الأسفار خلايا حية تصوير "دورة الخلية الخضري كاملة" من "بكتيريا الاجتماعية" بطيئة النمو إكسانثوس ميكسوكوككوس

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلايا البكتيرية ، مثل كيفية تكرار الخلايا للحمض النووي الخاص بها ، وكيف تنمو ، وكيف تنقسم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن مراقبة الخلايا البكتيرية الحية لمدة 24 ساعة على الأقل تحت المجهر ولا تتطلب هذه التقنية معدات خاصة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لنمو وتقسيم Myxococcus xanthus ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيقها بسهولة على البكتيريا الأخرى بطيئة النمو.

للبدء ، أعد تعليق مستعمرة M.xanthus واحدة في 500 ميكرولتر من CTT 1٪ ، مكملة بالمضادات الحيوية ، في أنبوب معقم ونقل المعلق بالكامل إلى قارورة Erlenmeyer سعة 50 ملليلتر تحتوي على خمسة ملليلتر من 1٪ CTT. تحضير محلول مجهر الاغاروز 1٪ يحتوي على 0.2٪ CTT عن طريق خلط جرام واحد من الاغاروز مع 80 مل من محلول TPM و 20 مل من وسط CTT 1٪. ضعي المحلول في الميكروويف حتى يذوب الاغاروز.

املأ طبق بتري بحوالي 60 مل من الاغاروز المنصهر واتركه يبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. قم بتسخين وسادة الاغاروز مسبقا على حرارة 32 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام. بعد ذلك ، ضع غطاء زجاجي معقم على إطار بلاستيكي أو معدني به ثقب في المنتصف ، ثم استخدم شريطا لتثبيت الغطاء على الإطار.

أضف 10 إلى 20 ميكرولترا من خلايا M.xanthus المزروعة بشكل كبير على الغطاء. لإضافة كريات مجهرية فلورية كعلامات إيمانية للخلايا ، استخدم المخزن المؤقت TPM لتخفيف الكريات المجهرية إلى 1: 100. هز معلق الخرزة جيدا وأضف خمسة إلى 10 ميكرولتر إلى الخلايا.

من وسادة الاغاروز الكبيرة الدافئة مسبقا بنسبة 1٪ ، اقطع وسادة صغيرة بحجم زلة الغطاء تقريبا وضعها فوق الخلايا. ثم ضع غطاء على الجزء العلوي من الوسادة لمنع التبخر والحفاظ على الخلايا في بيئة رطبة. احتضان عينة الفحص المجهري عند 32 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق بالجزء السفلي من وسادة الاغاروز قبل تسجيلات الفحص المجهري بفاصل زمني.

لإجراء الفحص المجهري بفاصل زمني ، قم بتشغيل المجهر وابدأ تشغيل برنامج التحكم في المجهر. حدد الهدف الصحيح والمرايا الصحيحة والمرشح للحصول على صور تباين الطور بالإضافة إلى صور البروتينات الفلورية الخضراء أو الحمراء الفلورية أو الفلورية الصفراء. أضف قطرة من زيت الغمر عالي الجودة على عدسة الهدف وإلى أسفل العينة المحتضنة مسبقا عند 32 درجة مئوية.

مع وجود جانب الثقب باتجاه الهدف ، ضع الإطار المعدني مع العينة على مرحلة المجهر ، ثم اربط العينة بإحكام في حامل المرحلة. ركز على الخلايا عن طريق تحريك المرحلة في الاتجاه Z بالقرب من الهدف. عندما يتلامس الزيت الموجود على الهدف والعينة ، حرك المرحلة في اتجاه X / Y.

قم بالتبديل إلى برنامج Metamorph وافتح أداة Acquire. حدد تباين الطور في القائمة المنسدلة الإعداد واضبط وقت التعرض على 100 مللي ثانية. انقر فوق Show Live ، وقم بإحضار الخلية إلى المستوى البؤري ، وحرك المرحلة في اتجاه X / Y حتى تظهر خلايا مفردة متعددة في مجال العرض.

تأكد من وجود كرة مجهرية فلورية واحدة على الأقل في منطقة الرؤية لمحاذاة الصور المكتسبة لاحقا. بعد ذلك ، افتح معالج الاستحواذ متعدد الأبعاد لبرنامج التحكم في المجهر لإعداد تجربة بفاصل زمني تسمح للمجهير بالحصول على صور بأطوال موجية متعددة ومواضع المرحلة إذا لزم الأمر. في علامة التبويب رئيسي ، قم بتنشيط اللقطات المتتابعة والأطوال الموجية المتعددة.

ستظهر علامات تبويب إضافية على الجانب الأيسر من النافذة. انقر فوق علامة التبويب "حفظ" وحدد الدليل لتحديد مجلد فارغ على القرص الصلب للكمبيوتر لحفظ الصور المكتسبة ، ثم قم بتنشيط الاسم الأساسي للزيادة إذا كان الملف موجودا للتأكد من أن مجموعات البيانات المتتالية لا تحل محل مجموعات البيانات السابقة. أعط التجربة اسما مع التاريخ واسم السلالة أو عنوان التجربة.

انقر فوق علامة التبويب الفاصل الزمني لضبط معلمات الفاصل الزمني ، ثم اضبط الفاصل الزمني على 20 دقيقة واضبط المدة على 24 ساعة. سيتغير عدد النقاط الزمنية تلقائيا. الآن ، انقر فوق علامة التبويب الأطوال الموجية.

حدد عدد الأطوال الموجية التي تريد الحصول عليها لكل صورة في كل نقطة زمنية عن طريق تغيير الرقم. حدد السماح بوضع ضبط بؤري تلقائي منفصل للأجهزة المحفوظة لكل طول موجي. انقر فوق علامة التبويب الطول الموجي الأول من الأعلى.

في القائمة المنسدلة الإضاءة، حدد تباين الطور. حدد 100 مللي ثانية للتعريض الضوئي وفي القائمة المنسدلة اكتساب، حدد كل نقطة زمنية. قم بإلغاء تنشيط Auto Exposure في القائمة المنسدلة عن طريق تحديد Never (مطلقا) وتحديد Every Acquisition في القائمة المنسدلة للتركيز التلقائي.

اضبط التعريض الضوئي لكل طول موجي كما هو موضح للتو باستخدام المعلمات التالية. بعد ذلك ، للحصول على صور من مواضع متعددة المراحل ، في علامة التبويب الرئيسية ، قم بتنشيط مواضع متعددة المراحل. انقر فوق علامة التبويب "المسرح" وانقر فوق الزر "مباشر" لإلقاء نظرة على مجال الرؤية.

حرك المرحلة في اتجاه X / Y حتى يصبح عائد الاستثمار في مجال الرؤية. احفظ إحداثيات X وY في علامة التبويب المرحلة بالنقر فوق علامة الجمع. حرك المرحلة مرة أخرى في اتجاه X / Y حتى يتم العثور على عائد استثمار جديد واحفظ الإحداثيات مرة أخرى بالنقر فوق علامة الجمع.

استمر حتى يتم حفظ العدد المطلوب من المناطق. تحقق مرة أخرى من أن الخلايا في بؤرة التركيز من خلال النقر على مواضع X و Y المحفوظة المختلفة وابدأ التركيز البؤري التلقائي للأجهزة بالنقر فوق الضغط على AFC للحفاظ على موضع Z المحفوظ ثابتا على مدار التجربة. ابدأ التسجيل بفاصل زمني في معالج الاكتساب متعدد الأبعاد لبرنامج التحكم في المجهر بالنقر فوق اكتساب.

تحقق من أن الخلايا لا تزال في التركيز البؤري بعد النقاط الزمنية القليلة الأولى في تسجيلات اللقطات المتتابعة لزيادة جودة الصور إلى أقصى حد وإعادة التركيز البؤري إذا لزم الأمر. لإنشاء أفلام بفاصل زمني وإجراء محاذاة الصور ، ابدأ تشغيل برنامج تحليل الصور ومعالجتها. افتح الصور كمكدس بالنقر فوق مراجعة البيانات متعددة الأبعاد، وحدد ملف أساسي، وحدد دليل، ثم افتح المجلد الذي يحتوي على البيانات متعددة الأبعاد.

تحقق من مجموعة البيانات وانقر فوق عرض. سيتم عرض مجموعة البيانات كصور فردية من النقطة الزمنية الأولى حتى النهاية. قم بتنشيط الطول الموجي لإنشاء مكدس، ثم حدد كل الصور التي يجب أن تكون في المكدس وانقر فوق تحميل الصور.

كرر هذه الخطوة لجميع الأطوال الموجية واحفظ المكدسات المكتملة. قم بتنشيط مجموعة الصور التي تحتاج إلى تصحيح للانجراف. افتح أداة المحاذاة باستخدام التطبيقات، المحاذاة التلقائية.

حدد Stack كمصدر للصور و First Level/Time Point كمستوى مرجعي، ثم حدد المكدس باستخدام زر Source Stack وانقر فوق Apply. عند اكتمال المحاذاة التلقائية، احفظ المكدس المحاذاة. لإنشاء فيلم بتنسيقات MOV أو AVI، افتح وظيفة Make Movie عبر Stack وMake Movie.

حدد تسجيلات اللقطات المتتابعة باستخدام الزر Source Stack ، ثم حدد تنسيق الإخراج ، ومعدل الإطارات ، وعدد الإطارات ، وانقر فوق Save. في تجربة الفاصل الزمني هذه مع خلايا متحركة من النوع البري DK1622 ، تم الحصول على صور تباين الطور كل خمس دقائق لمدة 24 ساعة. كما هو متوقع ، كانت الخلايا متحركة وتتحرك في الغالب في مجموعات.

في تصوير الخلايا الحية على النقيض الطوري مع خلايا دلتا-مجليسي IA غير المتحركة ، تمت متابعة نمو وانقسام الخلايا الفردية أثناء تكوين المستعمرات الدقيقة. عندما تم الحصول على الصور كل خمس دقائق لمدة 24 ساعة ، كان من الممكن تحديد وقت التقسيم البالغ 235 زائد أو ناقص 50 دقيقة بدقة خلية واحدة. للتحقق مما إذا كانت الخلايا تنمو بشكل طبيعي أثناء تتبع البروتينات المسماة ب yfp على مدى فترات طويلة ، تم تتبع خلايا M.xanthus التي تعبر عن ParB-YFP.

شكلت ParB-YFP في البداية مجموعة واحدة في منطقة الخلية شبه القطبية. قبل أو بعد انقسام الخلية بفترة وجيزة ، تضاعفت المجموعة ، مع بقاء مجموعة واحدة في قطب الخلية القديم والثانية تنتقل إلى قطب الخلية الجديد. في هذه التجربة ، أظهرت الخلايا غير المتحركة التي تعبر عن FtsZ-gfp تراكما قويا ل FtsZ-gfp في الخلية الوسطى ، مما يحدد موضع انقسام الخلية.

شكلت FtsZ-gfp مجموعة في الخلية الوسطى ، في الغالب في الخلايا الأطول. بعد ساعتين من انقسام الخلية ، تراكمت FtsZ-gfp في الخلية الوسطى في الخلايا الوليدة. بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن إجراؤها بشكل روتيني على Myxococcus xanthus وكذلك على أي بكتيريا أخرى بطيئة النمو.

عند إعداد هذا الإجراء للبكتيريا ، من المهم ضبط تكوين وسط النمو في صفيحة الأجار لتلبية متطلبات النمو المحددة لتلك البكتيريا. بالنسبة لأي بكتيريا ، من المهم تحديد ظروف التصوير المثلى مثل وقت التعرض وشدة الضوء وتردد التصوير لتجنب السمية الضوئية. أيضا ، بالنسبة لأي بروتين يحمل علامة فلورية ، يجب تعديل ظروف التصوير لتجنب السمية الضوئية وكذلك التبييض الضوئي.