تقييم المحاكمات تبلور ثنائي الأبعاد للبروتينات غشاء الصغيرة للدراسات البيولوجيا الهيكلية التي البلوريات الكترون

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد أفضل ظروف التبلور ثنائي الأبعاد للتحديد المنظم لبروتينات الغشاء عن طريق علم البلورات الإلكترونية. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخدام منظف متوافق أولا أثناء التنقية لإذابة البروتين من طبقة الدهون الثنائية الأصلية. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إضافة الدهون الخارجية وإزالة المنظفات عن طريق غسيل الكلى لخليط منظفات الدهون البروتينية ، مما ينتج عنه بلورات ثنائية الأبعاد في ظل ظروف خاضعة للرقابة بعناية.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي وميض العينات وتجميدها في حالة الجسم الزجاجي. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي جمع البيانات عن طريق التبريد. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تؤدي إلى الهيكل النهائي للبروتين من خلال معالجة الصور الحسابية للبيانات.

مرحبا ، أنا من المختبر. أنا دفن ه مدرسة الأحياء في معهد جورجيا للتكنولوجيا. مرحبا ، أنا خائفة من تينا

أنا من مختبر بيري في كلية الكيمياء والكيمياء الحيوية ومختبر شميدت كراي في كلية الأحياء في معهد جورجيا للتكنولوجيا. وأنا مات جونسون من مختبر إنجلبورغ شميدت كراي في كلية الأحياء في معهد جورجيا للتكنولوجيا. سنعرض لك اليوم إجراء لتقييم تجارب الكورال ثنائية الأبعاد من قبلهم.

نستخدم هذا البروتوكول في مختبرنا لتحديد ظروف التبلور ثنائي الأبعاد وتحسينها. لذلك دعونا نبدأ لبدء هذا الإجراء ، يتم تحضير عينات ملطخة سالبا على النظارات المجهرية الإلكترونية لنقل النحاس 400 الشبكي المطلي بالكربون أو شبكات TEM. ماصة ميكرولترين من عينة الجسيمات الشحمية البروتيا تحت شبكة TEM مغطاة بالكربون وتحتضن لمدة 60 ثانية.

إذا لم يتم توزيع العينة بالتساوي، فقم بتمريرها برفق بجانب طرف الماصة. الكتلة التالية من الحافة بقطعة ممزقة من ورق الترشيح واتمان رقم أربعة. هذا يضمن الإزالة المثلى للسائل دون الإزالة المفرطة للجسيمات الشحمية البروتيا ، ويساعد في الحفاظ على طبقة الكربون الرقيقة.

مباشرة بعد النشاف. ضع ميكرولترين من صبغة أسيتات المبولة بنسبة 1٪ بعد 30 ثانية ، وصمة عار من حافة الشبكة. مرة أخرى ، إذا كانت العينة تحتوي على تركيزات عالية من الجلسرين اللزج أو السكروز ، عادة في حدود 10 إلى 20٪ ، يمكن أن تكون عدة دورات من غسل الشبكة باستخدام مخزن مؤقت خال من الجلسرين أو السكروز قبل التلوين السلبي ، يمكن أن يكون من المفيد السماح بالتلوين المناسب بمحلول المبولة.

بمجرد إعداد الشبكات ، يتم استخدام المجهر الإلكتروني لتصور العينة عند التكبير المنخفض لتقييم توزيع حدوث الغشاء ومورفولوجيا وجودة الشبكة الشاملة. ثم يتم استخدام التكبير العالي للحصول على الصور وإجراء تحويلات RIA للصور لتحديد بلورات ثنائية الأبعاد. لبدء الشبكة المنخفضة في حامل عينة المجهر الإلكتروني ، للحصول على الانطباع الأول عن متوسط توزيع الغشاء ، استخدم تكبيرا وسيطا من 2000 إلى 10،000 x.

لاحظ مدى توزيع الأغشية ومورفولوجيتها وحجمها في دفتر ملاحظات مختبر. سجل وجهات نظر التمثيل باستخدام كاميرا CCD. بعد ذلك ، إذا لزم الأمر ، راقب العينات ذات التكبير المنخفض في حدود 400 إلى 800 x تقريبا للحصول على نظرة عامة على الشبكات.

يمكن أن يوفر هذا معلومات قيمة لتقييم إعداد الشبكة من خلال الكشف عن مشاكل تركيز العينة ، والبروتيا غير المتكافئ ، وتوزيع الجسيمات الشحمية ، والكسر الجزئي لفيلم الكربون. تحديد منطقة اهتمام الشبكة إما بتكبير منخفض أو متوسط. ثم استخدم التكبير العالي لتقييم الترتيب المحتمل في الأغشية المختلفة.

هذا أمر بالغ الأهمية في المراحل المبكرة من تجارب التبلور ثنائي الأبعاد. من أجل تحديد الجسيمات الشحمية البروتيا الواعدة ذات المناطق المرتبة جيدا والتحقق من قابلية التكاثر خلال التجارب اللاحقة لتحديد إعداد التكبير العالي الأمثل لفحص بلورات ثنائية الأبعاد تبدأ بتكبير بين 50،000 و 60،000 x. اعتمادا على أبعاد البلورة ثنائية الأبعاد وحجم خلية الوحدة ، قد يتم تقليل إعداد التكبير العالي إلى 30،000 أو رفعه إلى 80،000.

هنا في موقع مجاور إلى منطقة اهتمام الصورة ، نقوم بإلغاء التركيز بمقدار 400 نانومتر تحت الصفر أو أعلى إذا كان هناك عدم يقين بشأن ما إذا كانت منطقة الاهتمام هي بالفعل غشاء. افحص العينة بحثا عن قطع من فيلم الكربون أو MICA أو غيرها من القطع الأثرية التي يمكن الخلط بينها وبين الجسيمات الشحمية البروتيا. راقب أيضا الحواف لتمييز طي الغشاء النموذجي والتشكل.

بعد ذلك ، افحص منطقة الاهتمام بكاميرا CCD. من خلال جمع صورة CCD في إعداد التكبير العالي الأمثل ، قد لا يمكن ملاحظة شبكة بروتين غشاء أصغر أو كاره للماء في الغالب من خلال التقييم البصري لصورة CCD نفسها. في هذه الحالة ، يتم استخدام الصورة بأكملها لتحويل foer أو ft.

ومع ذلك ، إذا كانت المصفوفة المطلوبة صغيرة ، فستحتوي FT هذه على قدر كبير من الضوضاء لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء ، وتقليل حجم الصورة المعبأة ، وتحريك المربع المخفض فوق الصورة ، وأداء قدم مباشر ، وضبط وظيفة جاما ل FT الحية للتحديد الأمثل للمصفوفات المرتبة. يمكن لقيمة جاما العالية بشكل مفرط أن تحجب البقع بسبب مساهمات الضوضاء بينما ستمنع القيمة المنخفضة بشكل مفرط تحديد النقاط الأضعف. توقع أن تكون دقة بلورات 2D الملطخة سلبا حوالي 15 أنجستروم عند DFO 400 نانومتر تحت الصفر.

توقع تحديد واحد إلى ثلاثة أوامر من المواقع. لاحظ حدة البقع وأي فسيفساء. بلورات ثنائية الأبعاد لبروتين غشاء صغير يبلغ وزنه 18 كيلودالتون يصل حجمها إلى عدة ميكرونات.

البقع الموجودة على حركة FTS الحادة والتي يسهل تحديدها لصندوق FT المباشر أن الشبكة مستمرة بدون فسيفساء. يمكن تحديد شبكة بروتين أكبر مع مجال قابل للذوبان أكثر اتساعا على الشاشة الصغيرة لمجموعة صور T-E-M-C-C-D و FT ضرورية للحصول على تقييم أفضل لجودة الشبكة ، بما في ذلك خصائص مثل ضوضاء الفسيفساء في FT لبروتيا غير مرتبة. قد يتم الخلط بين الجسيمات الشحمية ونقاط الضعف لتحديد ما إذا كانت البقع ناتجة عن بلورات البروتين ثنائية الأبعاد الصغيرة أو الضوضاء.

حرك الصندوق للقدم المباشر. إذا اختفت البقع على الفور ، فهي ضوضاء ، ولكن إذا تركت دون تغيير حتى على مساحة صغيرة ، فمن المحتمل أن تكون البلورات موجودة لأن بلورات الدهون تظهر مورفولوجيا وقدما مميزا. يمكن أيضا التعرف على بلورات الدهون هذه عن طريق الفحص البصري للصورة وأحجام خلايا الوحدة المتسقة.

يمكن أن يحدث هطول الأمطار في التجارب الأولية. يستخدم الفحص عند التكبير العالي للتمييز بين ترسيب البروتين ومجاميع الدهون. في حالة المجاميع الدهنية ، ربما تكون إعادة التكوين قد حدثت بالفعل وستتطلب التجارب التالية فقط تعديل المعلمات اللازمة لزيادة حجم الغشاء وإنتاج النظام بدلا من إحداث إعادة التكوين عند 30،000 إلى 50،000 ×.

تكشف حواف هذه الهياكل المظلمة أنها تتكون من أغشية بدون بروتين. ستحتوي عينات هطول الأمطار في ظل الظروف المثلى على نسبة كبيرة من بلورات ثنائية الأبعاد. ليس من الضروري أن تهدف إلى مظهر متجانس للأغشية حيث يتم اختيار أكبر بلورات ثنائية الأبعاد وأكثرها ترتيبا بصريا لجمع البيانات.

سيتم التعرف على هذه الأنواع من العينات بسهولة عند استخدام هذه العينات للتبلور لجمع بيانات cryo EM للحصول على أكبر عدد ممكن من الصور عالية الدقة. سنوضح لك فقط كيفية فحص البلورة ثنائية الأبعاد لبروتينات الذاكرة الصغيرة بواسطة TEM عند القيام بهذا الإجراء. من المهم أن تتذكر أن تكون دقيقا حتى لا تتغاضى عن حالة التبلور الواعدة لأنك استثمرت بالفعل قدرا كبيرا من الوقت والجهد حتى هذه اللحظة.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.