من التركيبات لبلورات - نحو تحديد هيكل β برميل الخارجي بروتينات الغشاء

الهدف العام من هذه الطريقة هو الحصول على كميات بالميليغرام من بروتينات برميل بيتا (beta-barrel) للغشاء الخارجي التي يمكن بلورتها وحيودها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال طي بروتينات الغشاء ونقلها، مثل كيفية إدراج بروتينات برميل بيتا في أغشية الخلايا. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها طريقة قوية وفعالة لاستخلاص بروتينات برميل بيتا.

بشكل عام، سيواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات، لأن اختيار المنظفات لعمليات التنقية والبلورة وإزالة الانكسار أمر ينطوي على تحديات. سيقوم جيريمي غيرين، وهو باحث ما بعد الدكتوراه من مختبر سوزان بوكانان، بشرح الإجراء، بالإضافة إليّ وإلى زملائي في المختبر. ابدأ هذا الإجراء ببناء ناقل تعبير T7 يحتوي على جين بروتين الغشاء الخارجي المستهدف (OMP) المُحسن كودونياً، وذلك للتعبير الحي (in vivo) في الغشاء كما هو موضح في البروتوكول النصي.

قم بتحويل البناء الجيني إلى سلالة بكتيرية تعبيرية من أجل التعبير الجيني عن طريق نقل 1 µL من البلازميد إلى 50 µL من خلايا BL21(DE3) ذات الكفاءة الكيميائية، واخلطها برفق عن طريق السحب والدفع بالماصة. تُحضن العينة على الثلج لمدة 30 دقيقة. وبعد التحضين، يتم إجراء صدمة حرارية عند 42 °C لمدة 30 ثانية باستخدام حمام مائي، ثم توضع مرة أخرى على الثلج لمدة دقيقة واحدة.

أضف 1 mL من وسط SOC المُدفأ مسبقاً ورُجّ عند 37 °C لمدة ساعة واحدة بسرعة 1000 RPM باستخدام حاضنة رجاج مكتبية. بعد التحضين، قم بنشر 100 µL من الخلايا على أطباق LB Agar تحتوي على المضاد الحيوي المناسب، وحضنها طوال الليل عند 37 °C في وضع مقلوب. بعد ذلك، قم بإجراء اختبارات تعبير على نطاق صغير عن طريق تلقيح 5 mL من مزرعة LB تحتوي على مضاد حيوي باستخدام مستعمرة واحدة.

كرر العملية لخمس إلى 10 مستعمرات. قم بالتحضين عند 37 درجة مئوية مع الرج حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى 0.6 تقريبًا. حفز تعبير OMP المستهدف بإضافة 5 µL من IPTG بتركيز 1 M إلى كل أنبوب مزرعة، واتركها تنمو لمدة ساعة إلى ساعتين إضافيتين.

لمقارنة مستويات التعبير لجميع المستعمرات، قم بطرد مركزي لمليلتر واحد من كل مزرعة لمدة دقيقة واحدة بسرعة 15,000 ×g، باستخدام جهاز طرد مركزي دقيق. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 200 µL من منظم تحميل SDS-PAGE بتركيز 1X. يتم التسخين عند 100 °C لمدة خمس دقائق، ثم يتم إجراء الطرد المركزي مرة أخرى بسرعة 15,000 ×g لمدة خمس دقائق.

قم بتحليل العينات باستخدام تقنية SDS-PAGE عن طريق نقل 20 µL إلى كل بئر في هلام بنسبة 10%. قم بتشغيل الهلام لمدة 35 دقيقة عند جهد ثابت قدره 200 فولت. وأخيراً، قم بحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 6000 ×g لمدة عشر دقائق.

أعد تعليق الخلايا في منظم التحلل (lysis buffer) بنسبة 5 mL لكل جرام من عجينة الخلايا. قم بتحليل الخلايا باستخدام المكبس الفرنسي (French press) أو مجانس الخلايا. بعد ذلك، قم بطرد الخلايا المتحللة مركزياً بسرعة 15,000 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C لإزالة الخلايا غير المتحللة وحطام الخلايا.

انقل السائل الطافي إلى أنبوب نظيف، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى بسرعة عالية لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C. تكون الراسبة الناتجة هي جزء الغشاء الذي يحتوي على البروتين المستهدف. أعد تعليق جزء الغشاء باستخدام مجانس داونس (Dounce homogenizer).

أولاً، قم بنقل الأغشية ثم أضف محلول الإذابة المنظف (solubilization buffer) بتركيز 2X بدون منظف. صب الأغشية المعاد تعليقها في مخبار مدرج وأضف الماء حتى الوصول إلى التركيز النهائي 1X لمحلول الإذابة المنظف. انقل العينة إلى دورق كيميائي وأضف المنظف ببطء حتى الوصول إلى تركيز نهائي يعادل 10 أضعاف التركيز الميسلي الحرج (critical micelle concentration) تقريباً.

بعد ذلك، يتم التقليب لمدة تتراوح من 0.5 إلى 16 ساعة عند درجة حرارة 4 °C، وذلك اعتماداً على مدى سهولة استخلاص البروتين المستهدف من الأغشية. وأخيراً، يتم طرد العينة المذابة مركزياً عند 300,000 ×g لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C. يتم تحضير عمود IMAC بسعة 1 إلى 5 mL أو استخدام عمود مُعبأ مسبقاً.

أجرِ خطوات الكروماتوغرافيا اللاحقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. اغسل العمود بالماء لإزالة أي آثار للمواد الحافظة. وفي حال استخدام نظام تنقية آلي، قم بتركيب العمود وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بتحضير 500 milliliters من منظم IMAC buffer A بدون imidizole و 250 millilliters من منظم IMAC buffer B بتركيز one molar من imidizole. قم بموازنة عمود IMAC باستخدام 10 أحجام من العمود من منظم IMAC buffer A. أضف imidizole إلى عينة البروتين حتى يصل التركيز النهائي إلى 25 millimolar ثم اخلطها. بعد ذلك، قم بتحميل العينة على عمود IMAC المتوازن بمعدل تدفق قدره two milliliters في الدقيقة.

اجمع السائل النافذ. بعد ذلك، اغسل عمود الكروماتوغرافيا بتقارب الأيونات المعدنية (IMAC) بخمسة أحجام من العمود من تركيزات متزايدة من الإيميدازول، باستخدام المنظم B. اجمع نواتج الغسل في أجزاء سعة 2 mL. استخلص العينة بتركيز نهائي قدره 250 mM لخمسة أحجام من العمود، واجمع العينة المستخلصة في أجزاء سعة 2 mL.

قم بتحليل السائل المتدفق، وأجزاء الغسيل، وأجزاء الشطف باستخدام تحليل SDS-PAGE بناءً على امتصاصيتها عند 280 نانومتر. قم بتجميع الأجزاء التي تحتوي على بروتين OMP من نوع beta-barrel المستهدف كما تم التحقق منه بواسطة تحليل SDS-PAGE. بعد ذلك، قم بإزالة وسم 6X histadine عن طريق إضافة إنزيم TEV protease إلى العينة المجمعة وتحضينها طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية مع الرج اللطيف.

قم بتحميل محلول البروتياز الخاص بالعينة على عمود IMAC مرة أخرى لفصل بروتين OMP المستهدف ذو البنية البرميلية بيتا (beta-barrel) عن الوسوم المقطوعة وأي أجزاء غير مقطوعة من العينة. ستحتوي المادة المارة (flow-through) على العينة المقطوعة التي تفتقر إلى الوسم. وللتحضير لعملية البلورة، قم بتحميل العينة على عمود ترشيح هلامي (gel filtration column) في محلول منظم يحتوي على المنظف الذي سيُستخدم في البلورة.

اجمع أجزاءً بحجم 1 milliliter وقم بتحليلها باستخدام SDS-PAGE بناءً على امتصاصيتها عند 280 nanometers. ادمج الأجزاء التي تحتوي على البروتين المستهدف، ثم قم بتركيزها لتصل إلى حوالي 10 milligrams per milliliter تقريبًا. وقبل تحضير العينات، قم بتجميع جهاز الفصل الكهربائي للهلام.

استخدم منظم تشغيل الهلام المبرد مسبقاً أو قم بتشغيل الهلام في الغرفة الباردة. قم بترشيح العينة باستخدام مرشح طرد مركزي بمسامية 0.22 micron لإزالة الجسيمات والترسبات. بعد ذلك، انقل 0.25 microliters من العينة بواسطة الماصة إلى أنبوبي طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter.

ضع ملصقًا على أحدهما باسم "boiled" والآخر باسم "RT". بعد ذلك، أضف 9.75 µL من منظم العينة (sample buffer) إلى كل أنبوب واخلطهما بواسطة الماصة. أضف أيضًا 10 µL من منظم تحميل 2X SDS loading buffer إلى كلتا العينتين واخلطهما برفق بواسطة الماصة. قم بغلي العينة "boiled" عند 95 °C لمدة خمس دقائق، بينما اترك العينة "RT" في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، قم بطرد العينة المغلية مركزياً لفترة وجيزة. ثم، قم بتحميل 20 µL من كلتا العينتين على هلام الناتيف (native gel) المجهز مسبقاً. بعد تشغيل الهلام لمدة 60 دقيقة عند جهد ثابت قدره 150 فولت، قم بإزالة الهلام ونقعه في محلول التلوين لتصوير النتائج.

باشر بإجراء تجارب البلورة في المنظفات، والخلايا الثنائية، والطور المكعب الليبيدي، باستخدام طرق JoVE المنشورة سابقاً. يتم فحص رؤوس البلورة تحت مجهر الأشعة فوق البنفسجية (UV) للتحقق من أن البلورات هي بالفعل بروتينات وليست أملاحاً أو ليبيدات أو منظفات. تُفحص البلورات الواعدة باستخدام مصدر أشعة سينية منزلي أو في السنكروترون لمعرفة ما إذا كانت البلورات تسبب حيوداً للأشعة.

بعد جمع البيانات من البلورات التي تظهر حيوداً جيداً، قم بمعالجة البيانات باستخدام برنامج معالجة، مثل HKL2000. انقل الملفات الناتجة إلى مجموعة برامج لتحديد البنية، مثل Phoenix Suit، وقم بإجراء الاستبدال الجزيئي من أجل تحديد الأطوار الأولية وبنية البروتين. وقد تم تحديد البنية البلورية لـ YIUR بدقة 2.6 Angstrom باستخدام هذه الطريقة.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون أسبوعين، إذا نُفذت بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن بروتينات الغشاء الخارجي البكتيرية وتنقيتها من أجل الدراسات التركيبية.