التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو

الهدف العام من التجربة التالية هو القياس الكمي لهجرة الخلايا في الوقت الفعلي باستخدام الفحص المجهري بالفيديو. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء صفيحة ثقافة بستة آبار بالكولاجين أولا ، ثم زرع الخلايا ذات الأهمية بشكل ضئيل على اللوحة المطلية. كخطوة ثانية، يتم إنشاء جرح في اللوحة باستخدام طرف ماصة، مما يضمن مساحة واسعة للهجرة.

بعد ذلك ، يتم إعداد المجهر ويتم التقاط الصور على فترات منتظمة باستخدام نظام التحكم في درجة الحرارة للسماح بالمراقبة المستمرة للخلايا المهاجرة في الوقت الفعلي. في النهاية ، يتم استخدام بروتوكول تتبع الجسيمات لتقييم الاختلافات في متوسط السرعة والإزاحة الكلية لخلايا الاختبار والتحكم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل مقايسة هجرة الغرفة التجنبية ، هي أنها لا تستند إلى قياسات الهجرة الكمية لنقطة النهاية في.

بدلا من ذلك ، يسمح بمراقبة وحساب المعلمات المختلفة باستمرار. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا السرطان ، مثل كيف تؤثر جينات أو أدوية معينة على هجرة الخلايا السرطانية؟ قبل يومين من الإجراء ، أضف 1.5 مل من الكولاجين المخفف في الوسائط البصرية إلى كل بئر من صفيحة ثقافة ستة آبار ، ثم احتضن اللوحة طوال الليل عند أربع درجات مئوية قبل يوم واحد من الإجراء.

أعد تعليق الخلايا ذات الأهمية في ملليلترين من DMEM بالإضافة إلى FBS لكل بئر ونقل الخلايا إلى كل بئر من الصفيحة المطلية بالكولاجين ENC ، واحتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في يوم الإجراء. استخدم طرف ماصة لإنشاء جرح في الخلايا المستنبتة طوال الليل واغسل كل بئر باستخدام PBS لإزالة أي حطام تتكون نتيجة للجرح.

أضف DMEM بالإضافة إلى FBS إلى الآبار المغسولة ثم تحقق تحت المجهر للتأكد من إنشاء مساحة جرح نظيفة. بعد تشغيل كاميرا المجهر وجهاز تصوير الخلايا الحية ، ضع اللوحة فوق مرحلة المجهر. قم بتغطية اللوحة بواسطة غرفة التحكم البيئي الجديدة للخلية الحية ، واضبط منظم الحرارة على 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون على 5٪ الآن افتح برنامج كتاب الشرائح في شريط القائمة.

حدد التحكم في التركيز بالنقر فوق الزر F داخل دائرة. في مربع الهدف، استخدم النافذة المنسدلة لتحديد الهدف في مربع مجموعة عوامل التصفية، حدد الإعدادات لتوجيه مسار الضوء إلى القطعة I. حدد الفلتر المناسب لإضاءة المجال الساطع ، ثم انقر فوق فتح ساطع.

لفتح غالق المجال الساطع. حدد الآن مرشح المجال الساطع على البرج واعرض العينة من خلال العدسة للعثور على الحقول المناسبة والتركيز على العينة. ثم حرك برج المرشح لتغيير مسار الضوء إلى الكاميرا لالتقاط الصور في برنامج دفتر الشرائح ، انقر فوق التحكم في التركيز ، وحدد XY لتحديد مواضع مختلفة من خلال القطعة I ، ثم انقر فوق نقطة التعيين للقفل في كل موقع.

لالتقاط الصور، قم بضبط تركيز صورة الكاميرا التي يتم عرضها على الشاشة يدويا، ثم استخدم الأدوات الموجودة في نافذة عناصر التحكم في التركيز البؤري لضبط موضع Z للمرحلة. للحصول على أفضل النتائج ، ركز على النتوءات الخلوية المسطحة بالقرب من ملامسة اللوحة للمساعدة في التركيز البؤري. استخدم شريط التمرير لضبط أوقات التعريض الضوئي لتكون في نطاق مناسب للتركيز البؤري.

إذا تم تحديد مواضع XY متعددة، فاضبط التركيز البؤري لكل موضع فردي عن طريق تحديد التحكم في التركيز البؤري. ثم xy ، ثم نقطة الزيارة. في دفتر الشرائح، حدد رسم الكاميرا من شريط القائمة، وحدد نوع الالتقاط، ثم الفاصل الزمني لتحديد المدة الزمنية للتجربة.

من القائمة المنسدلة، اكتب التأخير المطلوب بين بداية نقطة زمنية وبداية النقطة التالية. في حقول الفاصل الزمني ، سيتم حساب الحقل الثالث تلقائيا من القيم التي تم إدخالها يدويا. ضمن التقاط XY متعدد، حدد قائمة متعددة النقاط للتجارب التي تحتوي على أكثر من موضع XY واحد.

أخيرا ، قم بتسمية الملف لحفظ الملف ، وانتقل إلى التحكم في الالتقاط وحدد خيارات متقدمة ، ثم التخزين المؤقت. ثم التقط في الذاكرة واحفظها في التخزين المؤقت بعد كل نقطة زمنية. ابدأ بالنقر فوق الصورة.

في شريط قائمة كتاب الشرائح ، حدد استيراد من القائمة المنسدلة ، ثم انقر فوق التخزين المؤقت لكتاب الشرائح. حدد ملفات دفتر الشرائح المطلوبة التي تم إنشاؤها من تجربة الترحيل لمختلف الحقول والنقاط الزمنية. افتح الملف الأول ، ثم حدد قناع في شريط القائمة واختر بروتوكول تتبع الجسيمات من القائمة المنسدلة.

ضمن قائمة تتبع الجسيمات ، اختر بروتوكول تتبع الجسيمات اليدوي. ستظهر نافذة بنقطتي وقت البدء والانتهاء لتحليل الترحيل العشوائي، حدد قناع، ثم بروتوكول تعقب الجسيمات. مرة أخرى ، لتحديد إحداثيات مركز الكائن ، حدد مركز المنطقة.

ثم انقر فوق التتبع والمتابعة. اختر الآن الإحصائيات المطلوبة لكل مسار مثل الإزاحة ومتوسط السرعة. كما هو موضح هنا ، انقر فوق حساب لعرض الإحصائيات.

في هذا المربع مثال على تحليل الترحيل العشوائي كما تم تحديده كميا من حيث السرعة. في الرسم البياني للشعيرات ، في هذه التجربة ، كانت هناك زيادة في متوسط السرعة في M-D-A-M-B 2 31 خلية مع جين مثبط للورم. بالمقارنة مع التحكم M-D-A-M-B 2 31 خلية هنا ، تم تحليل الهجرة العشوائية للخلايا من الشكل الأول من حيث إزاحة الخلايا.

مرة أخرى ، كان لدى مجموعة الضربة القاضية للجين المثبط للورم زيادة في إزاحة الخلايا مقارنة بمجموعة التحكم M-D-A-M-B 2 31. الخلايا في هذا الفاصل الزمني المجهري الفيديو التحكم في الفيلم MDA MB 2 31 كانت الجلوس على الكولاجين بين عشية وضحاها. ثم التقطت الصور كل ساعة واحدة لمدة 18 ساعة أثناء الهجرة العشوائية.

لاحظ كيف تبتعد الخلايا عن مواقعها الأصلية بمرور الوقت. في هذا الفيلم ، تم تسجيل وتحليل هجرة اختبار M-D-A-M-B 2 31 خلية بعد البذر طوال الليل على الكولاجين. لاحظ أن خلايا الاختبار أكثر انتقالا مقارنة بخلايا التحكم في الفيلم السابق.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل غزو الخلايا والديناس من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ، ما هي أدوار الخلايا في ورم خبيث للسرطان بعد تطوره؟ مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية لاستكشاف هجرة الخلايا باستخدام خطوط الخلايا السرطانية المعزولة.