البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية
يناير 16, 2011
هيكل 3 - D من جزيء يوفر فريدة من فهم كيفية عمل الجزيء. الأسلوب الرئيسي للتقرير في بنية شبه الذرية القرار البلورات بالأشعة السينية. هنا ، علينا أن نظهر أن الأساليب الحالية للحصول على بلورات ثلاثي الأبعاد للجزيء أي بالنظر إلى أن تكون مناسبة لتحديد الهيكل بواسطة البلورات بالأشعة السينية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج بلورات البروتين لتجارب حيود الأشعة السينية هنا. تم عرض ثلاث تقنيات مختلفة لغربلة البلورات طرق تبلور انتشار البخار بما في ذلك القطرة المعلقة وقطرة الجلوس ، بالإضافة إلى طرق بلورة الدفعات الدقيقة لبلورة انتشار البخار. تمتلئ الآبار بالروادر.
ثم يتم خلط تركيز عال من عينة البروتين المنقى مع عامل الترسيب. ثم يتم إغلاق القطرة المختلطة في بئر يحتوي على محلول الترسيب. يبدأ تبلور الدفعات الدقيقة بملء البئر بزيت البارافين.
ثم يتم تحميل البروتين في الآبار ، متبوعا بالمحلول المرسب. تتمثل الخطوة الأخيرة في جميع الطرق في السماح للنظام بالتوازن واتباع المظهر البلوري والنمو داخل القطرات. في النهاية ، يمكن الحصول على البلورات من هذه التقنية ويمكن تحديد نمط حيود البروتين باستخدام مصدر الأشعة السينية مع كاشف مناسب.
مرحبا ، أنا سال من مختبر البروفيسور يوجا موتيس في قسم الفيزياء الحيوية الجزيئية والكيمياء الحيوية في جامعة ييل. سنعرض لك اليوم إجراء لبلورة البروتين المنقى. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الأساس الهيكلي للعدوى الفيروسية.
لذلك دعونا نبدأ ونزرع بعض البلورات. لتحديد طريقة البلورة لجزيء كبير مفضل ، يمكن إجراء الشاشات الأولية باستخدام حلول البلورة المتاحة تجاريا والتي يتم اختيارها لاستغلال طريقة العوامل غير المكتملة للمصفوفة المتناثرة لظروف التجربة. يتم اختيار هذه الشروط بناء على ظروف التبلور المعروفة والناجحة بشكل شائع للجزيئات الكبيرة.
بمجرد معرفة حالة التبلور ، يمكن تجميع شاشة ضيقة لتغيير تركيز الترسيب في الأس الهيدروجيني حول الضربة الأصلية. عادة ما تتكون ظروف التبلور المستخدمة لهذه الشاشات من هجوم عامل ترسيب ومخزن مؤقت لضبط الأس الهيدروجيني ، ويجب تصفية جميع محاليل المخزون من خلال مرشح 0.22 ميكرون لهذا العرض التوضيحي. يتم استخدام شروط التبلور المحددة مسبقا ليزوزوم الدجاج مع كلوريد الصوديوم حيث يبدأ المرسب الإجراء عن طريق تحضير محاليل مليلتر واحد بتركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم في 0.1 مولار من أسيتات الصوديوم من مختلف الأس الهيدروجيني.
بعد ذلك ، يتم تخزين عينة البروتين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر والاحتفاظ بها على الجليد. تتراوح تركيزات البروتين النموذجية بين خمسة إلى 50 ملليغرام لكل مليلتر بتركيزات أعلى ، وعادة ما تعطي نتائج أفضل. هنا ، يتم استخدام محلول 50 ملليغرام لكل مليلتر من ليزوزوم بيض الدجاجة في 0.02 مولي أسيتات الصوديوم درجة الحموضة 4.9.
قم بتدوير العينة لمدة 15 دقيقة عند 18،000 جم وأربع درجات مئوية لإزالة أي بروتينات مجمعة جزئيا أو الترسيب من خطوة الذوبان. يمكن أن تتداخل هذه الركام مع نمو البلورات وتعزز المزيد من التجميع. بعد الطرد المركزي.
حدد تركيز البروتين من امتصاصه عند 280 نانومتر باستخدام مقياس ضوئي لأطياف الأشعة فوق البنفسجية. يمكن حساب تركيز البروتين من قراءة الامتصاص ومعامل انقراض البروتين. بمجرد أن تصبح عينة البروتين جاهزة ، املأ صينية تبلور معلقة بسعة 24 بئر ب 500 ميكرولتر من محلول الترسيب وفقا لخريطة الدرج.
قم بإنشاء حلقة شحم من السيليكون حول حافة كل بئر دون إغلاق الحلقة تماما حتى يتمكن الهواء من الهروب جيدا. سقف. قم بتنظيف شريحة الغطاء برذاذ هواء مكثف أو منديل احترافي لتجنب الغبار ، مما يسهل تفسير قطرات التبلور ويزيل التلوثات. الخطوة التالية هي ماصة كميات متساوية من عينة البروتين ومحلول الخزان على شريحة الغطاء.
ومع ذلك ، يمكن تجربة كميات مختلفة من البروتين والمرسب كجزء من عملية التحسين باستخدام بروتين أكثر من الراسب ينتج عنه تركيز صافي للبروتين في القطرة المتوازنة ، والتي قد تكون مرغوبة لعينات البروتين اللطيفة أو لإبطاء التنوي البلوري أو النمو. في هذا العرض التوضيحي، لترين ميكرولترين من 50 ملليغرام لكل مليلتر من الليزوزيم في 0.02 مولي من أسيتات الصوديوم. يتم تحميل الأس الهيدروجيني الرابع في وسط شريحة الغطاء ، متبوعا بميكرولترين من محلول التبلور.
عند سحب البروتين ومحلول الخزان على شريحة الغطاء، كن حذرا للغاية لتجنب تكوين الفقاعات، والذي يحدث غالبا عند نفخ الهواء من الماصة. امزج القطرة برفق للمساعدة في منع ترسيب البروتين المبكر بسبب تركيزات الترسيب العالية محليا في خلط القطرات مهم بشكل خاص للرواسب اللزجة مثل البولي إيثيلين جلايكول باستخدام الملقط. اقلب شريحة الغطاء برفق وضعها على حلقة الشحوم الموجودة أعلى ، وقم بأداء ذلك بشكل جيد بطريقة اتجاهية حتى يتمكن الهواء من الهروب من البئر.
خلاف ذلك ، يمكن للهواء أن يرفع شريحة الغطاء مما يعرض ختم البئر للخطر. انتقل إلى البئر التالي حتى يكتمل الدرج. بمجرد إعداد الدرج ، قم بفحصه بصريا ، والقضاء على جزيئات الغبار والملوثات الأخرى التي يمكن أن تقلل من التحديد الإيجابي الخاطئ لبلورات البروتين.
استخدم ورقة درجات لتوثيق التجربة. بعد ذلك ، ضع الدرج في درجة حرارة الحضانة المطلوبة بشكل عام بين أربع درجات مئوية ودرجة حرارة الغرفة. أنجح درجة حرارة هي 20 درجة مئوية.
احرص على التعامل مع الدرج برفق وتجنب أي اهتزازات اهتزازية أو تغيرات في درجات الحرارة أثناء النقل أو الحضانة يمكن أن تمنع نمو البلورات أو تؤثر سلبا على جودة البلورة. افحص الدرج بحثا عن البلورات في اليوم التالي ثم كل بضعة أيام ، وتعامل دائما مع الصواني بعناية. قم بتوثيق أي نتائج وإسقاط الأشكال في صينية ورقة تسجيل محددة.
عادة ما تستغرق البلورات من يومين إلى خمسة أيام للظهور ، على الرغم من ظهور البلورات أحيانا على الفور تقريبا أو حتى عدة أشهر بعد ذلك. بمجرد تحديد ظروف التبلور ومعرفة معدل نمو البلورات ، من الأفضل ترك الصواني دون إزعاج حتى تظهر البلورات وتنمو إلى نصف حجمها النهائي على الأقل. يمكن أن يؤدي ترك الصواني دون إزعاج إلى تقليل عدد أحداث التنوي البلوري ، مما يؤدي إلى أعداد أقل من البلورات الأكبر لبلورة قطرة الجلوس ، اتبع نفس الإجراء المتبع في القطرة المعلقة ، باستثناء أننا سنستخدم صينية إسقاط 24 بئر لا تكون فيها شرائح الغطاء مطلوبة.
بدلا من ذلك ، يحتوي البئر على رف يتم خلط فيه ماصة البروتين والراسب ، وهو ميكرولترين من محلول الليزوزيم 50 ملليغرام لكل مليلتر في وسط الرف ، وتجنب توليد فقاعات الهواء. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من محلول الترسيب إلى العينة بعد إعداد الدرج. أغلق الآبار بشريط بصري مع قطرة الجلوس.
لا توجد شرائح غطاء ضرورية. استمر في الحضانة وتسجيل الكريستال كما هو موضح لتعليق القطرة. لتنفيذ إجراء دفعة صغيرة.
تحضير محلول التبلور والبروتين كما هو موضح لإجراء القطرة المعلقة. احصل على صينية دفعات صغيرة جديدة ورذاذ هواء لتجنب الغبار والجزيئات الكبيرة الأخرى في صينية الدفعات الصغيرة. أضف زيت البارافين إلى كل بئر على عمق ثلاثة ملليمترات.
ثم قم بإزالة الزيت الزائد. بعد ذلك ، قم بتحميل ميكرولتر واحد من محلول البروتين في البئر المملوء مسبقا ، مع التأكد من أن القطرة تغرق في قاع البئر. ثم قم بتحميل ميكرولتر واحد من محلول الترسيب في البئر.
تأكد من أن القطرة تغرق في قاع البئر وتندمج مع قطرة البروتين. انتقل إلى البئر التالي حتى يكتمل الدرج واستمر في الحضانة والتحليل البلوري كما هو موضح هنا. النتائج النموذجية لبلورة البروتين.
يتم عرض التجارب. يحدث هطول الأمطار غير المتبلور عندما يكون البروتين و / أو المرسب في تركيز عال. على العكس من ذلك ، عادة ما تظل القطرات غير المشبعة واضحة.
يمكن أن يحدث فصل الطور إذا انفصل البروتين أو المنظف إلى مرحلة مختلفة عند مزجه مع رواسب معينة بتركيز عال. في ظل الظروف المثلى ، يجب أن تشكل بلورات البروتين نبات الأرابيدوبسيس csn. تظهر سبع بلورات بروتينية تم الحصول عليها في البولي إيثيلين جلايكول 8 ، 000 وخلات المغنيسيوم على شكل قضيب.
البلورات المعروضة أيضا هي بلورات بروتين الليزوزوم التي تم الحصول عليها في ضرس واحد ، كلوريد الصوديوم وخلات الصوديوم. الرقم الهيدروجيني 4.9. يوضح فيلم الفاصل الزمني هذا أن بلورات الليزوزوم تنمو لتصبح مناشير كبيرة في غضون ساعات قليلة من الإعداد عند استخدام طريقة الإسقاط المعلق.
لقد أوضحنا لك للتو كيفية إعداد تجربة بروتين عند القيام بهذا الإجراء. من المهم العمل في بيئة تحكم ثابتة في درجة الحرارة والرطوبة حيث تساعد الرطوبة العالية على تقليل التبخر المتساقط ، حاول اعتماد تقنية تقلل من تعرض القطرة للهواء الطلق. لهذا السبب ، من الضروري العمل في بيئة عمل جيدة التنظيم.
هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
توضح هذه المقالة طرقًا لإنتاج بلورات البروتين المناسبة لتجارب حيود الأشعة السينية. وتسلط الضوء على تقنيات مثل تبلور انتشار البخار وبلورة الدُفعات الصغيرة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء البنيوي
- علم البلورات
- علم الجزيئات الكبيرة
الخلفية
- البنية ثلاثية الأبعاد للجزيئات ضرورية لفهم وظائفها.
- حيود الأشعة السينية هو طريقة رئيسية لتحديد البنية.
- الحصول على بلورات مناسبة ضروري لتحليل دقيق.
- توجد تقنيات تبلور مختلفة لتسهيل هذه العملية.
هدف الدراسة
- إنتاج بلورات بروتينية عالية الجودة لحيود الأشعة السينية.
- توضيح تقنيات تبلور فعالة.
- تعزيز فهم هياكل الجزيئات الكبيرة.
الطرق المستخدمة
- طرق تبلور انتشار البخار (القطرة المعلقة والقطر الجالس).
- تقنيات بلورة الدُفعات الصغيرة.
- استخدام عوامل الترسيب لتعزيز نمو البلورات.
- ختم القطرات المختلطة في آبار تحتوي على محاليل الترسيب.
النتائج الرئيسية
- تبرهن ناجحة على تقنيات تبلور مختلفة.
- توضيح عملية تحضير عينات البروتين.
- أفكار حول الظروف اللازمة لتشكيل البلورات.
- إمكانية تحسين تحديد البنية من خلال هذه الطرق.
الاستنتاجات
- التبلور الفعال هو مفتاح دراسات حيود الأشعة السينية.
- يمكن استخدام تقنيات مختلفة بناءً على الاحتياجات المحددة.
- فهم هذه الطرق يعزز أبحاث علم الأحياء البنيوي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Protein crystallization is a critical bottleneck in structural biology, directly impacting the ability to determine high-resolution structures for target validation and mechanistic de-risking in drug discovery. Reliable crystallization methods enable predictive confidence in structural assays, supporting lead identification and preclinical model development by providing atomic-level insights into protein function and ligand interactions. This capability is essential for de-risking targets early in the discovery pipeline and informing portfolio decisions based on structural evidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through atomic-resolution structures that clarify protein function and binding sites.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing structural evidence for target engagement and mechanism of action.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by revealing structural vulnerabilities and druggability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated biological systems (protein crystals) suitable for downstream structural screening and fragment-based lead discovery.
- Operational Value: Standardizes sample preparation through reproducible crystallization setups (hanging drop, sitting drop, micro batch) that reduce variability in structural assays.
- Assay Readiness: Enables reliable compound evaluation by generating diffraction-quality crystals that serve as inputs for X-ray fragment screening and SAR studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural insights to preclinical validation by enabling structure-guided optimization of leads.
- Mechanistic De-risking: Clarifies structure-function relationships that inform safety profiling and off-target risk assessment.
- Predictive Confidence: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking structural data to functional outcomes in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical development, where structural data informs iterative design cycles.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing 3D structures that reveal functional domains and interaction interfaces.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible crystal production, facilitating high-throughput structural screening of compound libraries.
- Analytics: Generates quantitative structural outputs (electron density maps, B-factors) that allow teams to compare ligand-bound and apo states for structure-based design.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling structure-guided lead optimization and biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable structural biology capability that supports multiple projects across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and structural insight into protein function.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of crystal production across vapor diffusion and batch formats.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via early structural de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on structural evidence of target druggability and binding site accessibility.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, biophysics, and crystallization screening to achieve homogeneity and avoid aggregation.
- Depends on access to crystallization robots, imaging systems, and X-ray diffraction equipment for crystal monitoring and data collection.
- Necessitates cross-team standardization between protein production, structural biology, and medicinal chemistry for effective data handoff.
- Involves adaptation considerations for different protein properties (size, solubility, stability) and buffer conditions across target classes.
- Limited by the inherent variability in crystallization outcomes, which may require extensive condition screening despite optimized protocols.
