الإنتاجية العالية للبروتينات غشاء البلورة باستخدام أسلوب Bicelle Lipidic
يناير 9, 2012
Bicelles هي مزيج الدهن / مزدوج الألفة التي تحافظ على بروتينات غشاء (النواب) في طبقة ثنائية المادة الدهنية ولكن فريد السلوك المرحلة التي تسهل سرعة عالية الفحص بواسطة الروبوتات التبلور. وقد أنتجت هذه التقنية بنجاح في عدد من هياكل عالية الدقة من مصادر حقيقية النواة وبدائية. هذا الفيديو يصف بروتوكولات لتوليد الخليط bicelle lipidic ، وإدماج النواب في خليط bicelle ، وإقامة المحاكمات التبلور (يدويا وكذلك آليا) ، والحصاد بلورات من المتوسط.
سيوضح هذا الفيديو طريقة لإعداد تجارب بلورة عالية الإنتاجية لبروتينات الغشاء المنقاة باستخدام خلايا Lipic B. أولا ، يتم تحضير الخلايا البائية عن طريق خلط الدهون ويتم دمج بروتين غشاء منقى منظف في خليط الخلايا البائية ويتم إجراء تجارب التبلور باستخدام الفحص البصري لروبوت نانولتر. يكشف استخدام مجهر ضوئي قياسي عن وجود بلورات.
بمجرد تشكيلها ، يمكن استخراج بلورات البروتين وتجميدها لجمع البيانات وتحديدها المنظم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه نظرا لسلوك الطور الفريد للخلايا البائية ، يمكن استخدام المعدات القياسية والروبوتات المتوفرة في المختبر للتبلور. يعد إعداد الخلايا البائية تقنية بسيطة ويسمح لك بإخراج بروتين الغشاء المستهدف من منظف خليتي ، ووضعه في وسط دهني.
يمنحك هذا مجموعة جديدة تماما من الشروط للعرض. إنها طريقة بسيطة تم استخدامها بنجاح على العديد من بروتينات الغشاء بحيث لا يوجد سبب لعدم تجربتها. تتمثل الخطوة الأولى في التبلور القائم على الخلايا البائية في تحضير خليط أمفي دهني مكون من الخلايا البائية.
تتطلب هذه العملية جهدا كبيرا وهي الأكثر استهلاكا للوقت. لاحظ أن الأمر قد يستغرق عدة ساعات حتى يكتمل. يمكن أن تتشكل الخلايا البائية في مجموعة متنوعة من تركيبات أمفي الدهون وعلى نطاق واسع من التركيزات.
للحصول على نقاط البداية المقترحة ، انظر الجدول الأول في البروتوكول المكتوب المصاحب يبدأ بتحضير مليلتر واحد من خليط كبسو DMPC بنسبة 2.8 إلى مولية واحدة. للقيام بذلك ، قم بوزن 0.26 جرام من DMPC و 0.09 جرام من Chapo في أنبوب. ارفع الحجم إلى 1.0 مل باستخدام دوامة الماء منزوع الأيونات الخليط.
بعد ذلك ، قم بتسخين الخليط إلى حوالي 40 درجة مئوية في حمام مائي حتى يصبح شبيها بالهلام بعد ذلك. ضع الأنبوب على الثلج. يجب أن تصبح العينة سائلة مثل مرة أخرى.
ثم الدوامة مرة أخرى لبضع دقائق ، واستمر في ركوب الدراجات عبر خطوات الاحترار والتبريد والدوامة حتى يذوب الدهون تماما. لاحظ أنه مع إجراء المزيد من الدورات ، قد يصبح الخليط غائما عند التبريد عند الانتهاء. سيكون الخليط عبارة عن مادة هلامية شفافة عند درجة حرارة الغرفة أو أعلى منها ، ويمكن وضع سائل لزج على الجليد بواسطة الخلايا عند 20 درجة مئوية تحت الصفر للتخزين طويل الأجل.
بعد ذلك ، يتم دمج البروتينات النقية في وسط الخلية البائية. هذه عملية بسيطة ويجب إجراؤها في نفس يوم التبلور ، والذي يظهر في القسم التالي من الفيديو. قم بإذابة خليط الخلايا البائية DMPC في درجة حرارة الغرفة حتى تتغير المرحلة إلى هلام شفاف.
ضع الخليط على الثلج لتسييله ثم قم بدوامه لفترة وجيزة لإعادة إنشاء مرحلة الخلية البائية المتجانسة. من هذه النقطة فصاعدا ، احتفظ بخليط الخلايا البائية والبروتين المنقى على الثلج. سيؤدي ذلك إلى إبقاء الخلية البائية في طور سائل، مما يجعلها قابلة للسحب العيني.
بعد ذلك ، أضف خليط الخلايا البائية إلى البروتين المذاب بالمنظف المنقى بنسبة واحد إلى أربعة ، من الحجم إلى الحجم. ثم قم بتحريك الماصة برفق لأعلى ولأسفل حتى يصبح المحلول واضحا ومتجانسة. إذا ظهرت الفقاعات ، لفترة وجيزة ، قم بتدويرها في جهاز طرد مركزي على الطاولة.
احتضان الخليط على الثلج لمدة 30 دقيقة على الأقل لتعزيز الدمج الكامل للبروتين في الخلايا. خليط البروتين بالخلية جاهز الآن لتجارب التبلور. سيتم إثبات تجارب التبلور باستخدام روبوت تبلور البعوض.
بارد ، صفيحة سفلية 96 بئر V بوضعها على الجليد. قم بتقطيع خليط البروتين الخلوي في اللوحة للتأكد من أن لزوجة المحلول ضئيلة. احتفظ بخليط البروتين بالخلية على الثلج حتى الخطوة الأخيرة.
يحتوي الروبوت المستخدم هنا على خمس منصات. ضع الصفيحة الدقيقة التي تحتوي على الخزان على المنصة الثالثة وغطاء التبلور الذي سيتم توزيع القطرات عليه على المنصة الخامسة. ثم ضع البروتين بواسطة لوحة الخلية على المنصة الأقرب أربعة إلى موضع الاستغناء.
هذا يضمن أن خليط البروتين بالخلية هو آخر ما يلتقطه الروبوت ويتم إطلاقه على الفور. باستخدام البرنامج لبدء التشغيل ، سيلتقط الروبوت محلول الخزان متبوعا بخليط البروتين الخلوي ويوزعها على الغطاء على شكل قطرات لمنع التسخين وزيادة اللزوجة أثناء الاستغناء عنها. لا تبرمج البعوض لخلط الخزان مع خليط البروتين عن طريق الخلية بمجرد اكتمال التشغيل.
قم بإزالة لوحة بروتين خلية الشراء من الجهاز وضعها على الثلج. قم بإزالة الغطاء من الجهاز وضعه على اللوحة التي تحتوي على محلول الخزان بحيث يتم قلب القطرات. احتضن اللوحة عند 20 درجة مئوية.
لاحظ أنه يمكن أيضا اختبار درجات الحرارة الأخرى لتكوين البلورات وتحسينها. تؤدي درجات الحرارة المرتفعة إلى تحفيز المرحلة الرقائقية ، والتي تتميز بتنظيم البروتين في طبقات. يمكن فحص درجات الحرارة بين أربع درجات مئوية و 20 درجة مئوية.
قد تتسبب درجات الحرارة التي تقل عن أربع درجات مئوية في ترسيب الدهون على مدى فترات طويلة من الزمن في اليوم الأول والثالث وأسبوعيا بعد ذلك ، وتقييم مظهر البلورة ونموها باستخدام مجهر ضوئي قياسي. تظهر هنا صورة المجال الساطع وصورة للأشعة فوق البنفسجية لبلورات على شكل إبرة لوحظت في حالة الهجوم فقط. لم يتم الكشف عن التألق من البلورات مما يشير إلى وجود إيجابية خاطئة في هذه الصورة.
تشكلت بلورة على شكل قضيب عندما تم استخدام ميثيل البروبان ديول كمرسب. يشير البلورة الأسبوعية إلى أنها قد تكون بلورة بروتينية ، ولكن وجد أنها غير مثابرة باستخدام حيود الأشعة السينية. يظهر هنا بلورة لوحظت بعد حوالي أربعة أسابيع من إعداد التجارب.
يؤكدالتألق القوي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية أنه بلورة بروتينية. كما شاهدت في هذا الفيديو. بمجرد توفر الخلايا البائية ، يمكن خلطها مباشرة مع البروتين المنقى ومن هذه النقطة يستمر التبلور تماما مثل البروتوكولات القياسية القائمة على المنظفات.
ميزة أخرى مميزة هي القدرة على تخدير الخلايا البائية بدهون محددة لأغراض التحسين. هناك بالفعل الكثير من التنوع في هذه التقنية وهي سهلة الاستخدام بحيث يجب تجربتها لجميع مشاريع تبلور البروتين الغشائي
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا الفيديو طريقة لإعداد تجارب تبلور عالية الإنتاجية للبروتينات الغشائية المنقاة باستخدام البيكليس الدهنية. تتيح هذه التقنية دمج البروتينات الغشائية في وسط دهني، مما يسهل عملية التبلور.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء البنيوي
- تبلور البروتينات الغشائية
- الفيزياء الحيوية
الخلفية
- البيكليس هي مخاليط دهنية/أمفيفيلية تعمل على تثبيت البروتينات الغشائية داخل طبقة ثنائية دهنية.
- تتمتع هذه التقنية بسلوك مرحلة فريد مفيد للفحص عالي الإنتاجية.
- نجحت في إنتاج هياكل عالية الدقة من مصادر مختلفة.
- يمكن استخدام معدات المختبر القياسية لتجارب التبلور.
غرض الدراسة
- لتظهر إعداد البيكليس لتبلور البروتينات الغشائية.
- لتظهر كيفية دمج البروتينات الغشائية في خليط البيكليس.
- لتحدد عملية إعداد تجارب التبلور.
الطرق المستخدمة
- تحضير البيكليس عن طريق مزج الدهني والمنظف.
- دمج البروتينات الغشائية المنقاة في خليط البيكليس.
- تجارب التبلور التي أجريت باستخدام روبوت نانولتر.
- الفحص البصري للبلورات باستخدام مجهر ضوئي قياسي.
النتائج الرئيسية
- تكوين ناجح للبلورات البروتينية من خليط البيكليس.
- يمكن استخراج البلورات وتجميدها لجمع البيانات.
- تتيح التقنية الاستخدام الفعال لمعدات المختبر القياسية.
- تعزز القدرات عالية الإنتاجية عملية التبلور.
الاستنتاجات
- توفر البيكليس وسطًا قابلاً للتطبيق لتبلور البروتينات الغشائية.
- تبسط الطريقة انتقال البروتينات من المنظفات إلى البيئات الدهنية.
- يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى تحسين تحديد البنية للبروتينات الغشائية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Membrane protein crystallization remains a bottleneck in structure-based drug discovery due to protein hydrophobicity and instability in detergent micelles. The lipidic bicelle method provides a more native-like lipid environment that improves protein stability and crystal quality, enabling reliable structural data for target validation. This approach supports early-stage mechanistic de-risking by facilitating high-resolution insights into drug-binding pockets and conformational states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables structural determination of membrane proteins in a lipidic milieu that better preserves native conformation and ligand-binding sites.
- Operational Value: Reduces reliance on extensive detergent screening by providing a standardized lipidic matrix for crystallization trials.
- Predictive Value: High-quality crystals support accurate modeling of protein-ligand interactions, improving confidence in target engagement hypotheses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces diffraction-quality crystals that enable atomic-level resolution for structure-guided drug design.
- Operational Value: Compatible with standard nanoliter liquid-handling robotics, allowing integration into existing high-throughput crystallization pipelines.
- Scalability: Low viscosity of bicelle-protein mixtures facilitates automated dispensing and reduces technical barriers to automation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Structures obtained via bicelle crystallization inform the design of selective inhibitors with improved pharmacokinetic profiles.
- Mechanistic De-risking: Enables visualization of conformational states relevant to allosteric modulation and gating mechanisms.
- Preclinical Model Relevance: Supports structure-based optimization of leads targeting disease-associated membrane proteins from diverse organisms.
Pipeline & Workflow Integration
The bicelle method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing structural data that informs medicinal chemistry and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of membrane protein architecture and ligand-binding sites in a near-native lipid environment.
- Screening: Generates crystallization conditions compatible with robotic screening, increasing throughput and condition coverage.
- Analytics: Yields X-ray diffraction data that provides electron density maps for accurate model building and ligand pose validation.
- Translational Research: Connects atomic structures to functional assays, enabling correlation of binding affinity with structural perturbations.
- Enterprise Reuse: Bicelle formulations can be standardized and stored for repeated use across multiple membrane protein targets, reducing reagent variability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves success rate of membrane protein crystallization by mimicking the lipid bilayer environment.
- Operational Value: Uses standard laboratory equipment and robotics, eliminating need for specialized high-viscosity handling tools.
- Strategic Value: Accelerates lead identification by reducing time-to-structure for challenging membrane protein targets.
- Portfolio Impact: Enables data-driven go/no-go decisions based on high-confidence structural insights into target druggability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling and membrane protein biochemistry to optimize lipid:detergent ratios and protein incorporation.
- Depends on access to crystallization robotics and controlled-temperature incubation systems for trial setup and monitoring.
- Necessitates standardization of bicelle preparation protocols across teams to ensure reproducibility of crystallization outcomes.
- Involves optimization of lipid composition (e.g., DMPC:CHAPSO ratios) and precipitant screening to match protein-specific crystallization needs.
- Limited by the need for cold handling during preparation to maintain bicelle fluidity and prevent premature phase transitions.
