البصرية تسجيل النشاط الكهربائي في غينيا الخنازير المعوية باستخدام شبكات الجهد حساسة ملونات

يوضح هذا الفيديو عملية تشريح وتصوير تحضيرات الجهاز العصبي المعوي المحفزة كهربائياً باستخدام صبغة D-four-A-N-E-P-P-D-H-Q الحساسة للجهد. يتم أخذ قطعة صغيرة من الأمعاء من خنزير غينيا تم القضاء عليه رحيماً، ثم يتم تشريحها للكشف أولاً عن الطبقة تحت المخاطية، وفي النهاية عن الضفيرة الميenteric من أجل التسجيلات البصرية. يتم وضع أقطاب كهربائية على النسيج المثبت والمصبوغ بـ D-four-A-N-E-P-P-D-H-Q بعد التقاط صورة أولية عالية الدقة.

تُسجل التغيرات الضوئية التي تشير إلى النشاط الكهربائي باستخدام كاميرا عالية السرعة. وأثناء عملية الاستحواذ عالية السرعة، يتم تطبيق التحفيز الكهربائي. بعد ذلك، يتم دمج الصورة عالية الدقة فوق خريطة البكسل الخاصة بالكاميرا عالية السرعة لتحليلها باستخدام neuro plex.

مرحباً، أنا برايان سالزبرغ، مدير مختبر البصريات الخلوية، أو loco كما نحب أن نسميه، في قسم علوم الأعصاب بجامعة بنسلفانيا. واسمي أناليا أوبيد، وأنا أيضاً عضوة في مختبر البصريات الخلوية.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتسجيل النشاط الكهربائي من شبكات عصبية ثديية سليمة باستخدام صبغات حساسة للجهد. نستخدم هذا الإجراء لدراسة الترابط العصبي داخل وبين الشبكتين اللتين تشكلان الجهاز العصبي المعوي، والذي يُشار إليه أيضاً باسم الدماغ الثاني أو دماغ الأمعاء. لذا، لنبدأ.

ابدأ بتحضير تحضيرات ما تحت المخاطية والضفيرة المعوية عن طريق استئصال الأمعاء الدقيقة لخنزير غينيا من سلالة Hartley بوزن 150 إلى 200 جرام أو بعمر أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع، بعد تخديره بـ isof fluorine عن طريق الاستنشاق ثم قطع الرأس. بعد ذلك، قم بإزالة محتويات الأمعاء عن طريق غسل التجويف بمحلول M1 99 DM دافئ ومؤكسج. اقطع قطعة من الأمعاء بطول 8 إلى 10 سم مع الحرص على الحفاظ على القطبية.

انقله إلى طبق زجاجي قطر 10 سنتيمتر مغطى بـ sard يحتوي على M1 99 DM بدرجة حرارة الغرفة. ضع الطبق تحت مجهر تشريحي مزود بإضاءة الحقل المظلم. ثم باستخدام المقص، افتح الحافة المساريقية واستخدم دبابيس الحشرات لتثبيت القطعة المعوية بحيث يكون الجانب المخاطي للأعلى.

من المهم للغاية الحفاظ على شد متساوٍ بحيث تظهر الأنسجة بعد التثبيت بشكل مستطيل مع اصطفاف منتظم لصفوف vili المخاطية، وذلك من خلال إمساك ملقط dumont دقيق ذو رؤوس مستقيمة في وضع أفقي تقريبًا. قم بتقشير المخاط عن طريق الإمساك بـ VII عند أحد طرفي القطعة المعوية والسحب على طول المحور الطولي للأنسجة. استمر في فصل شرائط المخاط للكشف عن الطبقة تحت المخاطية التي تحتوي على العقد تحت المخاطية والأوعية الدموية تحت المخاطية.

بعد ذلك، وباستخدام مقص دقيق جداً، قم بإجراء قطع في الطبقة تحت المخاطية متبعاً اتجاه ألياف العضلات الدائرية. ثم ارفع الطبقة تحت المخاطية برفق شديد باستخدام ملقط دقيق مع دفع العضلة الدائرية للأسفل باستخدام المقص، والقطع على طول الحواف الطولية.

قم بتحرير الطبقة تحت المخاطية من بقية العينة مع تقدم عملية الفصل. الآن، قم بإجراء قطع ثانٍ باتباع اتجاه ألياف العضلات الدائرية على مسافة تتراوح من 1.5 إلى ثلاثة سنتيمترات من القطع الأول لتحديد الحجم النهائي للعينة تحت المخاطية؛ حيث تكون القطعة تحت المخاطية الناتجة بسمك يتراوح من 30 إلى 50 micrometers وتظهر بمظهر غشائي رقيق. انقلها إلى طبق syl guard آخر يحتوي على M1 99 DM طازج وثبتها بدبابيس برفق ودون شد.

ثم ضع الطبق في غرفة مؤكسجة في درجة حرارة الغرفة لاستخدامه لاحقاً. يجب أن يكون الجزء المعوي الأصلي الآن مجرداً من المخاطية وتحت المخاطية، مع كشف العضلات الدائرية. يُستخدم هذا الجزء الآن للحصول على تحضير للضفيرة الرصوية بهدف كشف الضفيرة الرصوية.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من طبقة العضلات الدائرية باستخدام ملقط دقيق ذي طرف مستقيم لسحب حزم الألياف من كل جانب من التحضير. لا يمكن فصل الضفيرة العضلية المعوية المكشوفة عن الطبقة العضلية الطولية والخلية المتوسطة (CI) التي تقع تحتها. انقل تحضير الضفيرة العضلية المعوية إلى طبق جديد مطلي بالـ sard يحتوي على وسط M1 99 M مؤكسج. ثم قم بتثبيت العينة التي تحتوي على عضلات حية باستخدام دبابيس بشكل غير محكم. قبل بضع دقائق من التجربة البصرية، انقل التحضير إلى طبق أصغر مطلي بالـ syl guard ومملوء مسبقاً بوسط M1 99 DM يحتوي على 2 µM من الـ nefe لمنع انقباض العضلات، وقم بتثبيته بإحكام عبر وضع عدة دبابيس دقيقة جداً حول المحيط بعناية.

تأكد من توزيع الشد بالتساوي وأن تكون الأنسجة مسطحة تماماً مقابل قاع واقي السيليكون. أصبح تحضير الأنسجة الآن جاهزاً للتجارب الفسيولوجية. قم بتحضير محلول DAI four A-N-E-P-P-D HQ بتركيز يتراوح من 5 إلى 50 µg/mL في M1 99 M مع 2 µM من nifedipine في قارورة زجاجية وقم بتغطيتها بورق الألومنيوم.

يجب أن يشكل الإيثانول من المحلول المخزون أقل من 0.5% من محلول M1 99 DM مع Nifedipine الذي كان يغطي العينة التحضيرية، ثم يُستبدل بمحلول الصبغة المُحضّر. وباستخدام حجم كافٍ من السلم الجزيئي لتغطية النسيج بالكامل، يتم التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة بعد عملية التحضين. تُغسل العينة التحضيرية بمحلول M1 99 M المؤكسج مع NEFE عن طريق استبدال المحتوى الكامل للحجرة.

يتم التسجيل البصري للنشاط العصبي في التحضيرات المحفزة كهربائياً باستخدام نظام يتكون من مجهر فلوريسنت رأسي (upright epi fluorescence microscope) مجهز بمقسم صور، وكاميرا عالية السرعة دقيقة منخفضة الدقة، وكاميرا ذات دقة عالية باللونين الأبيض والأسود، ومولد محفزات يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر، ومتحكم دقيق (micromanipulator). يتم تركيب الجهاز بأكمله على طاولة عزل نشطة للاهتزازات، ويُحاط بستائر صوتية ثقيلة وسقف من المايلار (Mylar) لتقليل الاهتزازات المنقولة عبر الهواء. وعلى الرغم من إمكانية إجراء عملية الحصول على الصور من كلتا الكاميرتين باستخدام جهاز كمبيوتر واحد يعمل ببرنامجي neuro plex و Global Lab image two أو أي برنامج آخر للحصول على الصور، إلا أن الإعداد الموضح هنا يستخدم جهازي كمبيوتر، يتحكم كل منهما في كاميرا منفصلة لبدء التجارب البصرية.

ضع الحجرة التي تحتوي على العينة المصبوغة والمفرودة على منصة المجهر. وبما أن D four A و EPPD HQ صبغة غير نافذة للغشاء ولا تظهر الفلورة إلا عندما تكون في بيئة دهنية، فإن العصبونات السليمة في التحضير المعوي المصبوغ يجب أن تظهر كبالونات فارغة تحت أي تكبير أعلى من 20 x عند فحصها. يتم ذلك باستخدام المرشحات HQ 5 35 50 للإثارة و HQ 5 72 LP four للانبعاث ومرآة ثنائية اللون بقدر 5 65 nanometer.

بعد ذلك، وباستخدام ضوابط المجهر الدقيق، يتم وضع مصفوفة أقطاب كهربائية خطية متعددة الفوهات عند الطرف الفمي للنسيج، مع التأكد من أن القطب الكهربائي بعيد عن عدسة المجهរ الشيئية. إن المصفوفة الخطية التي تحتوي على 10 أقطاب كهربائية من التنغستن موزعة على مدى سنتيمتر واحد قادرة على تحفيز عدة مسارات عصبية مستقلة، وهي مناسبة تمامًا لدراسة الدوائر العقدية المترابطة. ومع ذلك، فقد استخدمنا في البيانات التمثيلية قطباً كهربائياً تحفيزياً منزلي الصنع يتكون من سلكين.

استخدم الشمع اللاصق لوضع قطب أرضي عند الطرف المقابل من الحجرة، وقبل إجراء التسجيل الوظيفي، قم بالتقاط صورة عالية الدقة باللونين الأبيض والأسود للمنطقة التي سيتم تسجيل النشاط الكهربائي منها للمساعدة في التصوير المرئي. يمكن عكس التدرج الرمادي بحيث يظهر الفلورسنت داكناً. ولتطبيق التحفيز بالتيار الكهربائي باستخدام مولد التحفيز الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر، قم أولاً ببرمجة الجهاز عن طريق اختيار الشدة والمدة والتردد وعدد المحفزات المناسبة، بالإضافة إلى فترة التأخير بالنسبة لبداية عملية الحصول على البيانات البصرية.

لضمان حدوث التحفيز ضمن حدود نظام الحصول على البيانات البصرية، قم بتهيئة مولد المحفزات كجهاز يتم التحكم فيه بواسطة neuro plex. بعد ذلك، حدد معاملات الحصول على البيانات داخل neuro plex مع تحديد معدل الإطارات، وعدد الإطارات، وكسب الكاميرا. ولتحقيق تعريف كامل لجهد الفعل، يجب ضبط معدل الإطارات على 1 kHz كحد أدنى.

بما أن D four A و E-P-P-G-H-Q يظهران انخفاضاً في الفلورة عند إزالة الاستقطاب يرتبط خطياً بالتغير في الجهد، قم بعكس عرض الإشارات الضوئية داخل neuro plex بحيث لا تظهر جهود الفعل مقلوبة. ابدأ عملية الاستحواذ. تذكر الحصول على صورة جديدة عالية الدقة باللونين الأبيض والأسود لكل مجال رؤية قبل إجراء كل تسجيل وظيفي.

بمجرد اكتمال عملية الاستحواذ، استخدم neuro plex لتحليل النتائج دون اتصال بالإنترنت. وتُظهر منطقة من الشاشة تسمى عرض الصفحة الصورة الأولية للتحضير كما التقطتها الكاميرا عالية السرعة بدقة 80 في 80 كإطار فردي. وعندما يكون وضع الصفحة "إطار مطلق"، يتم دمج الصورة عالية الدقة التي تم الحصول عليها بالكاميرا الثانية فوق خريطة بكسل الصورة الأولية باستخدام أوامر عرض neuro plex.

يتطلب ذلك تغيير وضع الصفحة من تتبع مطلق إلى تتبعات، واختيار صورة متراكبة من ضمن أمر العرض. استخدم الماوس لتحديد بكسلات فردية أو مجموعات من البكسلات من الصورة المعروضة في شاشة الصفحة. ستظهر مخرجات هذه المناطق ذات الاهتمام على شكل تتبعات داخل نافذة عرض التتبعات، مما يكشف عن مقادير التغيرات البصرية التي سجلتها تلك البكسلات كدالة في الزمن.

يؤدي عكس المقياس الرمادي في الصورة عالية الدقة إلى تحسين الرؤية في عرض صفحة وضع التتبع، ويُنصح بشدة بعرض مخرج تماثلي من جهاز التحفيز. اختر قناة المخرج التماثلي لإدراجها ضمن نافذة عرض التتبع. يشير هذا المخرج إلى التوقيت الدقيق للمنبهات المطبقة أثناء التجربة.

لعرض البيانات كفيلم، استخدم أوامر الأفلام داخل برنامج neuro plex لعرض الإطارات المتتالية ضمن مجموعة البيانات باستخدام مقاييس الألوان الزائفة المعدلة وفقاً للحد الأقصى والأدنى للتغير في شدة الفلورة. تم تصوير عقدة عصبية من تحضير الضفيرة العضلية المصبوغة بـ DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q باستخدام كاميرا عالية الدقة وعدسة شيئية بقوة 60x. وأثناء عملية الحصول على البيانات، تم تحفيز التحضير بسلسلة من خمس نبضات بتردد 40 hertz.

مع وجود نبضة ذات سعة 15 milliamps ومدتها 0.5 milliseconds، تم تحديد أربع مناطق اهتمام (R OIs) وإنشاء مخططات بيانية لعرض البيانات الضوئية المتوسطة عبر المناطق المختارة في تسلسل إطارات الألوان الزائفة؛ حيث تظهر مناطق الاستجابة الضوئية الأولى لإزالة استقطاب الغشاء التي تشير إلى النشاط العصبي باللون الأصفر إلى الأحمر. وتشير هذه البيانات إلى أن النشاط الناجم عن التحفيز يحدث في مناطق منفصلة من كل عقدة عصبية، وتحمله بشكل أساسي محاور العبور. وتحدد مناطق الاهتمام الثانية والثالثة والرابعة عصبونات فردية على مسافات مختلفة من منطقة الاهتمام الأولى.

يوضح الشكل 2 بتكبير 10x المسارات التشريحية التي قد تنتشر عبرها المعلومات، حيث تشير الأسهم إلى الاتجاه الذي يتبعه التحفيز لتنشيط العقدة الضفيرية المعوية المحددة. لقد استعرضنا للتو مكونات إعداد بصري لتسجيل النشاط الكهربائي باستخدام صبغات حساسة للجهد، وكيف تفتح هذه التقنية، عند تطبيقها على الجهاز العصبي المعوي، إمكانية دراسة الاتصال الوظيفي داخل وبين شبكتين سليمتين من الثدييات تحت مجال المجهر. عند استخدام تقنية التسجيل البصري، يكون الاهتمام بالتفاصيل أمراً بالغ الأهمية.

يجب التحكم بدقة في مصادر الضوضاء البصرية والميكانيكية والكهربائية، كما يجب الحفاظ بدقة على سلامة العينة الجاهزة. لذا، فإن إتقان جميع الخطوات الفردية لهذا البروتوكول أمر ضروري لتحقيق النجاح في التسجيل البصري. هذا كل شيء.

شكراً جزيلاً لكم على المشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.