البصرية تسجيل النشاط الكهربائي في غينيا الخنازير المعوية باستخدام شبكات الجهد حساسة ملونات

هذا البروتوكول يوضح كيفية الجهد الحساسة الأصباغ البصرية للتمكن من تسجيل النشاط الكهربائي من الشبكات العصبية سليمة مثل الضفائر للنظام العصبي الخنازير الغينية المعوية ، مع قرار تعديل والتي تتراوح من واحد الى خلايا متعددة الدوائر العقدية.

يوضح هذا الفيديو التشريح والتصوير اللاحق لمستحضرات الجهاز العصبي المعوي المحفز كهربائيا باستخدام صبغة حساسية لجهد العجان الولادي D أربعة A-N-E-P-P-D-H-Q. يتم أخذ جزء صغير من الأمعاء من خنزير غينيا مقتل رحيم وتشريحه لفضح تحت الغشاء المخاطي أولا وفي النهاية الضفيرة العضلية المعوية للتسجيلات البصرية. يتم وضع الأقطاب الكهربائية على منديل مركب ملطخ ب D ل A-N-E-P-P-D-H-Q بعد التقاط صورة أولية عالية الدقة.

يتم تسجيل التغييرات البصرية التي تشير إلى النشاط الكهربائي باستخدام الكاميرا عالية السرعة. أثناء الاستحواذ على السرعة العالية ، يتم تطبيق التحفيز الكهربائي. ثم يتم تثبيت الصورة عالية الدقة على خريطة البكسل للكاميرا عالية السرعة لتحليلها باستخدام Neuroplex.

مرحبا ، أنا بريان سالزبيرج ، مدير مختبر البصريات الخلوية أو الموقع ، كما نحب أن نسميها في قسم علم الأعصاب بجامعة بنسلفانيا. اسمي أناليا أوبيد. أنا أيضا عضو في مختبر البصريات الخلوية.

سنعرض لك اليوم إجراء لتسجيل النشاط الكهربائي من الشبكات العصبية السليمة للثدييات باستخدام أصباغ حساسة للجهد. نستخدم هذا الإجراء لدراسة الاتصال العصبي داخل وبين الشبكتين اللتين تشكلان الجهاز العصبي المعوي ويشار إليهما أيضا باسم الدماغ الثاني أو دماغ القناة الهضمية. لذلك دعونا نبدأ.

ابدأ في تحضير المخاط الفرعي ومستحضرات الضفيرة المعوية عن طريق استئصال الأمعاء الدقيقة لخنزير هارتلي غينيا الذي يبلغ من العمر أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع والذي تم تخديره بواسطة الفلور والاستنشاق وقطع الرأس. ثم قم بإزالة محتويات الأمعاء عن طريق شطف التجويف بمحلول M1 99 DM الدافئ المؤكسج. قطع جزء معوي بطول ثمانية إلى 10 سم وتأكد من الحفاظ على القطبية.

انقله إلى طبق زجاجي مطلي بسمك 10 سم يحتوي على درجة حرارة الغرفة M1 99 DM ، ضع الطبق على مجهر تشريح مع إضاءة المجال الداكن. ثم باستخدام المقص. افتح حدود المساريقية واستخدم دبابيس الحشرات لتركيب جانب الغشاء المخاطي للجزء المعوي لأعلى.

من المهم للغاية الحفاظ على التوتر المتساوي بحيث يظهر النسيج بعد تثبيت شكل مستطيل مع محاذاة صفوف الغشاء المخاطي السابع بانتظام ، مع الاحتفاظ بملقط دومون ناعم بأطراف مستقيمة في وضع أفقي قريب. قشر الغشاء المخاطي عن طريق الإمساك بالفيء السابع في أحد طرفي الجزء المعوي وسحب المحور الطولي للأنسجة. استمر في فصل شرائط الغشاء المخاطي لكشف تحت الغشاء المخاطي الذي يحتوي على العقد المخاطية الفرعية والأوعية الدموية تحت المخاطية.

بعد ذلك ، باستخدام مقص ناعم جدا ، قم بعمل قطع في الطبقة تحت المخاطية باتباع اتجاه ألياف العضلات الدائرية. ثم ارفع تحت الغشاء المخاطي برفق شديد باستخدام الملقط الناعم أثناء دفع العضلة الدائرية. ضع طبقة لأسفل باستخدام المقص واقطعها على طول الحواف الطولية.

حرر تحت الغشاء المخاطي من بقية التحضير مع تقدم الانفصال. الآن قم بعمل قطع ثان باتباع اتجاه ألياف العضلات الدائرية على مسافة 1.5 إلى ثلاثة سنتيمترات من الأول لتحديد الحجم النهائي للتحضير تحت المخاطية ، ويبلغ سمك الجزء تحت المخاطي الناتج من 30 إلى 50 ميكرومتر ويظهر مظهر ثرثرة. انقله إلى طبق حماية آخر يحتوي على M1 99 DM الطازج وقم بتثبيته برفق وبدون شد.

ثم ضع الطبق في غرفة مؤكسجة في درجة حرارة الغرفة لاستخدامه لاحقا. يجب الآن حرمان الجزء المعوي الأصلي من الغشاء المخاطي وتحت الغشاء المخاطي ويجب أن تتعرض العضلات الدائرية. يستخدم هذا الجزء الآن لإنتاج مستحضر الضفيرة العضلية المعوية لفضح الضفيرة العضلية المعوية.

تخلص قدر الإمكان من طبقة العضلات الدائرية باستخدام ملقط رفيع ذو طرف مستقيم لسحب حزم الألياف من كل جانب من جوانب المستحضر. لا يمكن فصل الضفيرة العضلية المعوية المكشوفة عن الطبقة الطولية للعضلات و CI الأساسي.انقل مستحضر الضفيرة العضلية المعوية إلى طبق جديد مطلي بالسرد يحتوي على M1 99 M.ثم قم بتثبيت العينة التي تحتوي على عضلة حية. قبل بضع دقائق من التجربة البصرية ، انقل المستحضر إلى طبق جديد أصغر مطلي بواقي السيل مملوء بالفعل ب M1 99 DM يحتوي على اثنين من الميكرومولار نيفي لمنع تقلص العضلات ومثبتة بإحكام بعناية مع وضع العديد من المسامير الدقيقة جدا حول المحيط.

تأكد من توزيع التوتر بالتساوي وأن الأنسجة مسطحة تماما على قاع واقي السيل. تحضير الأنسجة جاهز الآن للتجارب الفسيولوجية. قم بإعداد محلول قائم من خمسة إلى 50 ميكروغرام لكل مليلتر من DAI أربعة A-N-E-P-P-D HQ في M1 99 M مع اثنين من النيفيديبين الميكرومولار في قارورة زجاجية وقم بتغطيتها بورق الألمنيوم.

يجب أن يشتمل الإيثانول من محلول المخزون على أقل من 0.5٪ من محلول M1 99 DM مع Nifedipine الذي كان يغطي المستحضر واستبداله بمحلول الصبغة المحضر. باستخدام حجم كاف من السلم لتغطية الأنسجة بالكامل ، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 30 دقيقة بعد الحضانة. اغسل المستحضر ب M1 99 M المؤكسج بالإضافة إلى NEFE عن طريق استبدال المحتوى الكامل للغرفة.

يتم إجراء التسجيل البصري للنشاط العصبي في المستحضرات المحفزة كهربائيا باستخدام نظام يتكون من مجهر مضان epi منتصب مزود بفاصل صور ، وكاميرا عالية السرعة منخفضة الدقة ، وكاميرا عالية الدقة بالأبيض والأسود ، ومولد تحفيز يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر ، ومناور ميكروم. يتم تثبيت الجهاز بأكمله على طاولة اهتزاز نشطة وعزل وتحيط به ستائر صوتية ثقيلة وسقف مايلر لتقليل الاهتزاز المحمول جوا. على الرغم من أنه يمكن إجراء الحصول على الصور من كلتا الكاميرتين باستخدام جهاز كمبيوتر واحد يقوم بتشغيل كل من neuroplex و Global Lab image two أو أي برنامج آخر للحصول على الصور ، إلا أن الإعداد الموضح هنا يستخدم جهازي كمبيوتر يتحكم كل منهما في كاميرا منفصلة لبدء التجارب البصرية.

ضع الغرفة التي تحتوي على العينة الملطخة على مرحلة المجهر. نظرا لأن D four A و EPPD HQ عبارة عن صبغة غشائية غير دائمة تتألق فقط عندما تكون في بيئة دهنية ، يجب أن يكون للخلايا العصبية السليمة من مستحضر معوي ملطخ مظهر بالونات فارغة تحت أي تكبير أعلى من 20 × عند العرض. باستخدام المرشحات HQ 5 35 50 للإثارة HQ 5 72 LP أربعة انبعاث ومرآة ثنائية 5 65 نانومتر.

بعد ذلك ، باستخدام موضع التحكم في المناور الصغير ، يتم استخدام قطب مصفوفة خطية متعدد الأسطوانات في الطرف الفموي من الأنسجة ، مع التأكد من أن القطب الكهربائي خال من هدف المجهر. مصفوفة مصفوفة خطية تحتوي على 10 أقطاب كهربائية من التنغستن موزعة على امتداد سنتيمتر واحد قادرة على إثارة العديد من المسارات العصبية المستقلة وهي مناسبة تماما لدراسة الدوائر العقدية المترابطة. ومع ذلك ، بالنسبة للبيانات التمثيلية ، استخدمنا قطبين محفزين محلي الصنع.

استخدم الشمع اللزج لوضع قطب كهربائي أرضي في الطرف المقابل من الغرفة قبل إجراء تسجيل وظيفي ، واحصل على صورة عالية الدقة بالأبيض والأسود للمنطقة التي سيتم تسجيل النشاط الكهربائي منها للمساعدة في التصور. قد يتم قلب المهارة الرمادية بحيث يبدو التألق مظلما. لتطبيق التحفيز الحالي باستخدام مولد التحفيز الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر ، قم أولا ببرمجة الجهاز عن طريق تحديد الشدة والمدة والتردد وعدد المحفزات المناسبة ، بالإضافة إلى التأخير فيما يتعلق ببداية الحصول على البيانات البصرية.

للتأكد من أن التحفيز يحدث ضمن حدود الحصول على البيانات البصرية ، قم بتكوين مولد التحفيز كجهاز يتم التحكم فيه بواسطة plex العصبي. بعد ذلك ، قم بتعيين معلمات الاستحواذ داخل plex العصبي للإشارة إلى معدل الإطارات وعدد الإطارات وكسب الكاميرا. لتحقيق التعريف الكامل للإجراء ، يجب ضبط معدل الإطارات المحتمل على كيلو هرتز واحد كحد أدنى.

نظرا لأن D four A و E-P-P-G-H-Q يظهران انخفاضا في التألق عند إزالة الاستقطاب المرتبط خطيا بتغير الجهد ، فقم بعكس عرض الإشارات الضوئية داخل الضفيرة العصبية بحيث لا تظهر إمكانات الفعل رأسا على عقب. ابدأ الاستحواذ. تذكر الحصول على صورة جديدة عالية الدقة بالأبيض والأسود لكل مجال رؤية قبل إجراء كل من التسجيلات الوظيفية.

بمجرد اكتمال الاستحواذ ، استخدم neuroplex لتحليل النتائج في وضع عدم الاتصال. تعرض منطقة من الشاشة تسمى عرض الصفحة الصورة الأولية للتحضير كما تم التقاطها بواسطة الكاميرا عالية السرعة 80 × 80 كإطار فردي. عندما يكون وضع الصفحة إطارا مطلقا ، يتم تثبيت الصورة عالية الدقة التي تم الحصول عليها بالكاميرا الثانية على خريطة البكسل للصورة الأولية باستخدام أوامر عرض plex العصبي.

يتطلب ذلك تغيير وضع الصفحة من التتبع المطلق إلى التتبعات واختيار الصورة المتراكبة من داخل أمر العرض. استخدم الماوس لتحديد وحدات البكسل الفردية أو مجموعات وحدات البكسل من الصورة المعروضة في عرض الصفحة. ستظهر مخرجات هذه المناطق ذات الأهمية كآثار داخل نافذة عرض التتبع تكشف عن أحجام التغييرات البصرية المسجلة بواسطة تلك وحدات البكسل كدالة للوقت.

انعكاس المقياس الرمادي في الصورة عالية الدقة إلى تحسين التصور على شاشة صفحة وضع التتبع ويتم تشجيعه بشدة على عرض إخراج تناظري من المحفز. حدد قناة الإخراج التناظرية لتضمينها في نافذة عرض التتبع. يشير هذا الإخراج إلى التوقيت الدقيق للمنبهات المطبقة أثناء التجربة.

لعرض البيانات كفيلم، استخدم أوامر الفيلم داخل neuro plex لعرض إطارات متتالية داخل مجموعة بيانات باستخدام مقاييس ألوان زائفة تم تعديلها على الحد الأقصى والحد الأدنى من التغيير في شدة التألق. تم تصوير عقدة من مستحضر الضفيرة العضلية المعوية الملطخة ب DIA four A-N-E-P-P-D-H-Q بكاميرا عالية الدقة وهدف 60 ×. أثناء الحصول على البيانات ، تم تحفيز التحضير بقطار من خمس نبضات عند 40 هرتز.

مع سعة كل نبضة تبلغ 15 مللي أمبير ومدة 0.5 مللي ثانية ، تم تحديد أربع مناطق ذات أهمية أو R OIS وتم إنشاء آثار لعرض البيانات البصرية التي تم حسابها في المتوسط على المناطق المحددة في تسلسل إطار الألوان الزائفة لمناطق الاستجابة البصرية الأولى لإزالة الاستقطاب الغشائي مما يشير إلى ظهور النشاط العصبي باللون الأصفر إلى الأحمر. تشير هذه البيانات إلى أن نشاط التحفيز EV المفرط يحدث في مناطق سرية من كل عقدة ، تحملها في الغالب محاور المرور. يحدد عائد الاستثمار الثاني والثالث والرابع الخلايا العصبية الفردية على مسافات مختلفة من عائد الاستثمار الأول.

الشكل الثاني عند التكبير 10 × المسارات التشريحية التي قد تنتشر فيها المعلومات الأسهم تشير إلى الاتجاه الذي يتبعه الحافز لتنشيط العقدة العضدية المعوية المحددة. لقد أظهرنا لك للتو مكونات الإعداد البصري لتسجيل النشاط الكهربائي باستخدام الأصباغ الحساسة للجهد وكيف أنه عندما يتم تطبيق هذه التقنية على النظام بين الأعصاب ، فإنها تفتح إمكانية دراسة الاتصال الوظيفي داخل وبين شبكتين من الثدييات السليمة تحت مجال المجهر. عند استخدام تقنية التسجيل البصري ، يعد الاهتمام بالتفاصيل أمرا في غاية الأهمية.

يجب التحكم بعناية في مصادر الضوضاء والبصرية والميكانيكية والكهربائية والحفاظ على صحة المستحضر بدقة. وبالتالي ، فإن إتقان جميع الخطوات الفردية لهذا البروتوكول أمر ضروري لتحقيق النجاح في التسجيل البصري. هذا كل شيء.

شكرا جزيلا على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.