إعادة تشغيل مباشرة من شوكة المتماثل المتوقفة من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي هيد اون

مصير replisome عقب اصطدامها وجها لوجه بوليميريز الحمض النووي الريبي (RNAP) غير معروف. نجد أن الأكشاك replisome عند اصطدامها RNAP وجها لوجه ، ولكن بعد استئناف استطالة تهجير RNAP من الحمض النووي. MFD يعزز إعادة تشغيل النسخ المتماثل من خلال تسهيل تهجير RNAP بعد الاصطدام.

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة مصير منطقة Repli و RNA polymerase أو RNAP بعد الاصطدام وجها لوجه. يتم تحقيق ذلك عن طريق تجميع مركب النسخ أولا على الحمض النووي الحيوي وتثبيته على قرص Stripp والخرز ، مما سيؤدي إلى توقف مركب استطالة RNAP. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في ربط الحمض النووي المتشعب الذي يحتاج مسبقا إلى مجمع استطالة RNAP لتشكيل شوكة النسخ المتماثل في اتجاه مجرى RNAP وجها لوجه.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تجميع منطقة الرد وبدء تخليق الخيوط الرائدة في شوكة النسخ المتماثل. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في عزل الحمض النووي عن الخرز المغناطيسي وتنقية الحمض النووي عبر عمود تنظيف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر أن الروسو يتوقف عند الاصطدام بمركب النسخ وجها لوجه من خلال هلام زراعي قلوي لمنتجات الحمض النووي المنقاة ذات العلامات الراديوية.

مرحبا ، أنا ريتشارد بوميرانس من مختبر مايك أودونيل في جامعة روكفلر. سأوضح اليوم الإجراء الخاص بك كيفية إجراء تصادم الريبوسوم برأس على بوليميراز الحمض النووي الريبي في الطور الصلب. أستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة كيفية تأثر عملية النسخ المتماثل بمجمعات النسخ على طول الحمض النووي.

لذلك دعونا نبدأ. لبدء مزيج البروتوكول هذا ، يقوم إنزيم RNAP holo بقالب DNA 3.6 كيلوبايت يحتوي على محفز T seven A واحد في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت A يحتضن الخليط لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة لمدة 10 دقائق ، أضف الريبونوكليوتيدات الأدينوزين ، وثلاثي الفوسفات ، وفوسفات السيتيدين ، وأليل عدن يوريدين ، مما سيحد من تخليق الحمض النووي الريبي إلى 20 نيوكليوتيد.

احتضن المحلول لمدة 10 دقائق إضافية عند 37 درجة مئوية لشل حركة مركب استطالة RN المتوقفة على الخرز. أضف المحلول إلى الخرز المغناطيسي المطلي بالستربتافيدين. دع الخليط يحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بتنقية مركب استطالة RNAP المتوقف عن طريق غسل الخرزات ب 0.9 مل من المحلول الإضافي عالي الملح. لإزالة مجمعات R-N-A-P-D-N-A غير المحددة بعد كل غسلة ، قم بإزالة المادة الطافية عن طريق الفصل المغناطيسي. يجب تكرار هذا الغسيل خمس مرات.

ثم يجب غسل الخرزات مرتين أخريين باستخدام 0.9 مل من المخزن المؤقت A.بعد الغسيل النهائي ، يمكن تجميع شوكة النسخ المتماثل في اتجاه مجرى النهر من RNAP Resus ، وتعليق الشريط المغناطيسي إلى حبات واضحة متصلة بمركب استطالة RNAP المتوقفة في 100 ميكرولتر من New England Biolabs buffer four. بعد ذلك ، أضف 10 وحدات من فوسفاتيز الجمبري القلوي أو SAP واحد ، واحتضن العينة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 0.9 مل من المخزن المؤقت A.ثم أعد تعليق الخرزات في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت السريع لتفاعل الربط T الأربعة.

أضف ميكرولترين من T four ligase السريع والحمض النووي المتشعب الذي تحتاج مسبقا ، واحتضن المحلول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، اغسل الخرزات ثلاث مرات أخرى باستخدام 0.9 مل من المخزن المؤقت A مزيج hexamer ، و DNAB helicase مع البكتيريا المغناطيسية A والخرز المتصل بمركب استطالة RNAP المتوقفة وشوكة النسخ المتماثل في اتجاه مجرى النهر. تحضير المحلول في 150 ميكرولتر من العازلة A واحتضانه لمدة 30 ثانية عند 23 درجة مئوية.

بعد الحضانة القصيرة 32 عند 23 درجة مئوية. في البوليميراز ثلاثة مشبك بيتا ، A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P ألفا P 32 المسمى DGTP و alpha P 32 المسمى DATP بحجم 200 ميكرولتر. احتضان العينة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

ابدأ النسخ المتماثل عن طريق إضافة بروتين ربط الحمض النووي أحادي الشريطة DCTP و DTTP. أضف أيضا alpha P 32 ، المسمى DTTP و DCTP إلى الحجم النهائي البالغ 250 ميكرولترا. بعد 10 دقائق ، قم بإنهاء التفاعلات بإضافة 12 ميكرولتر من 0.5 مولي EDTA.

بعد ذلك ، قم بغلي حبات strp din لتحرير الحمض النووي من الخرز. قم بإزالة أي حمض نووي متبقي عن طريق معالجة الخرزات بالبروتيناز K لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية. اغلي الخرزات مرة أخرى وقم بإزالة المادة الطافية عن طريق الفصل المغناطيسي.

بتنقية المادة الطافية المركبة التي تحتوي على الحمض النووي باستخدام مجموعة تنظيف Kyogen PCR. أخيرا ، قم بتحليل منتجات الحمض النووي الملصقات الراديوية المنقاة في هلام قلوية ، وعادة ما ينتج عن تصادم المنطقة برأس على RNAP منتجين بطول 2.5 كيلوبايت و 3.6 كيلوبايت. يمثل المنتج 2.5 كيلوبايت طول الحمض النووي من الشوكة إلى RNAP المتوقف.

ينتج هذا عن توقف الرد عند الاصطدام ب RNAP. يمثل المنتج الذي تبلغ سعته 3.6 كيلوبايت DNA كامل الطول وينتج إما عن الإشغال غير الكامل للمروج بواسطة RNAP أو قراءة الرد الجزئي ل RNAP وجها لوجه. توضح النتيجة الجيدة أنه يتم إنتاج ما يقرب من 50٪ من الحمض النووي الكامل الطول.

ومع ذلك ، في بعض الحالات ، يحدث إشغال أقل للمحفز بواسطة RNAP ولوحظت نسبة أعلى من الحمض النووي الكامل الطول. وذلك لأن عددا أكبر من مناطق التكرار لا يواجه رأسا على تكرار RNAP في حالة عدم وجود نتائج RNAP متوقفة في الحمض النووي الكامل الطول فقط ، لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء النسخ المتماثل والمرحلة الصلبة في وجود مركب استطالة بوليميراز الحمض النووي الريبي المتوقف المرتبط بالحمض النووي. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم غسل مركب النسخ المتوقف بمحلول عالي لإزالة بوليميراز الحمض النووي الريبي الزائد ، والذي يرتبط بشكل غير محدد بالحمض النووي ويمنع التكاثر.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.