لماذا تهم درجة حرارة الطرد المركزي عند عزل الـ miRNA من البلازما؟

يمنع الطرد المركزي عند درجة حرارة 4 °C تحلل الخلايا والتحرر غير النوعي لـ miRNA من خلايا الدم، مما يحافظ على سلامة العينة لتحليل المؤشرات الحيوية.

كيف يقوم البروتينيز K بحماية الـ miRNA أثناء عملية الاستخلاص؟

يعمل Proteinase K على تحلل البروتينات، بما في ذلك النوكليازات، التي قد تؤدي بخلاف ذلك إلى هضم RNA أثناء عمليات المعالجة اللاحقة، مما يضمن استقرار miRNA.

ما الغرض من المعالجة بـ DNase 1 في هذا البروتوكول؟

يعمل إنزيم DNase 1 على إزالة تلوث الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (genomic DNA) من العينة، مما يحسن خصوصية تنقية miRNA للتطبيقات اللاحقة.

لماذا يجب معالجة البلازما في غضون ساعة واحدة من جمعها؟

تمنع المعالجة في الوقت المناسب حدوث تغيرات خلوية خارج الجسم الحي (ex vivo) وإطلاق أو تحلل miRNA، مما يحافظ على دقة ملف المؤشرات الحيوية المتداولة.

ما هي ظروف التخزين التي تحافظ على سلامة الـ miRNA المستخلص؟

يمنع تخزين miRNA المستخلص عند درجة حرارة 80- درجة مئوية تحلل RNA ويضمن ملاءمته للدراسات الطولية للمؤشرات الحيوية.

استخراج miRNA: طريقة لاستخراج miRNA من عينة البلازما

JoVE Encyclopedia of Experiments

أبحاث السرطان

0 مشاهدات • 3:59 د • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- MicroRNAs ، أو miRNAs ، هي RNAs صغيرة غير مشفرة تشارك في تنظيم الجينات. يتم تغيير تعبيراتهم أثناء السرطان ، وبالتالي فهي مؤشرات حيوية محتملة للسرطان. لبدء عزل miRNA ، خذ عينة دم كاملة تم جمعها حديثا وجهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية لفصل البلازما عن خلايا الدم. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي مرة أخرى للحصول على مادة طافية أكثر وضوحا في البلازما. استخرج المادة الطافية ، وعالجها بمحلول التجانس المبرد ، متبوعا بمحلول التحلل لتجانس العينة. أضف محلول إنزيم البروتيناز K لتحلل البروتينات ، وخاصة النوكليازات التي من شأنها أن تهضم الحمض النووي الريبي أثناء خطوات المصب.

- بعد ذلك ، قم بتحميل المحللة في البئر المخصص لخرطوشة مستخرج الحمض النووي الخاصة بأداة مجمعة مسبقا. أضف محلول DNase 1 إلى البئر المناسب لإزالة الحمض النووي الجيني من العينة. أضف الماء الخالي من النوكلياز إلى أنبوب الشطف المجمع على الخرطوشة للتكييف قبل عزل miRNA. قم بتحميل مجموعة الخرطوشة في مستخرج الحمض النووي. حدد برنامج تنقية miRNA المناسب وقم بتشغيله. عند الانتهاء ، قم بإزالة أنبوب الشطف الذي يحتوي على miRNA وتخزينه عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

- في البروتوكول التالي ، نعرض استخراج miRNA من عينات دم المريض لفحص سرطان الرئة.

- لبدء هذا البروتوكول ، استخدم أنابيب الفراغ لجمع 10 ملليلتر من عينة الدم الكاملة. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.

- لا تخزن الدم الكامل في درجة حرارة منخفضة ، مثل 4 درجات مئوية ، لتجنب الصدمة الحرارية وتحلل الخلايا التي تؤدي إلى إطلاق microRNA غير محدد.

- الطرد المركزي للبلازما في غضون ساعة واحدة لفصلها. مع التأكد من تجنب ملامسة الحلقة اللمفاوية ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا. ثم الطرد المركزي للطافية في نفس الظروف. Aliquot 1 ملليلتر من هذا المطفي في البلازما إلى 1.5 ملليمتر cryovials ، مع الحرص على تجنب جمع جزء البلازما من قاع الأنبوب. لبدء عزل الحمض النووي الريبي ، أضف 200 ميكرولتر من محلول OMG المبرد مسبقا إلى 200 ميكرولتر من البلازما لكل عينة. لضمان التجانس الكامل ، الدوامة لمدة 15 إلى 30 ثانية. لتجانس العينة ، أضف 200 ميكرولتر من محلول التحلل و 25 ميكرولتر من البروتيناز K لكل عينة ودوامة لمدة 20 ثانية.

- ثم احتضان العينات على حرارة 37 درجة مئوية في خلاط حراري لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، حدد طريقة أنسجة RSC miRNA وقم بتحميل خرطوشة لكل عينة على صينية سطح السفينة لمستخرج أوتوماتيكي للأحماض النووية ، مع وضع المكبس بشكل صحيح. انقل المحللة وأضف 5 ميكرولتر من محلول DNase 1 إلى مواقعها المناسبة في خرطوشة الجهاز. أضف 60 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز إلى قاعدة كل أنبوب شطف. لبدء التنقية التلقائية ، ابدأ التشغيل. قم بتخزين إجمالي عينات الحمض النووي الريبي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.