إعادة تشغيل مباشرة من شوكة المتماثل المتوقفة من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي هيد اون

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة مصير منطقة التضاعف (Repli zone) وبوليميراز الحمض النووي الريبوزي أو RNAP بعد حدوث تصادم وجهًا لوجه. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجميع معقد النسخ على DNA مُبايوتَن (biotinylated DNA) وتثبيته على أقراص وخرز Stripp، مما سيؤدي إلى توقف معقد استطالة RNAP. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في ربط DNA متشعب مسبق التجهيز بمعقد استطالة RNAP لتكوين شوكة تضاعف في اتجاه المصب من RNAP المتصادم وجهًا لوجه.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تجميع منطقة التضاعف وبدء تخليق الشريط الرائد عند شوكة التضاعف. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي عزل الـ DNA من الحبيبات المغناطيسية وتنقيته باستخدام عمود تنقية PCR. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر توقف الـ roso عند التصادم مع معقد النسخ المتقابل من خلال استخدام هلام agarose قلوي لمنتجات الـ DNA المنقاة والموسومة إشعاعياً.

مرحباً، أنا ريتشارد بوميرانس من مختبر مايك أودونيل بجامعة روكفلر. سأعرض لكم اليوم إجراء كيفية إحداث تصادم بين الريبوسوم وبوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA polymerase) وجهاً لوجه في الطور الصلب. أستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة كيفية تأثر عملية التضاعف بمعقدات النسخ على طول DNA.

لنبدأ الآن. لبدء هذا البروتوكول، اخلط إنزيم RNAP holo مع قالب DNA بطول 3.6 KB مُبَيوتَن (biotinylated) يحتوي على محفز T seven A one في 100 µL من المنظم a، ثم حضن الخليط لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 37 °C. بعد حضن لمدة 10 دقائق، أضف الريبونوكليوتيدات adenosine triphosphate و cytidine phosphate و Aden allele uridine، والتي ستحد من تخليق RNA إلى 20 نوكليوتيد.

يُحضن المحلول لمدة 10 دقائق إضافية عند 37 درجة مئوية لتثبيت معقد استطالة RN ape المتوقف على الخرزات. يُضاف المحلول إلى خرزات مغناطيسية مغلفة بالستريبتavidin. يُترك الخليط ليُحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بتنقية معقد استطالة RNAP المتوقف والمثبَّت عن طريق غسل الخرز بـ 0.9 milliliters من محلول منظم عالي الملوحة. ولإزالة معقدات R-N-A-P-D-N-A غير النوعية بعد كل عملية غسل، قم بإزالة الطافي باستخدام الفصل المغناطيسي. يجب تكرار عملية الغسل هذه خمس مرات.

بعد ذلك، يجب غسل الخرزات مرتين إضافيتين باستخدام 0.9 milliliters من المنظم A. بعد الغسل النهائي، يمكن تجميع شوكة التضاعف في المصب لتشكيل شوكة تضاعف في المصب من RNAP Resus head-On، وقم بتعليق الشريط المغناطيسي لإظهار الخرزات الملتصقة بمعقد استطالة RNAP المتوقف في 100 microliters من New England Biolabs buffer four. بعد ذلك، أضف 10 units من shrimp alkaline phosphatase أو SAP one، واحضن العينة لمدة 10 minutes عند 37 degrees Celsius. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 0.9 milliliters من المنظم A. ثم أعد تعليق الخرزات في 50 microliters من quick T four ligation reaction buffer.

أضف 2 µL من quick T4 ligase وpre-need forked DNA، ثم حضن المحلول لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وأخيراً، اغسل الخرزات ثلاث مرات إضافية باستخدام 0.9 mL من buffer A. اخلط hexamer DNAB helicase مع magnetic strep A beads المرتبطة بـ RNAP elongation complex المتوقف وreplication fork في المصب. حضّر المحلول في 150 µL من buffer A وحضنه لمدة 30 ثانية عند 23 °C.

بعد فترة التحضين القصيرة الثانية والثلاثين عند 23 درجة Celsius. أضف إلى polymerase three beta clamp كل من A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P و DGTP المسمى بـ alpha P 32 و DATP المسمى بـ alpha P 32 حتى يصل الحجم إلى 200 microliters. حضّن العينة لمدة خمس دقائق عند 37 درجة Celsius.

ابدأ عملية التضاعف بإضافة البروتين الرابط للحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين أحادي السلسلة DCTP و DTTP. أضف أيضاً alpha P 32، و DTTP و DCTP المسمى إشعاعياً، حتى يصل الحجم النهائي إلى 250 microliters. بعد 10 دقائق، أوقف التفاعلات بإضافة 12 microliters من EDTA بتركيز 0.5 molar.

بعد ذلك، قم بغلي خرزات strp din لتحرير الـ DNA منها. تخلص من أي DNA متبقٍ عن طريق معالجة الخرزات ببروتينيز K لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية. اغْلِ الخرزات مرة أخرى وأزل الطافي عن طريق الفصل المغناطيسي.

قم بتنقية السائل الطافي المجمع الذي يحتوي على DNA باستخدام طقم تنقية PCR من شركة Kyogen. وأخيراً، قم بتحليل نواتج DNA المنقاة والموسومة إشعاعياً في هلام agarose قلوي. عادةً ما يؤدي تصادم المنطقة مع RNAP وجهاً لوجه إلى ظهور ناتجين بطول 2.5 KB و 3.6 KB. ويمثل الناتج الذي يبلغ طوله 2.5 KB طول DNA من الشوكة إلى RNAP المتوقف.

ينتج هذا عن توقف تضاعف الحمض النووي عند الاصطدام بإنزيم RNAP. ويمثل المنتج الذي يبلغ حجمه 3.6 KB الحمض النووي كامل الطول، وينتج إما عن عدم إشغال المحفز بشكل كامل بواسطة RNAP أو عن اجتياز جزئي للتضاعف لإنزيم RNAP في المواجهة المباشرة. وتظهر النتيجة الجيدة إنتاج ما يقرب من 50% من الحمض النووي كامل الطول.

ومع ذلك، في بعض الحالات، يحدث انشغال أقل للمُحفز بواسطة RNAP ويُلاحظ وجود نسبة أعلى من الحمض النووي DNA كامل الطول. ويعود ذلك إلى أن مجموعة أكبر من مناطق التضاعف لا تواجه تضاعفاً وجهاً لوجه مع RNAP، حيث يؤدي غياب RNAP المتوقف إلى إنتاج DNA كامل الطول فقط. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء التضاعف والطور الصلب في وجود معقد استطالة RNA polymerase متوقف ومرتبط بالـ DNA. وعند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم غسل معقد النسخ المتوقف بملح عالي التركيز لإزالة RNA polymerase الزائد، الذي يرتبط بالـ DNA بشكل غير محدد ويثبط عملية التضاعف.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.