تعميم الرنا الميكروي الكمي باستخدام الحمض النووي ملزم صبغ الكيمياء والقطرة PCR الرقمية

تم وصف طريقة حساسة ودقيقة لقياس microRNAs الخالية من الخلايا باستخدام الكيمياء القائمة على الصبغة وتقنية PCR الرقمية بالقطرات.

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد كمية microRNAs المتداولة والسوائل البيولوجية ، مثل البلازما أو المصل ، باستخدام تقنية PCR الرقمية بالقطرات. يمكن أن تساعد الطريقة في الإجابة على سؤال في مجال السوق الحيوية. من خلال تحديد السرطان التشخيصي والتنبؤي والتسويق الحيوي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الحساسية العالية. يمكن استخدامه لتحديد كمية الحمض النووي الريبي الصغير الأقل وفرة دون الحاجة إلى جين مرجعي مخنث. يمتد تأثير هذه الطريقة إلى تشخيص السرطان لأنها تتمتع بالقدرة على تحديد الأشخاص المصابين بالسرطان في مراحله المبكرة.

يمكن تطبيقه أيضا على أمراض أخرى مثل الاضطرابات العصبية أو القلبية. بشكل عام ، يحتاج الأفراد إلى الانتباه إلى التلاعب بالقطرات قبل خطوة التدوير الحراري لتجنب اضطرابها. ومن ثم ، فإن العرض المرئي لتوليد القطرات أمر بالغ الأهمية لأنه يمكن تدمير القطرات عن طريق التلاعب غير المبالي أو سحب العينات بسرعة كبيرة.

ابدأ هذا الإجراء بعزل البلازما أو الحمض النووي الريبي الصغير في الدم. ثم قم بنسخها وتخفيفها كما هو موضح في المستند المصاحب. قم بإزالة مجموعة التمهيدي microRNA الرئيسية EvaGreen و cDNA من الفريزر واتركها تذوب في درجة حرارة الغرفة.

بعد إذابته ، اقلب أنبوب المزيج الرئيسي عدة مرات. ثم قم بتدوير جميع الكواشف. قم بإعداد حل عمل رقمي للقطرات أو ddPCR وفقا للتعليمات الواردة في المستند المصاحب.

قم بإعداد ما يكفي لما يصل إلى ثماني عينات مع عنصر تحكم بدون قالب لكل حالة بالإضافة إلى زيادة 10٪ بمجرد تجميعها ، امزج مزيج ddPCR جيدا وقم بتدويره. لاحظ أن التكرارات التقنية ليست مطلوبة بسبب قابلية التكرار العالية لهذه التكنولوجيا. بعد الدوران ، قم بتوزيع 12 ميكرولترا من مزيج ddPCR في كل بئر من لوحة PCR سعة 96 بئرا.

أضف ثمانية ميكرولترات من قالب (كدنا) المخفف إلى كل بئر. ثم أدخل خرطوشة مولد القطرات في حامل الخرطوشة. إلى الصف الأوسط من خرطوشة مولد القطرات ، انقل بعناية 20 ميكرولترا من كل عينة محضرة.

تجنب إدخال فقاعات الهواء في قاع البئر. املأ كل بئر من آبار النفط في الصف السفلي ب 70 ميكرولترا من زيت مولد القطرات. اربط الحشية فوق حامل الخرطوشة.

أدخلها في مولد القطرات وأغلق الغطاء لبدء توليد القطرات. عند الانتهاء من توليد القطرات ، افتح الغطاء ، وأزل الخرطوشة من مولد القطرات ، وقم بإزالة الحشية التي تستخدم لمرة واحدة. تحتوي الآبار العلوية للخرطوشة على القطرات.

انقل 40 ميكرولترا ببطء وسلاسة من كل من الآبار الثمانية العلوية إلى عمود واحد من لوحة PCR سعة 96 بئرا. أغلق اللوحة على الفور بورق الألمنيوم لتجنب التبخر. في غضون 30 دقيقة من إغلاق اللوحة ، ابدأ التدوير الحراري باستخدام بروتوكول PCR الموضح في الجدول الثالث من المستند المصاحب.

قم بتشغيل قارئ القطرات. ثم انقل اللوحة من جهاز التدوير الحراري إلى قارئ القطرات. ضع لوحة PCR سعة 96 بئرا التي تحتوي على قطرات ما بعد تفاعل البوليميراز المتسلسل في قاعدة حامل اللوحة في قارئ القطرات.

ضع الجزء العلوي من حامل اللوحة على لوحة PCR. اضغط بقوة على كلتا علامتي التحرير لأسفل لتثبيت لوحة PCR في الحامل. ابدأ تشغيل برنامج QuantaLife من جهاز الكمبيوتر الخاص بالنظام. انقر فوق إعداد وافتح ملف بيانات القالب الذي يحتوي على معلومات حول العينات والجينات المستهدفة والمقايسات.

من شريط التنقل الأيمن، حدد تشغيل. ستظهر نافذة خيارات التشغيل. من قائمة مجموعة الصبغ، حدد EVA، وانقر فوق موافق لبدء قراءة القطرات.

بمجرد اكتمال التشغيل ، استخدم مخطط السعة 2D في برنامج التحليل لتحديد القطرات الموجبة. لتحديد القطرات الموجبة ، استخدم أداة lasso من شريط التنقل الأيسر. بعد ذلك ، انقر فوق علامة التبويب الأحداث للتحقق من عدد القطرات الإيجابية والإجمالية.

عادة ما يتم تحقيق عدد إجمالي يبلغ 18،000 قطرة باستخدام ddPCR المسبار. ثم انقر فوق علامة التبويب التركيز لتصور العينة النهائية للتركيز. أخيرا استخدم التصدير.

CSV لتصدير قيم تركيز الحمض النووي الريبي الصغير. تم قياس mRNA miR-181a-5p في عينتين من البلازما ، S1 و S2 ، باستخدام تركيز 0.5 وميكرولتر واحد في درجات حرارة التلدين 58 و 60 درجة مئوية. يعرض هذا الشكل نسخ microRNA لكل ميكرولتر في تفاعل التضخيم لكل حالة.

قطرات PCR الإيجابية لكل عينة باللون الأزرق ، وتظهر القطرات السالبة باللون الأسود. كما يتضح هنا ، لا تحتوي عينة التحكم على قطرات موجبة كما هو متوقع. أدى إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل عند 60 درجة مئوية باستخدام 0.5 أو ميكرولتر واحد من البرايمر إلى فصل أفضل بين القطرات الموجبة والسالبة.

في هذا الشكل ، تمثل أشرطة الخطأ فاصل الثقة 95٪ من Poisson. وهنا، يقارن عدد القطرات الموجبة الموضحة باللون الأزرق، بالعدد الكلي للقطرات الموضحة باللون الأخضر. مجتمعة ، توضح هذه البيانات أنه يمكن استخدام PCR الرقمي بالقطرات لتحديد العدد المطلق لنسخ microRNA لكل ميكرولتر من السائل البيولوجي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء القياس الكمي للرنا المرسال باستخدام PCR الرقمي بالقطرات. بمجرد إتقانها ، يمكن تحليل 96 عينة في بضع ساعات فقط ، وهو الإخراج الأمثل للبيئة السريرية. بعد كل تطور ، تمهد هذه التقنية الطريق لمجال الخزعة السائلة لاستكشاف microRNA والحمض النووي الآخر كمؤشرات حيوية للمرض.