منقوشة ضوئي مع أجهزة رقمية Micromirror بالتحقيق في تكامل شجيرى عبر نقاط فرع

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحكم في أنماط الضوء المعقدة زمنياً ومكانياً بحيث يمكن استخدامها لتحفيز الخلايا العصبية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق وضع شريحة DMD في مستوى صورة مترافق مناسب في المسار البصري للمجهر. أما الخطوة الثانية من الإجراء فتتمثل في إضاءة شريحة DMD بشكل صحيح باستخدام مصدر ضوئي مكثف مثل الليزر.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إزالة تأثير التبقيع الناتج عن الإضاءة المترابطة. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي دمج واجهة مستخدم رسومية للتحكم في شريحة DMD. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تظهر أن التجارب التي كان من الصعب إنجازها سابقاً أصبح من الممكن الآن إتمامها بسهولة نسبية من خلال التحلل متعدد المواقع للنواقل العصبية المحبوسة باستخدام نظام DMD.

مرحباً، أنا مايكل محمد من مختبر الدكتورة شامان تانغ في قسم أمراض الأعصاب بجامعة ميريلاند. سنعرض لكم اليوم إجراءً لإنشاء أنماط معقدة من الإزالة في مجهر بصري. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التكامل الشجيري.

لنبدأ الآن. سيوضح هذا البروتوكول كيفية تشغيل نظام إضاءة بجهاز المرايا الدقيقة الرقمي أو DMD المستخدم في أبحاث العلوم العصبية التجريبية. الـ DMD عبارة عن شريحة أشباه موصلات بصرية تحتوي على عدة مئات الآلاف من المرايا المجهرية القابلة للتحريك والمرتبة في مصفوفة مستطيلة على سطحها، حيث يتوافق موضع كل مرآة مع بكسل واحد من الصورة.

يمكن التحكم في كل مرآة بشكل فردي للإمالة بين اتجاهين. في وضع الإغلاق (off)، يتم توجيه الضوء بعيداً عن المحور البصري لإضاءة العينة. أما في وضع التشغيل (on)، فيتم توجيه الضوء على طول المحور البصري.

يُعد جهاز DMD مناسباً جداً لعمليات التحلل لأنه يتحمل الأشعة فوق البنفسجية عالية الكثافة، ويولد نسب تباين عالية بين البكسلات المضاءة والمظلمة، كما يمكنه التبديل بين هاتين الحالتين في غضون عشرات الميكروثانية. ويتم تعزيز استخدام أجهزة DMD في الأبحاث الطبية الحيوية من خلال الانتشار الواسع لبرمجيات وأجهزة معالجة الصور، والاهتمام التجاري في مجال عرض الصور. وتُسوق شركة Texas Instruments المكونات النمطية على شكل مجموعات اكتشاف DLP التي توفر المشغلات الإلكترونية الداعمة لتهيئة جهاز DMD للعمل ضمن نظام مجهري.

يجب استيعاب المفاهيم الأساسية المتعلقة ببصريات المجهر. يتكون المجهر الفلوري الحديث الأساسي من مسار للتصوير ومسار للإضاءة. ويتألف من عدسة شيئية، ومكعب ترشيح، وعدستين أنبوبيتين متميزتين لمساري التصوير والإضاءة.

تم تصميم المجهر بحيث يحتوي على مواضع تكون مترافقة مع مستوى صورة العينة، حيث تظهر الأجسام التي تكون بؤرتها مضبوطة عند مستوى العينة مضبوطة البؤرة أيضاً عند مستويات الصور المترافقة هذه. وينتج عن هذا المفهوم أن أي صورة مضيئة يتم إنشاؤها عند مستوى الصورة المترافق سيتم إسقاطها أيضاً بوضوح على مستوى صورة العينة. تُستخدم هذه الاستراتيجية لإسقاط نمط إضاءة مولد حاسوبياً على العينة.

يعمل شعاع الليزر كمصدر ضوئي شديد السطوع يقوم بإضاءة النمط الذي تنفذه المرايا الدقيقة الموجودة على شرائح DMD والمتموضعة في مستوى صورة مترافق. يعتمد تصميم نظام إضاءة DMD على أضواء الاستثارة المستخدمة في تجارب علم البصريات الوراثي، والتي تستخدم الضوء في الطول الموجي المرئي. ويمكن تمرير النمط المضاء عبر مسار الكاميرا.

وبناءً على ذلك، يمكن ببساطة تركيب شريحة DMD على أحد منفذي الكاميرا في وحدة منفذ الكاميرا المزدوجة. وعلى العكس من ذلك، بالنسبة للتجارب التي تستخدم الضوء في نطاق UV، مثل تحلل المركبات المقيدة، يجب تمرير الضوء عبر مسار الإضاءة فوق الخلوية (epi illumination) وإنشاء مستوى صورة مترافق يكون الوصول إليه أكثر سهولة. ويعود ذلك إلى أن عدسة أنبوب التصوير غير مصممة لنقل أشعة UV.

بدلاً من ذلك، تُستخدم عدسة أنبوب الإضاءة لنقل الأشعة فوق البنفسجية (UV) وتؤدي دوراً ملائماً في تكوين الصورة. يمكن لكل مرآة دقيقة على جهاز DMD التبديل بين ميل إيجابي وسلبي بزاوية 12 درجة بالنسبة لمستوى الرقاقة. وبناءً على المدخلات الرقمية التي تتلقاها من الكمبيوتر، يكون محور الدوران على طول الزوايا القطرية لكل مرآة، بزاوية 45 درجة بالنسبة للجوانب المستطيلة للرقاقة.

يتم تحديد اتجاه ميل المرآة بواسطة مثلث ذهبي اللون عند إحدى الزوايا على السطح الأمامي للرقاقة. ويحدد ميل المرآة الدقيقة محاذاة زاوية الارتفاع والسمت لشعاع الإضاءة الوارد. ولإضاءة جهاز DMD، قم أولاً بضبط زاوية ارتفاع شعاع الإضاءة لتكون 24 درجة من المحور العمودي لرقاقة DMD، واضبط السمت ليكون عموديًا على محور دوران المرآة.

يعد المحاذاة الدقيقة للشعاع أمراً بالغ الأهمية للتشغيل الفعال. بالنسبة لتجارب التحلل، استخدم مصدراً لليزر لتوليد شعاع بؤري عالي الكثافة، وهو أمر ضروري لعملية فك القفص السريع.

يُستخدم هنا ليزر Nd:YAG ثلاثي التردد، يعمل بالحالة الصلبة ومضخو بصمام ثنائي شبه مستمر؛ حيث يُستخدم ليزر ذو قدرة عالية نسبياً لأن جزءاً صغيراً فقط من مخرجات الليزر يصل فعلياً إلى العينة. عند استخدام نظام DMD، يتم توجيه مخرجات الليزر إلى ليف بصري متعدد الأنماط بحيث يمكن تحديد موضعه وتوجيهه بسهولة على طول المحور الصحيح لإضاءة الـ DMD، وذلك لتوفير حل لمشكلة النمش (speckle) الناتجة عن الإضاءة المترابطة عبر نقل الضوء من خلال الليف البصري.

يتم لف الليفة حول جهاز تمديد ألياف بيزوالكتريك (pazo electric fiber stretcher) يتم تشغيله ليهتز بتردد يبلغ حوالي 40 kilohertz. ويعد التمدد المجهري لليفة كافياً لتحريك نمط البقع الضوئية (speckle pattern) عدة مرات خلال مدة مللي ثانية واحدة لكل نبضة تحفيز ضوئي، مما يؤدي بفعالية إلى القضاء على ظاهرة التبقع. وأخيراً، يتم تجميع مخرجات الليفة البصرية باستخدام عدسة شيئية لمجهر UV لإضاءة أجهزة DMD لمطابقة بكسلات CCD مع برنامج صور DMD الذي يربط مرايا DMD الفردية ببكسلات محددة في كاميرا CCD التصويرية التي تم كتابتها.

تتيح واجهة المستخدم الرسومية الموجودة في البرنامج للمستخدم تعيين توجيه مرآة DMD الذي يتوافق مع المنطقة المحددة في صورة CCD باستخدام فأرة الكمبيوتر من خلال واجهة المستخدم الرسومية. قم بتحديد موقع التحفيز الضوئي عن طريق تحريك المؤشر فوق الصورة المعروضة على شاشة الكمبيوتر، ثم انقر فوق المنطقة المحددة لبرمجة مخزن أنماط إيصال الضوء. يقوم النمط الموضع على شاشة الكمبيوتر، والذي يظهر كمجموعة من الصور المنفصلة، ببرمجة توقيت نبضات الليزر لكل نمط مكاني داخل البرنامج.

سيتكامل هذا مع برنامج الحصول على البيانات P clamp. وأخيراً، استخدم برنامج الحصول على البيانات لتنسيق توقيت إلكترونيات DMD، وبوابة الليزر، وعملية الحصول على الإشارة الكهربائية عن طريق تثبيت الرقعة (patch clamp) من العصبون المستهدف. يوضح هذا الجزء عملية معايرة لدقة النظام البصري.

يظهر الحد الأدنى لحجم البقعة كما تم قياسه من هدف فلوري. ويُقاس الدقة الفسيولوجية الفعالة من خلال سعة تدفق التيار كدالة للتحفيز الضوئي. أما بالنسبة لموضع البقعة هنا، فقد تم تحرير الغلوتامات المقيد ضوئياً بجوار فرع تغصني بقطر 2 µm.

عند تحريك البقعة بشكل متعامد عبر الموقع، توضح الاستجابات الكهربائية للتحفيز الضوئي بكثافات مختلفة. كما تظهر استجابات تثبيت الجهد كدالة لكثافة التحلل.

يمكن تنفيذ التحفيز الشجيري الموزع بسهولة باستخدام نظام يعتمد على جهاز الدستور الرقمي (DMD). هنا، تم تغيير شدة المدخلات عن طريق زيادة عدد بقع التحفيز الضوئي المحددة كدوائر على الفرعين الشجيريين. يمكن أن يكون الجمع المكاني غير خطي عبر نقاط التفرع.

وتصبح الاستجابة فائقة الخطية (super linear) بشكل متزايد مع زيادة سعات الإدخال الواصلة إلى فرعي البابين. وتوضح هذه النتائج بوضوح الطبيعة غير الخطية للجمع عبر نقاط تفرع الشجيرات العصبية. ويتم التوسط في هذه الفوق خطية بشكل كبير عن طريق مستقبلات NMDA وليس عن طريق القنوات المعتمدة على الجهد.

يمكن إثبات ذلك من خلال تطبيق اثنين من مضادات مستقبلات NMDA، حيث يؤدي كل من APV و MK 8 0 1 إلى إزالة السلوك غير الخطي إلى حد كبير. لقد عرضنا لكم للتو التصميم الأساسي والتشغيل لنظام يعتمد على DMD للتحفيز الضوئي النمطي للأنسجة العصبية. يمكن تكييف هذا النظام للتحفيز باستخدام الضوء المرئي، كما هو مستخدم في تجارب علم البصريات الوراثي (optogenetics).

ويمكن أن يكون هذا الإعداد قابلاً للتكيف مع أضواء الأشعة فوق البنفسجية القريبة المستخدمة في تحليل الخلية بالفوتون الواحد. وعند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أنه في حال استخدام ضوء بطول موجي أقل من 400 nanometers، ومع توجيه معظم الأشخاص عبر مسار الإضاءة فوق المجهرية (epi illumination path)، فإن المحاذاة الدقيقة للحزمة المضيئة ضمن نطاق درجات قليلة تعد أمراً بالغ الأهمية، وأنه في حال استخدام ضوء مترابط، يجب التخلص من تأثير التبقيع (speckling) بشكل فعال. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.