عزل الخلايا الجذعية من أنسجة العظام والعضلات الناعمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الجذعية البالغة من الأنسجة الرخوة العضلية الهيكلية مثل العضلات الهيكلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق أخذ خزعة من الأنسجة الرخوة أولا ، وإزالتها وتقطيعها جيدا. الخطوة الثانية من الإجراء هي هضم الأنسجة إنزيميا.

الخطوة الثالثة من الإجراء هي عزل الخلايا الجذعية من خلال خطوات الطلاء المسبق المتكررة. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي تحديد الخلايا الجذعية المعزولة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر السلوكيات المورفولوجية والخلوية للخلايا باستخدام التألق المناعي والفحص المجهري و / أو قياس التدفق الخلوي.

مرحبا ، أنا لي من مختبر علم الأمراض الجزيئي في قسم جراحة العظام بجامعة بيتسبرغ. سأوضح لك اليوم كيفية عزل خلية جذعية بالغة من الأنسجة الرخوة لنظام الهيكل العظمي مثل العضلات الهيكلية. مرحبا ، أنا دكتور جوني وارد.

أنا أستاذ في كلية الطب بجامعة بيتسبرغ في قسم جراحة العظام. لقد كنت أعمل ، كما تعلمون ، عن كثب مع الدكتور يونغ لي وهذه الإجراءات لعزل ، كما تعلمون ، نوع مختلف من الخلايا الجذعية من العضلات الهيكلية وتغيير الأنسجة مثل المعيار. نستخدم الإجراءات في مختبرنا لعزل الخلايا الجذعية لإجراء دراسات بحثية أساسية حول تطبيقات الطب الانتقالي.

لذلك دعونا ندرس. دع الأنسجة التي يمكن عزل الخلايا الجذعية منها تشمل الأوتار وعضلات الهيكل العظمي التي يتم حصادها من عضلات الساق أو النعل في الطرف الخلفي للفئران البرية. بعد إزالة بقايا الجلد والعظام ، ضع المناديل في طبق يحتوي على HBSS بارد مكمل بنسبة 5٪ FBS.

بعد ذلك ، ضع المنديل بشكل منفصل على أطباق مغلفة بالكولاجين تحتوي على HBSS بارد. سنستخدم أنسجة العضلات الهيكلية لتوضيح الإجراءات الأساسية لتفكك الأنسجة وهضمها. استخدم مقصا صغيرا و / أو شفرات مشرط لفرم أنسجة الهيكل العظمي في ملاط خشن ، ودرجة حموضة ، وهضم إنزيمي للأنسجة.

ابدأ بنقل ملاط أنسجة معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا إلى أنابيب منفصلة سعة 15 مليلتر في أجهزة الطرد المركزي عند حوالي 3،500 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة غسل SANE عن طريق تعليق HBSS وكرر الطرد المركزي. بعد إزالة supernat ، هضم الملاط بإضافة 10 مل من prewarm.0.2٪ كولاجيناز.

احتضان النوع 11 لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ويهز الأنابيب يدويا كل 10 دقائق عند الانتهاء من الحضانة لمدة 60 دقيقة. جهاز طرد مركزي ثم إعادة تعليق الملاط في 10 ملليلتر من محلول الفضاء DYS. احتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، مع رجه باليد كل 10 دقائق بعد 45 دقيقة من جهاز الطرد المركزي للحضانة وتعليق الملاط في 10 ملليلتر من 0.2٪ رحلات في محلول HBSS.

عادة ما نحتضن لمدة 15 إلى 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية أثناء قلب الأنابيب كل 10 دقائق ، تكتمل الحضانة. عندما يتم إطلاق عدد كاف من الخلايا المفردة من الأنسجة كما هو موضح هنا ، قم بالطرد المركزي للخلايا الناتجة وتعليق حبيبات الخلية في خمسة ملليلتر من الانتشار. يقوم PM المتوسط بفصل تعليق الخلية عن طريق تمرير المستخلص عبر سلسلة من الإبر مرتين من خلال إبرة قياس 18 ، ثم مرة واحدة من خلال إبرة قياس 23 وأخيرا مرة واحدة من خلال إبرة قياس 27.

أخيرا ، قم بتمرير مستخلص الخلية عبر مصفاة خلية 70 ميكرون لبدء تقنية التحضير. الطرد المركزي مستخلص الخلية الذي تم إعداده للتو وإعادة تعليق الكريات في الانتشار. صفيحة متوسطة خمسة ملليلتر من خليط الخلية على قارورة T 25 مطلية بالكولاجين وتسوق على أنها PP واحد محتضنة 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون المرطبة بنسبة 5٪ لمدة ساعتين.

بعد ساعتين. انقل الخلايا غير اللاصقة إلى قارورة T 25 جديدة مطلية بالكولاجين وتسويقها على أنها PP اثنين. أضف خمسة ملليلتر من PM إلى قارورة T 25 السابقة المسماة PP واحد.

أعد كلا القارورتين إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة ، انقل الخلايا غير الملتصقة من PP اثنين إلى قارورة T 25 جديدة مطلية بالكولاجين ENC وقم بتمييزها على أنها PP ثلاثة. أضف خمسة ملليلتر من وسط التكاثر إلى القارورة المسماة PP اثنين.

أعد القوارير إلى الحاضنة. كرر الإجراء كل 24 ساعة حتى السكان PP ستة. يتم إنشاء مجموعة الخلايا الجذعية.

الخلايا الست PP المعزولة قليلة جدا في العدد وتحتاج إلى الحفاظ عليها في وسط التكاثر الغني بالFBS. لقد تغير ذلك يوميا. على الرغم من أن معظم الخلايا في ثقافة PP الستة ستموت خلال أسبوع إلى أسبوعين التاليين من الزراعة.

عادة ما يتم إنشاء ستة سكانية صحية كبيرة بعد أسبوع إلى أسبوعين إضافيين من التوسع. حافظ على جميع المجموعات الأخرى من الخلايا العالقة أيضا ، مما يسمح لها بالتكاثر وفحصها بانتظام باستخدام المجهر المقلوب. الخلايا الملتصقة المبكرة التي ترتبط بقارورة PP one و PP هي في الغالب خلايا ليفية.

الخلايا التي تلتصق بالقوارير المطلية بالكولاجين بعد فترة زمنية أطول في غضون 48 إلى 96 ساعة. PP ثلاثة و PP أربعة هي في الغالب من الأرومات العضلية. في حين أن خلايا الأقمار الصناعية العضلية غالبا ما ترى في الغالب في PP five ، فإن الخلايا الجاهزة اللاحقة 96 ساعة أو بعد ذلك PP ستة تعتبر خلايا جذعية بالغة وتبدو صغيرة ومستديرة وشفافة.

في بداية عزلتها ، يمكن تمييزها بشكل أكبر بالكيمياء المناعية للتعبير عن علامات الخلايا الجذعية مثل الخلايا الجذعية والمستضد الأول و CDC 34. لقد أوضحنا لك للتو كيفية عزل الخلايا الجذعية من كتلة ثانية من الفأر. عند القيام بهذا الإجراء, من المهم أن نتذكر للحفاظ على الستيرويد خلال جميع الإجراءات.

بمجرد عزل الخلايا الجذعية ، تأكد من زراعة تلك الخلايا على أنها منخفضة الكثافة للحفاظ على خصائص الخلايا الجذعية للخلايا. هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجربتك وأتمنى لك حظا سعيدا لمحاولة استخدام هذا في تجربتك.

شكرا.