بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

مرحبا ومرحبا بكم في مجموعة البيولوجيا الهيكلية والوظيفية للغشاء. اسمي مارتن كافيري. ينصب تركيز بحثنا على الغشاء البيولوجي ، الذي يظهر مخططه في الشريحة الأولى ، الغشاء الذي يحيط بالخلية والعضيات تحت الخلوية عند وجوده عبارة عن بنية رقيقة جزيئية ، فقط جزيئان دهنيان عبر ومرصعين بالبروتينات.

نحن مهتمون بالهيكل والوظائف المطبقة على كل من الدهون والبروتينات. ومع ذلك ، لأغراض سلسلة JO هذه ، سأقتصر تركيزي على بروتينات الغشاء. نسعى لفهم كيفية عمل بروتينات الغشاء هذه على المستوى الجزيئي لسببين.

أولا ، هناك الرضا الفكري في معرفة كيفية عمل شيء ما. ثانيا ، من خلال معرفة كيفية عملها ، تماما مثل دراجتك أو سيارتك ، هناك احتمال لإصلاحها في حالة تعطلها. تصميم الدواء هو نتيجة واضحة لهذا النوع من العمل.

النهج الذي نتبعه لمعرفة كيفية عمل بروتين الغشاء على المستوى الجزيئي هو تحديد تركيبته البلورية. يتضمن ذلك تحديد الموقع في الفضاء ثلاثي الأبعاد لجميع الذرات ، أو على الأقل جميع الذرات غير الهيدروجينية التي يتكون منها البروتين. الطريقة التي نستخدمها لهذا الغرض تسمى علم البلورات بالأشعة السينية الجزيئية MX باختصار.

نرى هنا مثالا على بروتين غشائي تم تحديد هيكله باستخدام MX عند بلورة جودة جزئية للبروتين مطلوبة للقيام ب mx. كما يمكنك أن تتخيل ، هناك العديد من الخطوات المتضمنة في التحديد المنظم باستخدام علم البلورات الجزيئي كما هو موضح. هنا. عادة ما يتضمن ذلك تحديد هدف البروتين الغشائي ثم إنتاج تنقية وتبلور.

يتم إجراء قياسات الحيود على البلورة باستخدام مصدر الأشعة السينية المنزلي أو السنكروترون. تتم معالجة بيانات الحيود ، مما ينتج عنه خريطة كثافة الإلكترون ، والتي يتم تزويدها بعد ذلك بنموذج جزيئي. يمكن استخدام النموذج عند تكريره لاستكشاف آلية عمل البروتين وتصميم الدواء القائم على الهيكل.

ينصب تركيز هذه المقالة على توضيح كيف ننتج بلورات ذات جودة جزئية من بروتينات الغشاء باستخدام أطوار الميزو الدهنية بما يسمى بطريقة الميزو. ويمكن الاطلاع على استعراض حديث للطريقة ونطاقها في المرجع الأول. يتم وصف البروتوكول خطوة بخطوة الذي سنتبعه هنا بالرجوع إلى مخطط انسيابي يلخص الخطوات المتضمنة والوقت اللازم لإعداد تجربة تبلور بروتين غشاء الميزو النهائي هنا.

يغطي هذا الفيديو تلك الخطوات المحاطة بخطوط حمراء متقطعة. العناصر التي ستحتاج إلى القيام بها في البلورة المتوسطة في الوضع اليدوي موضحة هنا. وهي تشمل محلولا مركزا من دهون بروتين الغشاء المنقى لإنشاء الميس المضيف ، وعادة ما يكون أحاديا أوليا لجعل الدهون أكثر وضوحا.

في هذا الفيديو ، تم تخديره بمحاليل ترسيب الصبغة الحمراء ، وأجهزة ملاعبة أنابيب المياه النقية والأطراف التي يمكن التخلص منها ومجموعة متنوعة من محاقن هاميلتون الضيقة ، بعضها بإبر قابلة للإزالة ، ومقرنة ضيقة التجويف تستخدم لخلط محلول البروتين مع الدهون لإنتاج الطفة. موزع متكرر من مجهر زجاجي هاميلتون ينزلق وينزلق الغطاء. شريط فاصل مزدوج العصا مثقب بشكل مثالي لملاقط إنشاء جيدة ، وأنسجة ثلجية مكسورة ، وآلة حاسبة ، والأهم من ذلك كله دفتر ملاحظات المختبر الخاص بك.

يتم استخدام الإجراء التالي لإعداد لوحة تبلور شطيرة زجاجية. للتحميل ، ضع شريحة مجهر منعزلة على المقعد. قم بإزالة غطاء الورق الواقي من أحد أسطح شريط شريط فاصل العصا المزدوجة المثقوب.

ضع الجانب اللاصق للشريط لأسفل ملامسا لسطح ضغط الشريحة. أغلق الشريط على الشريحة. باستخدام براير أو أسطوانة ، يمكن وضع رقائق الألومنيوم بين الشريط والأسطوانة لحماية قاعدة الآبار.

قم بإزالة غطاء الورق الثاني من الشريط لكشف سطحه اللاصق العلوي. يولد هذا الإجراء صفيحة زجاجية جاهزة للتحميل والسقف اللاحق بمجرد اكتمال مكان التحميل. ينزلق الغطاء المنعزل الفردي على مقربة من اللوحة لسقف الآبار بسرعة وكفاءة.

ضع الدهون في كتلة يتم التحكم في درجة حرارتها عند 45 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق لجعلها منصهرة. لاحظ أن الدهون المستخدمة عادة ما تكون أرضا أحادية. في هذا الفيديو ، يحتوي الدهون على صبغة حمراء مضافة للرؤية أثناء ذوبان الدهون.

قم بإعداد حقنتين من حقن هاميلتون ضيقة سعة 100 ميكرولتر للاستخدام في خطوة خلط البروتين الدهني ، قم بإزالة زيت فرو التفلون من المحقنة التي ستحتوي على محلول البروتين. ضع المحقنة التي ستحمل الدهون بجانبها. في هذه الحالة ، يتم ترك فال في مكانه.

ضع قارنة التوصيل ذات التجويف الضيق بين المحقنتين ثم قم بتوصيل قارنة التوصيل بإصبع الحقنة الدهنية. شد قارنة التوصيل بالمحقنة ، لكن لا تفرط في إحكام ربطها. قم بإزالة المكبس من برميل المحقنة الدهنية.

تأكد من أن الدهون منصهرة. اضبط الماصة على 30 ميكرولتر وامتص ببطء 30 ميكرولترا من غطاء الدهون المنصهر. قارورة الدهون.

يجب تخزين الدهون تحت النيتروجين أو الأرجون عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. قم بتوصيل أكبر قدر ممكن من الدهون المنصهرة ببطء إلى الطرف المفتوح للحقنة. الحرص على عدم إدخال فجوات هوائية.

ضع المكبس في البرميل الملامس للنمر المنصهر وقم بدفع المكبس ببطء إلى أعلى البرميل مع تثبيت المحقنة عموديا. كما هو موضح ، ترتفع فقاعة الهواء المحاصرة عن غير قصد في هذه العملية ويتم إطلاقها. لدينا الآن سدادة من الدهون المنصهرة في البرميل التي يجب عليك تحديد حجمها بدقة.

يمكن القيام بذلك عن طريق قراءة العلامات الموجودة على برميل المحقنة. في هذه الحالة ، يكون الحجم 23 ميكرولتر ، والذي يتم تسجيله في دفتر المختبر. حرك الفراء على الإبرة الممتدة من قارنة التوصيل.

استخدم المكبس لإجبار الدهون المنصهرة على أعلى البرميل وببطء وبلطف في الإبرة الموجودة في قلب المقرنة. إذا كانت الإبرة ممتلئة قليلا ، فسترى الدهون تنبض في نهايتها المفتوحة. عن طريق النسخ الاحتياطي للمكبس قليلا ، يمكن سحب الدهون الزائدة إلى قارنة التوصيل حتى يتم تدفقها مع طرف إبرة المقرنة.

في هذه الحالة ، يتم تحميل وحدة مقرنة الحقنة بالكامل وجاهزة للدمج مع حقنة البروتين. يجب غزل المحلول عند 14 ، 000 جم لمدة 10 دقائق ، من خمس إلى 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة الركام الكبير. قبل إعداد تجارب التبلور ، خذ محلول البروتين من دلو الثلج وقم بتوازنه في درجة حرارة الغرفة.

احسب حجم البروتين ، لذا يجب استخدامه لتشكيل الطور التكعيبي عند أو بالقرب من الترطيب الكامل للأوليان 20 درجة مئوية. يحدث الترطيب الكامل بالماء عند ما يقرب من 40٪ من وزن الماء كما في مخطط الطور. تذكر أننا قمنا بتحميل حقنة الدهون ب 23 من أحادي بكثافة 0.94 ملليغرام لكل ميكرولتر.

هذا يتوافق مع 21.6 ملليغرام من الدهون ، وبالتالي هناك حاجة إلى 21.6 في أربعة مقسومة على ستة أو 14.4 ملليغرام أو 14.4 ميكرولتر من محلول البروتين مع حقنة هاميلتون سعة 25 أو 50 ميكرولتر تأخذ الحجم المطلوب من محلول البروتين ، وتنقل المحلول إلى طرف التفلون من المكبس في برميل محلول البروتين. مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء ، اسحب الإبرة بعناية وقم بقياس حجم محلول البروتين في المحقنة. يجب أن تتطابق مع القيمة التي تم تسليمها في الخطوة السابقة.

استعدادا للجمع مع حقنة محملة بالدهون. قم بوص محلول البروتين بحذر لأعلى البرميل لينتهي به الأمر بنهاية الفتح. يمكن ملاحظة ذلك من خلال النظر إلى الأسفل من خلال نهاية إنهاء البرميل.

محلول بروتين الليبين ، المحاقن المحملة جاهزة الآن للدمج استعدادا ل Mex للقيام بذلك ، قم بربط حقنة البروتين في الطرف المفتوح للمقرنة المرفقة بحقنة الدهون. بعد الجمع بين حقنتين عن طريق قارنة. يجب أن يوجد حجم مستمر من السائل من الدهون في حقنة واحدة عبر المقرنة إلى محلول البروتين في المحقنة الأخرى.

استعدادا للخلط ، يتم تثبيت الوحدة المجمعة في واحدة مع حقنة واحدة في اليد اليمنى والأخرى في اليسار. يتم تطبيق عزم الدوران على كلا البرميلين حتى قارنة التوصيل ، باستخدام أصابع وإبهام كلتا يديك لضمان بقاء الختم الموجود على الأخاديد في قارنة التوصيل سليما عند الشد. سيؤدي جهاز الخلط المجمع في هذه المرحلة إلى إتلاف ALS ويسبب التسرب تحت الشد كما سيؤدي إلى التسرب.

إنها مسألة خبرة مع التجربة والخطأ الحتميين وفقدان العينة في بعض الأحيان. لذلك من المفيد التدرب على الدهون والماء أو محلول عازلة للتعرف على النظام قبل البدء في استخدام محلول البروتين القيم للتأثير على الخلط ، ودفع المكبس على جانب البروتين من وحدة الخلط المجمعة إلى أقصى حد مع الإبهام أو السبابة لدفع محلول البروتين من حقنة البروتين من خلال المقرنة إلى حقنة الدهون. إذا تم إغلاق الوحدة بشكل فعال ، فإن هذا الإجراء سيؤدي إلى حركة متساوية ومعاكسة للمكبس على الجانب الدهني.

يستخدم المكبس الموجود على الجانب الدهني الآن لدفع محتويات المحقنة الدهنية مرة أخرى عبر الكولر وإلى حقنة البروتين. تتكرر هذه العملية عدة مرات. في بعض الأحيان ، هناك حاجة إلى مائة مقطع أو أكثر لإنتاج مرحلة ميسا متجانسة.

في بداية الخلط ، يمكن أن تكون حركة المواد ذهابا وإيابا عبر قارنة التوصيل غير متساوية وفي بعض الأحيان تكون هناك حاجة إلى قوة إضافية لإحداث الخلط. هذا أمر متوقع. عادة ما يكون الخلط الأولي مصحوبا بتطور غيوم غير منتظم في العينة ومن المتوقع مرة أخرى.

مع تقدم التجانس. يصبح الملمس كما هو محسوس بالقوة اللازمة لتحريك الغطاسات ذهابا وإيابا أكثر اتساقا ومميزا للمرحلة المكعبة اللزجة ، كما هو الحال مع المظهر المرئي للمرحلة المكعبة الناشئة. إذا كانت الظروف مناسبة وتشكلت المرحلة المكعبة ، فيجب أن يظهر التشتت شفافا بصريا في برميل المحقنة.

وبالتالي ، يجب أن تكون العلامات الموجودة على برميل المحقنة مقروءة بوضوح خلال مرحلة الميزو في البرميل. في حالة البروتينات الملونة ، سيكون لمرحلة الميزو لون البروتين ، ولكنها ستكون شفافة بصريا. يمكن أن يؤدي التبريد الطفيف جدا للعينة أثناء الخلط عن طريق وضع خلاط الحقنة لفترة قصيرة على الجليد إلى تسريع التجانس وتحقيق الشفافية.

ومع ذلك ، من المهم عدم المبالغة في توخي الحذر في العينة لتجنب الخلط القوي للغاية لأن هذا قد يتسبب في ارتفاع درجة حرارة العينة بسبب التسخين الاحتكاكي. في هذا المنعطف ، تم تشكيل مرحلة ميسا المكعبة وإعادة تكوين البروتين في بلة الدهون. مرحلة ميسا جاهزة الآن للتوزيع في الآبار الفردية لألواح التبلور.

أولا ، ومع ذلك ، يجب نقل مرحلة الميزو إلى حقنة هاميلتون سعة 10 ميكرولتر مثبتة على موزع متكرر. ابدأ هذه العملية عن طريق اقتران المحقنة بالموزع بشكل رقيق. قم بتحميل المحقنة بالمكعب.

قم بإزالة الإبرة والمكبس من المحقنة. اترك فال التفلون في مكانه. قم بإزالة الجوز المحتجز من الموزع بمساعدة عملة معدنية صغيرة.

مع سحب ذراع السقاطة بالكامل. أدخل المحقنة بدون المكبس والإبرة من خلال حلقة تثبيت الموزع. استبدل جانب حشية العقدة المثبتة المواجه للحقنة وقم بلفها بإحكام على الطرف المفتوح للحقنة.

يجب توخي الحذر للتأكد من أن المحقنة متمركزة بشكل صحيح في حلقة التثبيت وأن البرميل محاذي بالتوازي مع ذراع السقاطة. يمكن الحكم على كلاهما من خلال I.هذان المتطلبان مهمان لأنه إذا لم يعمل المكبس مجانا ومن خلال الضغط سوف يتراكم في حقنة المصدر أثناء التحميل ويمكن أن يحدث تسرب. مرر المكبس عبر حلقة الإمساك بصمولة القابض ، وفك بضع لفات وقم بتوجيه المكبس إلى الطرف المفتوح للحقنة.

اضغط على ذراع السقاطة ، وحرك المكبس بالكامل في البرميل وتأكد من أنه يتحرك بحرية وعبره في البرميل. إذا تم فك المسمار وشريط التوجيه ، فأعد إحكام ربطه وأعد التحقق من أن المكبس يتحرك بحرية. أنا حقنة الاستغناء جاهزة الآن للتحميل.

حرك المكبس الموجود على جانب واحد من وحدة الخلط المجمعة إلى علامة التخرج صفر ميكرولتر. لنقل مرحلة الميزو إلى المحقنة الأخرى والمقرنة. افصل المحقنة الفارغة مع وضع UL في مكانها من وحدة الخلط وقم بتوصيل المحقنة المحملة على الفور بقارنة التوصيل المرفقة بالنهاية الملولبة لمحقنة الاستغناء سعة 10 ميكرولتر.

درجة الضيق التي يتم بها الاقتران أمر بالغ الأهمية. كما لوحظ بالفعل ، قم بتحميل حقنة الاستغناء عن طريق الضغط على مكبس المحقنة سعة 100 ميكرولتر بحيث تنتقل المرحلة المتوسطة عبر قارنة التوصيل. إذا كانت أداة التوصيل ضيقة وكان المكبس الموجود في حقنة الاستغناء يعمل بحرية ، فيجب أن يبدأ المكبس في التحرك في اتجاه حركة مكبس التحميل حيث تمتلئ حقنة التوزيع.

افصل حقنة التحميل مع قارنة التوصيل من حقنة التوزيع. قم بتأمين إبرة قصيرة ومسطحة في النهاية الفولاذية لحقنة الاستغناء وقم بإحكام ربطها في مكانها بعناية. قم بتثبيت المكبس على ذراع السقاطة عن طريق شد العقدة في حلقة الإمساك.

يجب الحرص على عدم إفراط في شد العقدة. لأن هذا يمكن أن يسجل ويشوه المكبس مما يجعله غير صالح للاستخدام. من المهم أن يقتصر نطاق السفر المقدم لذراع السقاطة في حالة التثبيت على ما لا يزيد عن بوصة واحدة.

كما هو موضح بعد ذلك ، فإن المكبس يميل إلى الانحناء ويمكن أن يفشل التسليم. L اضغط على أسطوانة السقاطة عدة مرات لدفع المكبس في البرميل ، وبالتالي ملء حجم الفراغ للإبرة وتحميل الإبرة. يجب تكرار هذه الخطوة حتى 10 مرات حتى تظهر سلسلة مستمرة من مرحلة ميسا من طرف الإبرة.

الإبرة جاهزة الآن للاستخدام في إعداد تجارب التبلور ، والتي يجب أن تبدأ على الفور. لا ينصح بالحفاظ على الطور المكعب المحمل بالبروتين لفترة طويلة قبل إعداد تجارب التبلور. نظرا لأن بعض البروتينات غير مستقرة في المرحلة المكعبة بدون راسب مضاف ، ضع لوحة تبلور متعددة الآبار وانزلاق الغطاء على سطح ، مرفوعا بضع بوصات فوق المقعد لسهولة التحميل.

يتم تحقيق التباين الأمثل والرؤية المحسنة عندما يكون السطح داكنا قليلا. تجانس المحاليل الترسيبية والقوارير غير المغطية. اضبط دعامة توزيع الترسيب على ميكرولتر واحد مع تثبيت حقنة الاستغناء عموديا بيد واحدة ، واستخدم اليد الحرة لوضع طرف الإبرة في الوسط وفوق قاعدة البئر مباشرة.

رقم واحد. اضغط على الزر الموجود على الموزع المتكرر لطرد بلعة من المازة على سطح الزجاج. حجم البلعة 200 نانولتر.

عند استخدام موزع التكرار القياسي مع حقنة سعة 10 ميكرولتر ، يجب ألا يزيد طرف الإبرة عن بضع مئات من الميكرومترات فوق قاعدة البئر لضمان التسليم السليم ، يمكن تحقيق التسليم القابل للتكرار بسهولة. يتطلب الأمر القليل من الممارسة. بعد تحميل الآبار الأربعة المجاورة بالعصارة ، ضع ميكرولتر واحد من محلول الترسيب فوق كل بلعة ميزة.

باستخدام اثنين من الميكرولتر لكل براءة اختراع ونصائح قياسية يمكن التخلص منها في أسرع وقت ممكن ، ضع زلة غطاء بشكل مباشر فوق الآبار المملوءة لتغطيتها بشكل موحد لإحداث ختم مانع للماء. استخدم ملعقة للضغط على زلة الغطاء حيث تتلامس مع السطح اللاصق للذراع المكشوف لشريط الفاصل. يمكن تكرار عملية توزيع الميسرات والترسيب حتى يتم تحميل جميع الآبار الموجودة على اللوحة وإغلاقها.

اللوحة جاهزة الآن للفحص والحضانة. قم بتسمية اللوحة بوضوح لأغراض التتبع. عادة ما يتم التعامل مع البروتينات الحساسة للضوء عن طريق لف الألواح بورق الألمنيوم قبل وضعها في غرفة الحضانة.

يمكن إزالتها وفحصها تحت المجهر في ضوء خافت أو ملون بشكل مناسب. ضع الألواح في غرفة يتم التحكم في درجة حرارتها عادة عند 20 درجة مئوية أو ما يقرب من ذلك وفقا لجدول زمني منتظم. افحص الجدران بحثا عن نمو البلورات باستخدام مجهر ضوئي مستقطب بمقياس 10 أو 20 ضعفا.

الهدف ، الجدول الزمني المستخدم في مختبر المؤلف هو كما يلي ، اليوم 0 1 2 3 5 7 14 21 30 مجموعة الوظائف. افحص بعناية بلعة الميزة. ضبط عمق التركيز داخل العينة التي يبلغ سمكها 140 ميكرون.

يجب إجراء الفحص في كل من الضوء العادي وبين المستقطبات المتقاطعة ، وبلورات البروتين الغشائية عديمة اللون التي تنمو في الطور المكعب عند النظر إليها بالضوء العادي. تبدو هكذا. تبدو بلورات البروتين الغشائية عديمة اللون التي تنمو في الميزو عند عرضها بالضوء المستقطب مثل هذا أو هذا البروتينات الغشائية الملونة بشكل طبيعي التي تنمو في الميزو عند النظر إليها بضوء طبيعي تبدو مثل هذا أو هذا.

تتمثل الخطوات التالية في العملية الشاملة للتحديد المنظم في حصاد البلورات وتبريدها بالتبريد ، وتسجيل ومعالجة حيود الأشعة السينية منها. يتم تناول هذه الموضوعات في مقالات منفصلة في JoVE في هذه السلسلة.