في وقت واحد متعدد الألوان التصوير من الهياكل البيولوجية مع الإسفار تنشيط ضوئي توطين المجهر

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير أنواع متعددة من البروتين في وقت واحد بدقة نانومتر في الخلايا الثابتة أو الحية. يتم تحقيق ذلك عن طريق ضبط موضع الكاميرا والبصريات أولا حتى يتم عرض صورة مركزة من المجهر على شريحة الكاميرا. الخطوة الثانية هي ترتيب أشعة الليزر بحيث تتم محاذاتها مباشرة على عينة على مرحلة المجهر.

بعد ذلك ، تضيء عينة الخلية المحضرة وتختار خلية تعبر عن البروتينات المطلوبة. تتمثل الخطوة الأخيرة في تصوير الخلية باستخدام الفحص المجهري لتوطين تنشيط الصور الفلورية عن طريق إضاءة العينة بالليزر ، ثم توجيه مضان الخلية إلى شريحة الكاميرا للحصول على مجموعة بيانات. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري لتوطين التنشيط الضوئي الفلوري لإظهار توطين أنواع البروتين المتعددة على النطاق المكاني النانومتري في الخلايا الثابتة أو الحية وفي أي حقل واسع أو عند استخدام مضان الانعكاس الداخلي الكلي لعزل منطقة رقيقة من العينة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل المجهر متحد البؤر أو الإلكترون ، هي أنه يمكن للمرء تصوير بروتينات متعددة في وقت واحد بدقة نانومتر في الخلايا الثابتة أو الحية. تشير الخطوات التالية إلى نظام الترقيم كما هو موضح هنا ، وهو مخطط لإعداد F Om متعدد الألوان المقدم في الشكل الأول في بروتوكول النص المصاحب لمحاذاة المجهر يبدأ بوضع مقياس معايرة أو جذري على مرحلة المجهر مع هدف 10 × في مكانه وضبط المصباح للضوء المنقول. قم بتوسيط العمودي في وسط مجال الرؤية.

بعد ذلك ، اضبط المجهر للإضاءة القسرية عن طريق إغلاق فتحة المجال والنظر من خلال العين في الوضع الرأسي. إذا كانت حواف فتحة المجال خارج نطاق التركيز البؤري، فاضبط ارتفاع المكثف حتى يصبح كل من فتحة المجال واللون الأحمر في نطاق التركيز البؤري. ثم اضبط الموضع الجانبي لفتحة الحقل حتى يتم توسيطها فيما يتعلق بمجال الرؤية وأغلق فتحة الحقل حتى تضيء الشبكة المركزية فقط على اللون الأحمر.

في المرة الأولى التي يتم فيها تجميع هذه المكونات ، اضبط أطوال مسار كل قناة لتكون متساوية. لإنجاز هذا المشروع ، يقوم اللون الأحمر الموجود على شريحة الكاميرا بضبط المرايا السابعة والتسعة وإغلاق فتحة الكشف لمنع التداخل المكاني بين القناتين. ثم ركز صورة الجذر في قناة الضوء المنعكسة وتحقق لمعرفة ما إذا كانت أيضا في بؤرة التركيز في قناة الضوء المرسلة.

إذا لم تكن الصورة في قناة الضوء المرسلة في بؤرة التركيز البؤري ، فقم بترجمة المرآة التسعة حتى يتم التركيز على الصورة الجذرية في وقت واحد في كلتا القناتين. ابدأ في محاذاة الليزر عن طريق إزالة العدسة الأولى من مسار الليزر وحجب حزم التنشيط والقراءة. ثم ضع بطاقة بيضاء متدفقة على المرآة الرابعة ، وافتح غالق المجهر وركز حتى تظهر الصورة الجذرية على البطاقة أمام المرآة الرابعة.

بعد ذلك ، قم بإلغاء حظر شعاع القراءة واضبط المرآة الأولى لتوسيط ليزر القراءة على الشعيرات المتقاطعة للصورة الجذرية على المرآة الرابعة. بمجرد التوسيط ، قم بإسقاط الصورة الجذرية على المرآة الخامسة واضبط المرآة الرابعة حتى يتمركز الشعاع على الصورة المتقاطعة للمرآة الخامسة. يجب الآن توسيط حزمة القراءة عند كل من M أربعة و M خمسة.

ثم قم بحظر شعاع القراءة عن طريق إغلاق الغالق الأول. بعد ذلك ، قم بإسقاط الصورة الجذرية على المرآة الثالثة. قم بإزالة موسع الشعاع من مسار الليزر وقم بإلغاء حظر ليزر التنشيط.

الآن اضبط المرآة الثانية لتوسيط شعاع التنشيط على الشعيرات المتقاطعة للصورة الجذرية على المرآة الثالثة. بمجرد التوسيط ، استبدل موسع الشعاع بين المرايا الثانية والثالثة واضبط موضع موسع الشعاع حتى يتمركز الشعاع على الشعيرات المتقاطعة للصورة الجذرية. في المرآة الثالثة ، قم بإسقاط الصورة الجذرية على المرآة الخامسة وركز.

باستخدام مقبض التركيز البؤري في المجهر ، اضبط زاوية المرآة ثنائية اللون رقم واحد حتى تتمركز شعاع التنشيط على الصورة الحمراء. ثم قم بحظر ليزر التنشيط عن طريق إغلاق الغالق الثاني بدون هدف في مكانه وفتح مصراع المجهر. افتح غالق القراءة الأول وقم بعرض الليزر من خلال الفتحة الخلفية للمجهر.

اضبط المرآة الخامسة حتى يخرج الشعاع من المجهر ، بحيث يخرج الشعاع من المجهر عموديا مع العدسة الأولى والهدف مرة أخرى في مكانه. ضع عينة تحتوي على 100 ميكرومولار بروم B على المسرح مع حظر ليزر التنشيط. قم بإسقاط ليزر القراءة من خلال هدف 60 × وفي الصبغة.

كسب ضرب الإلكترون. أرسل هذه الصورة إلى الكاميرا. بعد ذلك ، ركز الهدف في العينة.

افتح فتحة العدسة على نطاق واسع بما يكفي للسماح بتصوير ملف تعريف الحزمة الكاملة. ثم قم بترجمة الفتحة بشكل جانبي بحيث يكون مركز ملف تعريف الشعاع والفتحة متحدي المركز. باستخدام برنامج الكاميرا، اختر منطقة الاهتمام للسماح بأصغر منطقة قراءة للكاميرا تغلف كلتا القناتين وسجل هذه الإحداثيات.

في هذه المرحلة، سجل لقطة واحدة لتمثيل ملف تعريف حزمة القراءة. بعد ذلك ، قم بحظر ليزر القراءة عن طريق إغلاق الغالق الأول وفتح الغالق الثاني. من أجل البدء في قياس ملف تعريف شعاع التنشيط ، قم بعرض ليزر التنشيط على العينة ، إذا لزم الأمر ، استخدم كسب مضاعفة الإلكترون أقل من 100 واضبط أول مرآة ثنائية اللون حتى يتم توسيط الشعاع في كل مجال رؤية.

ثم قم بتسجيل لقطة لملف تعريف شعاع التنشيط من أجل البدء في الحصول على صور كف F متعددة الألوان. تخلص من جميع إضاءة الغرفة. ثم قم بإسقاط المصباح الزئبقي عبر حامل الوجه على الخلايا المنقولة وقم بتغيير مكعب المرشح إلى مكعب يحتوي على الطول الموجي المناسب للإثارة لمفتاح الصورة المسبقة. حالة.

بمجرد اختيار الخلية ، حرك حامل الوجه لأسفل للسماح لليزر بالمرور إلى المجهر ، وقم بتغيير برج المرشح إلى ذلك الذي يحتوي على المرآة ثنائية اللون المناسبة للتصوير كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. ثم قم بعرض هذه الصورة على الكاميرا لتمييز الخلايا المنقولة عن مضان الخلفية وللتأكد من أن الجزيئات قابلة للضوء. قم بإضاءة العينة لفترة وجيزة بطاقة منخفضة أقل من 10 ميكرو واط من ليزر التنشيط.

بعد ذلك ، قم بإعداد برنامج الكاميرا لاكتساب سلسلة حركية عن طريق ضبط لعبة ضرب الإلكترون على 200 والعدد المطلوب من الإطارات بين خمسة و 10 ، 000. اضبط أيضا التعرض على ما بين 10 و 30 مللي ثانية. ثم قم بحظر شعاع التنشيط ، وقم بإلغاء حظر شعاع القراءة ، وعرض صورة الخلية المضيئة على الكاميرا.

اختر مستوى بؤري بالقرب من الغشاء الخلوي السفلي عن طريق تحويل التركيز لأسفل حتى تصبح الجزيئات الفردية غير مرئية. ثم حرك التركيز تدريجيا لأعلى حتى تصبح الجزيئات مرئية لأول مرة. الآن قم بإلغاء حظر شعاع التنشيط وإضاءة العينة بأقل من واط واحد لكل سنتيمتر مربع من الشدة.

ابدأ في الحصول على هذه البيانات من خلال برنامج الكاميرا مع الحفاظ على كثافة 0.1 إلى جزيء مرئي واحد قابل للضوء لكل ميكرون مربع عن طريق ضبط مرشح الكثافة المحايدة أمام ليزر التنشيط ديناميكيا. بالنسبة للانعكاس الداخلي الكلي ، قم بتركيب المرآة الخامسة والعدسة الأولى على مرحلة ترجمة واحدة ليتم نقلها بشكل جانبي خلف مدخل المجهر مباشرة. عندما تتم ترجمة المرآة الخامسة والعدسة الأولى ، فإن الليزر الذي يخرج من الهدف لأعلى من خلال العينة سوف يميل تدريجيا إلى جانب واحد ، ويستمر في ترجمة المرحلة حتى تصل زاوية الليزر إلى 90 درجة من الوضع الرأسي.

في هذه المرحلة ، سيختفي الليزر الناشئ نفسه وسينعكس الليزر الوارد مرة أخرى في الفتحة التي تتحرك بشكل مضاد للحزمة الواردة ونزوحها إلى الجانب. يجب أن تلاحظ انخفاضا في الخلفية عندما تدخل العينة في تألق الانعكاس الداخلي الكلي عند الانتهاء من الحصول على الصورة ، أغلق مصراع المجهر على الفور وقم بحظر كلا الحزمتين. تعطيل كسب مضاعفة الإلكترون.

اضبط الكاميرا لتسجيل إطار واحد واضبط منطقة قراءة الكاميرا على الحد الأقصى لحجمها. أخيرا ، قم بحظر قناة واحدة عن طريق وضع بطاقة فوق F ثلاثة أو F أربعة مع مرشح تمرير طويل مثبت على مصباح المجهر. قم بإضاءة العينة وعرض هذه الصورة على الكاميرا.

سجل لقطة للخلية لتمثيل الخلية بأكملها في الضوء المنقول. يظهر هنا مثال على اكتساب النخيل F بلونين من المعاهد الوطنية للصحة ثلاث خلايا T تعبر عن كل من DENDRA two Hemagglutinin و PAM Cherry actin. تحتوي القناة المرسلة على اليسار على أطوال موجية أطول من القناة المنعكسة على اليمين.

تظهر هنا لقطات من نفس اكتساب F OM بلونين بعد الخلفية والطرح والتحويل لتراكب القناتين اليمنى واليسرى. يمكن تحديد الجزيئات الفردية وتوطينها. تظهر بعض الجزيئات أكثر إشراقا في القناة المرسلة وبعضها له توزيع أكثر توازنا للانبعاث بين القناتين.

يشير هذا إلى الاختلاف في أطياف الانبعاث بين كرز PAM و DENDRA اثنين على التوالي ويستخدم في التحليل لتحديد هذين النوعين. يشير الرسم البياني الموضح هنا إلى نسبة شدة القناة المرسلة باللون الأحمر مقسومة على الكثافة الإجمالية لجميع الجزيئات الموضعية بعد تطبيق التفاوتات. تظهر وحدات البكسل باللون الأبيض في الصورة السفلية اليسرى وتظهر باللون الأحمر في الصورة المدمجة النهائية الموضحة في أسفل اليمين حيث تظهر تلك الموجودة في المنطقة الخضراء باللون الأبيض في الصورة العلوية اليمنى وتظهر باللون الأخضر في الصورة المدمجة النهائية الموضحة في أسفل اليمين.

مستويات العتبة التي يتم اختيارها عند العرض بشكل كبير على درجة الضوضاء ومظهر التحديد المشترك. تفعيلك. فيما يلي ثلاثة خيارات مختلفة للعرض والتي تؤدي إلى درجات متفاوتة من النزيف من خلال مستويات العتبة الأكثر تحفظا في الطابقين السفليين. من الأفضل تفسير الرسوم البيانية لألفا لراحة اليد F عندما تكون هناك قمتان يمكن تمييزهما في الصورة.

في حين أن الرسم البياني الموجود على اليسار هو مرشح جيد لمزيد من التحليل ، فإن الصور الناتجة عن الرسومين التكراريين الآخرين ستكون أكثر صعوبة في التفسير باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق مثل الانعكاس الداخلي الكلي والفحص المجهري وتصوير الخلايا الحية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية تنظيم البروتينات على المستوى النانوي في أغشية الخلايا الحية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مجهر FAR الخاص بك واستخدامه للحصول على البيانات.

لا تنس أن العمل بالليزر يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب إكمال التدريب على السلامة قبل محاولة هذا الإجراء.