبط المرآة ثنائية اللون الأولى حتى يتمركز الشعاع في كل مجال رؤية.

ثم قم بتسجيل لقطة لملف شعاع التنشيط من أجل البدء في الحصول على صور F palm متعددة الألوان. قم بإزالة جميع إضاءات الغرفة. ثم وجه مصباح الزئبق عبر حامل القلاب على الخلايا المنقولة وقم بتغيير مكعب المرشح إلى المكعب الذي يحتوي على طول الموجة المثير المناسب لحالة ما قبل التبديل الضوئي.

بمجرد اختيار الخلية، قم بخفض حامل القلابة للسماح لليزرات بالمرور إلى المجهر، وقم بتغيير البرج المرشح إلى الذي يحتوي على المرآة ثنائية اللون المناسبة للتصوير كما هو موضح في البروتوكول النصي المصاحب. ثم قم بإسقاط هذه الصورة على الكاميرا لتمييز الخلايا المتحولة عن الفلورة الخلفية وللتأكد من أن الجزيئات قابلة للتنشيط الضوئي. قم بإضاءة العينة لفترة وجيزة بقدرة منخفضة تقل عن 10 µW من ليزر التنشيط.

بعد ذلك، قم بتهيئة برنامج الكاميرا لالتقاط سلسلة حركية من خلال ضبط كسب مضاعف الإلكترونات على 200 وتحديد عدد الإطارات المطلوب بين 5 و 10,000 إطار. كما يتم ضبط التعريض الضوئي ليكون بين 10 و 30 ميلي ثانية. ثم قم بحجب شعاع التنشيط، وإزالة الحجب عن شعاع القراءة، وإسقاط صورة الخلية المضاءة على الكاميرا.

اختر مستوى بؤرياً بالقرب من الغشاء الخلوي السفلي عن طريق تحريك التركيز للأسفل حتى لا تعود الجزيئات الفردية مرئية. ثم حرك التركيز تدريجياً للأعلى حتى تبدأ الجزيئات في الظهور لأول مرة. والآن، قم بإلغاء حجب شعاع التنشيط وأضئ العينة بكثافة أقل من 1 watt/cm².

ابدأ في الحصول على هذه البيانات من خلال برنامج الكاميرا مع الحفاظ على كثافة تتراوح من 0.1 إلى جزيء واحد مرئي قابل للتصوير لكل ميكرون مربع، وذلك عن طريق الضبط الديناميكي لمرشح الكثافة المحايدة الموجود أمام ليزر التنشيط. وبالنسبة لتصوير الفلورة بالانعكاس الداخلي الكلي، قم بتركيب المرآة رقم 5 والعدسة رقم 1 على منصة نقل واحدة ليتم تحريكها جانبياً خلف مدخل المجهر مباشرة. ومع تحريك المرآة رقم 5 والعدسة رقم 1، ستميل أشعة الليزر الخارجة من الشيئية للأعلى عبر العينة تدريجياً إلى أحد الجانبين؛ استمر في تحريك المنصة حتى تصل زاوية أشعة الليزر إلى 90 درجة من الوضع الرأسي.

عند هذه النقطة، سيتلاشى الليزر الناشئ نفسه وسينعكس الليزر الوارد مرة أخرى إلى الفتحة، حيث ينتقل بشكل موازٍ ومعاكس للحزمة الواردة ومزاحاً إلى الجانب. يجب أن تلاحظ انخفاضاً في الخلفية عندما تدخل العينة في حالة الفلورة بالانعكاس الداخلي الكلي؛ وعند الانتهاء من عمليات الحصول على الصور، أغلق غالق المجهر فوراً وقم بحجب كلا الشعاعين. قم بتعطيل كسب مضاعف الإلكترونات.

اضبط الكاميرا لتسجيل إطار واحد، واضبط منطقة قراءة الكاميرا على أقصى حجم لها. وأخيراً، قم بحجب قناة واحدة بوضع بطاقة فوق F three أو F four مع تركيب مرشح تمرير طويل على مصباح المجهر. قم بإضاءة العينة وإسقاط هذه الصورة على الكاميرا.

قم بتسجيل لقطة للخلية لتمثيل الخلية بأكملها تحت الضوء النافذ. يظهر هنا مثال لعملية استحواذ F palm بلونين لخلية NIH 3T3 التي تعبر عن كل من DENDRA 2 Hemagglutinin و PAM Cherry actin. تحتوي القناة النافذة على اليسار على أطوال موجية أطول من القناة المنعكسة على اليمين.

تظهر هنا لقطات من عملية استحواذ واحدة بتقنية F OM ثنائية اللون بعد طرح الخلفية والتحويل لدمج القناتين اليسرى واليمنى. يمكن تحديد مواقع الجزيئات الفردية وتمييزها. تظهر بعض الجزيئات بشكل أكثر سطوعاً في قناة النفاذ، بينما يظهر بعضها الآخر توزيعاً أكثر تساوياً للانبعاث بين القناتين.

يشير هذا إلى الاختلاف في أطياف الانبعاث بين PAM cherry و DENDRA two على التوالي، ويُستخدم في التحليل لتمييز هذين النوعين. يوضح المخطط التكراري الموضح هنا نسبة شدة القناة الحمراء المرسلة مقسومة على الشدة الإجمالية لجميع الجزيئات الموضعية بعد تطبيق التفاوتات المسموح بها. تظهر البكسلات باللون الأبيض في الصورة الموجودة أسفل اليسار وتظهر باللون الأحمر في الصورة المدمجة النهائية الموضحة أسفل اليمين، بينما تظهر البكسلات في المنطقة الخضراء باللون الأبيض في الصورة الموجودة أعلى اليمين وتظهر باللون الأخضر في الصورة المدمجة النهائية الموضحة أسفل اليمين.

تؤثر مستويات العتبة التي يتم اختيارها عند التصيير بشكل كبير على درجة الضجيج ومظهر التوضع المشترك. تظهر هنا ثلاثة خيارات مختلفة للتصيير تؤدي إلى درجات متفاوتة من النزيف اللوني، حيث تظهر مستويات العتبة الأكثر تحفظاً في الصورتين السفليتين. ويكون تفسير الرسوم البيانية لـ Color F palm alpha في أفضل حالاته عندما تكون هناك ذروتان متميزتان في الصورة.

بينما يُعد المدرج التكراري الموجود على اليسار مرشحاً جيداً لإجراء المزيد من التحليل، فإن الصور الناتجة عن المدرجين التكراريين الآخرين ستكون أصعب بكثير في التفسير عند اتباع هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق مثل مجهر الانعكاس الداخلي الكلي وتصوير الخلايا الحية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية تنظيم البروتينات على مقياس النانو في أغشية الخلايا الحية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مجهر FAR الخاص بك واستخدامه في الحصول على البيانات.

لا تنسَ أن العمل مع الليزر يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب إكمال التدريب على السلامة قبل محاولة تنفيذ هذا الإجراء.