التصوير الحي المتزامن للأجنة الحشرية المتعددة في مجاهر فلورسينس ورقة الضوء المستندة إلى غرفة العينة

تصميم مجاهر الفلور ذات الألواح الخفيفة القائمة على غرفة العينة للمحتوى العالي بدلا من الإنتاجية العالية. لذلك يجب إجراء فحوصات التصوير المباشر بالتتابع وبالتالي أقل تأثرا بالتباين المحيط. يسمح حامل نسيج العنكبوت الخاص بنا بالتكديس والتصوير المتزامن لأجنة متعددة ، مما يلغي التباين المحيط ويزيد من الإنتاجية.

تركيب الأجنة في حامل نسيج العنكبوت براعة معينة. يعد الفيديو التوضيحي مثاليا لتوضيح تسلسل العديد من إيماءات السلوك القصير. لمعايرة غرفة العينة القائمة على مجهر مضان الورقة الخفيفة.

أولا ، قم بإعادة تسييل الأغروز في خلاط سخان الكتلة الجافة عند 80 درجة مئوية. اترك الاغاروز المذاب يبرد إلى 35 درجة مئوية وانقل 50 ميكرولترا من الاغاروز إلى أنبوب تفاعل سعة 1.5 ملليلتر. امزج 0.5 ميكرولتر من محلول الكرة المجهرية الفلورية مع الاغاروز بمعدل 1،400 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة ، واملأ الفتحة المشقوقة لحامل نسيج العنكبوت ب 10 ميكرولتر من خليط محلول الكرة المجهرية الفلورية الاغاروز.

استنشق أكبر قدر ممكن من الاغاروز حتى يبقى طبقة رقيقة من الاغاروز واترك الاغاروز يتجمد لمدة 30 إلى 60 ثانية. املأ غرفة العينة بماء الصنبور المعقم ، وأدخل حامل نسيج العنكبوت ببطء في غرفة العينة. حرك الفتحة المشقوقة أمام عدسة الكشف وقم بتدوير الحامل إلى موضع 45 درجة بالنسبة لمحاور الإضاءة والكشف.

يجب ألا يكون حامل نسيج العنكبوت مرئيا في قناة ضوء الإرسال. قم بالتبديل إلى قناة التألق المناسبة واضبط طاقة الليزر ووقت التعرض ، بحيث توفر الكريات المجهرية الفلورية إشارة مناسبة. حدد حجم الرؤية الذي يغطي فيلم الاغاروز ذو الاتجاه العرضي الآن بالكامل واحسب أقصى دقة محورية ممكنة لمجموعة عدسة الإضاءة والكشف المعنية لتحديد تباعد Z.

بعد ذلك ، قم بتسجيل مكدس Z ثلاثي الأبعاد للكريات المجهرية الفلورية وقارن الإسقاطات القصوى X و Y و Z بمخطط المعايرة. إذا بدت الكريات المجهرية ضبابية أو غامضة أو مشوهة. اضبط مواضع عدسات الإضاءة و / أو العدسات الكشف.

لتفكك الأجنة ، أضف ثمانية ملليلتر من ماء الصنبور المعقم في آبار A1 و A2 و A3 و B3 من صفيحة واحدة إلى ستة بئر لكل سطر. ثم أضف سبعة ملليلتر من ماء الصنبور المعقم ومليلتر واحد من محلول هيبوكلوريت الصوديوم في آبار B1 و B2. ضع اللوحة الأولى تحت مجهر استريو وأدخل الجنين الأول الذي يحتوي على مصفاة خلوية في بئر A1.

اغسل الأجنة تحت تحريض لطيف لمدة 30 إلى 60 ثانية ، قبل نقل المصفاة إلى بئر B1. رج الطبق بقوة لمدة 30 ثانية ، قبل نقل المصفاة إلى بئر A2. اغسل الأجنة لمدة دقيقة واحدة تحت التحريك اللطيف وانقل المصفاة إلى بئر B2 للاهتزاز القوي حتى يتم تفكيك معظم الأجنة تماما.

بعد ذلك ، انقل المصفاة إلى بئر A3 لمدة دقيقة واحدة من الغسيل اللطيف ، قبل تخزين مصفاة الأجنة المنكسرة في بئر B3 حتى يتم التعامل مع أجنة الخطوط الأخرى كما هو موضح. لتركيب الأجنة على حامل نسيج العنكبوت ، قم بإعادة اعتماد كمية أخرى من agarose كما هو موضح. عندما يبرد الاغاروز ، ضع حامل نسيج العنكبوت تحت المجهر الاستريو وأضف 10 ميكرولتر من الاغاروز إلى الفتحة المشقوقة.

استخدم طرف الماصة لنشر الاغاروز فوق الفتحة المشقوقة ، قبل شفط أكبر قدر ممكن من الاغاروز حتى يتبقى طبقة رقيقة من الاغاروز فقط. عندما يتصلب الاغاروز ، استخدم فرشاة الرسم لالتقاط الأجنة بعناية ونقلها إلى فيلم الاغاروز. رتبها على طول المحور الطويل للثقب المشقوق مع محااورها الأمامية الخلفية المتوافقة مع المحور الطويل للثقب المشقوق

لتثبيت الأجنة ، قم بتقطيع ماصة بعناية من ميكرولتر إلى ميكرولتر من الاغاروز في الفجوة بين الأجنة وفيلم الاغاروز. عندما يتجمد الاغاروز ، أدخل حامل نسيج العنكبوت ببطء مع الأجنة المثبتة في غرفة العينة المملوءة بالمخزن المؤقت للصورة. لتصوير الأجنة ، تأكد من أن حامل نسيج العنكبوت في وضع 45 درجة بالنسبة لمحاور الإضاءة والكشف وفي قناة ضوء الإرسال ، حرك الجنين إلى وسط مجال الرؤية.

يجب ألا يكون حامل نسيج العنكبوت مرئيا. بعد ذلك ، حرك الجنين مع مرحلة الترجمة الدقيقة في Z حتى يتداخل المستوى الأوسط للجنين مع المستوى البؤري ويظهر المخطط الحاد. دون التبديل إلى قناة التألق ، حرك الجنين 250 ميكرون في كلا الاتجاهين لتحديد حجم الرؤية.

إذا كان التصوير على طول اتجاهات متعددة مطلوبا ، فقم بتدوير الجنين بشكل مناسب ، وقم بتركيز الجنين وحدد حجم الرؤية كما هو موضح للتو. ثم كرر هذا الإجراء لجميع الأجنة المركبة الأخرى. عندما يتم تحديد حجم الرؤية لجميع الأجنة ، حدد قناة التألق ومعلمات الفاصل الزمني وابدأ عملية التصوير.

بالنسبة للمقايسات التي تستمر عدة أيام ، ضع في اعتبارك تغطية فتحة غرفة العينة جزئيا على الأقل لتقليل التبخر. عند انتهاء فحص التصوير ، قم بإزالة حامل نسيج العنكبوت بعناية من غرفة العينة واستخدم فرشاة رسم صغيرة لفصل الأجنة عن فيلم الاغاروز ووضع الأجنة على شريحة مجهرية ذات علامة مناسبة. ضع الشريحة في طبق استرجاع للحضانة في ظل ظروف التربية القياسية المناسبة.

مع اقتراب النقطة الزمنية للفقس ، تحقق من أطباق الاسترجاع بشكل متكرر وانقل أي يرقات مفرغة إلى آبار فردية من صفيحة 24 بئرا. املأ الآبار في منتصف الطريق بوسط النمو المناسب ، ثم احتضان اليرقات في ظل ظروف التربية القياسية المناسبة. عندما يصل الأفراد المرصودون إلى سن الرشد ، وفر شركاء تزاوج مناسبين وتحقق من النسل بعد عدة أيام.

في هذا الفيديو ، يمكن ملاحظة ديناميكيات إشارة الفلورسنت لثلاثة أجنة مشتقة من سلالات ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا مختلفة على مدى يوم واحد تقريبا. كان من المتوقع وجود نمط مضان مماثل لأن جميع الخطوط تعبر عن EGFP الموضعية النووية تحت سيطرة مروجين يفترض أنهم موجودون في كل مكان ونشطون بشكل أساسي. ومع ذلك ، كشفت نتائج التصوير الحي المقارنة عن اختلافات زمانية مكانية قوية في أنماط التعبير التي لم تكن تأثيرات ثانوية بسبب التباين المحيط.

في هذا التحليل لثلاثة أجنة تريبوليوم تحمل نفس الجين المعدل القائم على الخنزير. تشير نتائج التصوير الحي المقارنة لعملية إغلاق نافذة المصل أثناء المعدة إلى أن الخط الفرعي الثاني يوفر إشارة إجمالية أقوى بشكل ملحوظ من الخطين الفرعيين الآخرين. كما تشير هذه البيانات ، قد يكون للسياق الجيني أيضا تأثير قوي على مستوى التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا في Tribolium.

نهجنا مناسب تماما لتحليل الأنماط الظاهرية بالضربة القاضية والضربة القاضية ، لأنه يسمح بتصوير أجنة التحكم في النوع البري في وقت واحد. يمكن أيضا استخدام بروتوكولنا لمقارنة تكوين نوعين أو أكثر من أنواع الحشرات. وبالتالي ، اكتساب رؤى أعمق حول تطور التنمية.