Name: البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-16T16:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: تعلم تقنيات بلورة البروتينات لدراسة البنية الجزيئية باستخدام حيود الأشعة السينية. يوضح هذا الفيديو طرق التبلور بالانتشار البخاري والدفعات الدقيقة لتحليل البروتينات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل المحقق بوروز ويلكوم لجائزة YM وزمالة براون Coxe بعد الدكتوراة من جامعة ييل لMD.

المواد : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة بروتين -- الليزوزيم (50 ملغ / مل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شنق 24 قطرة جيدا صينية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجلس جيدا انخفاض 24 علبة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microbatch تبلور 96 علبة جيدا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلورة حلول (إما التجارية المتاحة أو المنزل الذي أدلى) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السيليكون الشحوم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 مل حقنة دون Luer القفل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الشرائح Siliconized </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الشريط الضوئي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البارافين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0،1-2 micropipette ميكرولتر مع الاحتفاظ المنخفض نصائح </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاقيط </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مناديل المهنية </li></ul> 1. معلقة / يجلس إسقاط الإجراءات : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على شاشة الأولي يمكن للمرء أن استخدام الشاشات المتوفرة تجاريا التي تستغل مصفوفة كاملة متفرق الأسلوب مضروب ظروف المحاكمة. غير منحازة مصفوفة كاملة متفرق مضروب من قبل وطريقة اختيارهم من الشروط المعروفة للتبلور جزيئات (كارتر وكارتر ، 1979 ؛ Cudney وآخرون ، 1994 ؛. Jancarik وكيم ، 1991 ؛. Jancarik وآخرون ، 1991). إذا كان من المعروف مسبقا حالة التبلور ، يمكن تجميعها شاشة ضيقة ، بدرجات تركيز الرواسب ودرجة الحموضة في جميع أنحاء ضرب الأصلي. ومرسب أنجح شيوعا هو البولي ايثيلين جلايكول (PEG) ، تليها سلفات الأمونيوم. معا ، هذه precipitants حساب اثنين من أجل ما يقرب من 60 ٪ من جميع الجزيئات precipitants المسجلة المستخدمة لبلورة (جيليلاند وآخرون ، 1994 ؛. كيمبر وآخرون ، 2003 ؛. صفحة وآخرون ، 2003). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول بلورة الخاص. وعادة ما يتم الجمع بين هذه الظروف من وكيل عجل ، والملح من نوع ما وعازلة لضبط درجة الحموضة. قد يكون في بعض الحالات واضاف المضافة خصيصا لهذا البروتين في المصالح. ينبغي تصفيتها حل جميع الأسهم باستخدام 0.22 ميكرون التصفية. ربما بعض من محلول المخزون تكون لزجة جدا (50 ٪ أوتاد ، الجلسرين ، PEG - MME ، الخ). <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1.5 مل من 0.6 ، 0.8 ، 1.0 ، 1.2 ، 1.4 ، 1.6 م في كل من كلوريد الصوديوم 0.1 درجة الحموضة NaOAc M 4.0 ، 4.3 ، 4.6 و 4.9 (حلول مجموعه 24) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أذاب عينتك البروتين والحفاظ على الجليد. يجب أن يتم تخزينها في مخزونات البروتين -80 درجة مئوية ما لم البروتين ذات الاهتمام حساس لتجميد / دورات الذوبان (إذا كان الأمر كذلك ، وتخزينها في 4 درجات مئوية). تركيزات البروتين النموذجية هي في حدود 50-50 ملغ / مل ، مع ارتفاع تركيزات عادة إعطاء أفضل النتائج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور العينة 15min/18 ، 000xg / 4 درجات مئوية -- تميل بعض البروتينات لتجميع جزئيا ويعجل بعد خطوة ذوبان الجليد. ويمكن تعزيز هذه المجاميع هطول الأمطار غير متبلور من بقية الجزيئات البروتينية لذا تدور باستمرار شامل يضمن لديك سوى جزيئات تذوب في عينتك. إبقاء البروتين على الجليد حتى إعداد الدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز البروتين من الامتصاصية أعمالها في 280 نانومتر باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية. ويمكن حساب تركيز البروتين من القراءة الامتصاصية ومعامل البروتين الانقراض. ويمكن حساب معامل الانقراض مع أداة ProtParam على موقع Expasy : <a href="http://ca.expasy.org/tools/protparam.html">http://ca.expasy.org/tools/protparam.html</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تملأ الآبار من جانب شنقا 24 / علبة قطرة الجلوس مع 500 ميكرولتر من محلول مرسب وفقا لخطة الإعداد علبة (الشكل 2B). إنشاء عصابة الشحوم سيليكون حول حافة البئر. وينبغي أن يكون حلقة فجوة صغيرة لمنع تراكم الضغط الجوي كما هو مختومة البئر. قطرات في الجلوس ، وليس هناك حاجة لأن الشحوم لاغلاق جيدا مع الشريط (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ شريحة الغطاء وتنظيفه مع رذاذ الهواء المكثف ، أو مسح المهنية -- تجنب الغبار سيخفف تفسير انخفاض التلوث والقضاء على التبلور. قطرات للجلوس ، لا يتم استخدام الشريحة الغطاء. بدلا من ذلك ، كذلك يحتوي على الرف الذي يتم خلط البروتين ومرسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح كميات متساوية من العينة البروتين وخزان حل على الشريحة الغطاء. لا يجوز محاكمة أحجام مختلفة من البروتين ومرسب كجزء من عملية التحسين. استخدام المزيد من البروتين من النتائج مرسب في تركيز صافي البروتين في الانخفاض بعد موازنة ، التي يمكن أن يكون من المرغوب فيه للحصول على عينات البروتين المخففة ، وإبطاء التنوي الكريستال أو النمو. وسيتم أيضا أي مادة أخرى غير قلق في حل قطرة أن تتركز من قبل العامل نفسه. عندما pipetting البروتين والحلول الخزان على الشريحة الغطاء ، نكون حذرين للغاية لتجنب تكوين الفقاعة. هذا يحدث غالبا عندما يتم نفخ الهواء من ماصة. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطرة شنقا : تحميل 2 ميكرولتر من 50 ملغ / مل الليزوزيم 0.02 درجة الحموضة في NaOAc M 4.9 إلى وسط تغطية الشريحة وإضافة إلى ذلك 2 ميكرولتر من الحل الخزان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجلس قطرة : تحميل 2 ميكرولتر من 50 حل الليزوزيم ملغ / مل إلى مركز للجرف وإضافة إلى ذلك 2 ميكرولتر من محلول الخزان. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه تغطية الشريحة بلطف وأضعها على الحلقة الشحوم على رأس البئر. اضغط لأسفل برفق حتى أن الهواء لا يمكن الخروج من البئر خلال الشق في الشحوم في العلاقات العامةحدث تراكم الضغط الجوي في البئر والحفاظ على مختوم بشكل جيد. يمكن الضغط الجوي تراكم في البئر رفع غطاء الشريحة ، المساس ختم جيدا. في أسلوب إسقاط الجلوس ، ويتم استخدام الشريط الشفاف واضح بصريا لتغطية الآبار. وبالتالي ، سيكون في هذا الختم الأسلوب تجري كل صف / عمود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتقال إلى البئر المقبل حتى علبة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من درج على الإعداد -- القضاء على جزيئات الغبار والملوثات الأخرى يمكن أن تقلل من هوية مزورة إيجابية من بلورات البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ورقة التسجيل للوثيقة تجربتك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الدرج عند درجة حرارة الحضانة المطلوب ، عموما ما بين 4 درجات حرارة مئوية وغرفة درجة. 20 درجة مئوية هو أنجح شائع. الحرص على التعامل مع علبة بلطف وتجنب أي اهتزاز. كن حذرا أثناء فتح وإغلاق الباب الحاضنة. يمكن الاهتزازات أو التغيرات في درجات الحرارة أثناء النقل أو الحضانة منع نمو البلورات أو تؤثر سلبا على نوعية الكريستال. ويمكن استخدام مواد لامتصاص الصدمات (مثل رغوة التعبئة) والحشو تحت الأدراج الكريستال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من علبة للبلورات في اليوم التالي ، ومن ثم كل بضعة أيام ، والمناولة دائما الأدراج مع الرعاية. أي وثيقة النتائج وmorphologies انخفاض في التهديف ورقة علبة معينة. البلورات تأخذ عادة 2-5 أيام لتظهر ، على الرغم من بلورات تظهر أحيانا في وقت أقرب بكثير (على الفور تقريبا) أو في وقت لاحق (تصل إلى عدة أشهر!). مرة واحدة وقد تم تحديد شروط التبلور وكما هو معروف أن معدل نمو البلورات ، فمن الأفضل أن تترك دون عائق الأدراج حتى بلورات ظهرت ونمت على الأقل لنصف حجمها النهائي. يمكن ترك الأدراج دون عائق خفض عدد الأحداث التنوي الكريستال ، وبالتالي إنتاج أعداد أقل من أكبر البلورات. </li></ol> 2. Microbatch الداخلي : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصف بأنها نموذج البروتين وإعداد مرسب أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رذاذ الهواء microbatch صينية جديدة لتجنب الغبار والجزيئات الكبيرة الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في علبة microbatch ، وملء زيت البرافين تصل إلى 3 مم (ما يكفي لتغطية الآبار). إزالة الوصول للنفط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 1 ميكرولتر من محلول البروتين (50 ملغ / مل الليزوزيم) في مرحلة ما قبل النفط مملوءة جيدا -- تأكد من ماصة الحل مباشرة إلى قاع البئر (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 1 ميكرولتر من محلول مرسب في فقا جيدا إلى علبة مخطط الإعداد (الشكل 2B) -- تأكد هبوط المصارف إلى قاع البئر والصمامات مع قطيرة البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتقال إلى البئر المقبل حتى علبة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الخطوات من 11-14 من الشنق / يجلس الإجراء الهبوط. </li></ol> 3. ممثل النتائج : ويشار عادة إلى بلورة مثل عنق الزجاجة من البلورات بالأشعة السينية. مصفوفة كاملة متفرق الشاشة مضروب ظروف عجل تنتج عادة من أنواع مختلفة من تجميع البروتين وهطول الأمطار ، من بينها بلورات واحدة كبيرة. إذا كان البروتين أو مرسب تركيزات مرتفعة للغاية ويمكن للمرء أن يرى المسألة البني مع أي شكل مميز وحجم (التساقط غير متبلور). عند التشبع الحل ، فإن الهبوط غالبا ما تكون واضحة تماما وخالية من أي نوع لهطول الأمطار. ويبين الشكل 3 أمثلة عديدة لهطول الأمطار والظواهر بلورات (ديساو وآخرون ، 2006). ويمكن الاطلاع على مزيد من ظواهر هطول الأمطار مع تفسير أكثر تفصيلا في <a href="http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html">http://xray.bmc.uu.se/terese/tutorials.html</a> . <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. مبدأ بلورة البروتين. مبدأ بلورة البروتين. في تجربة نشر البخار (أ) وحدات التخزين على قدم المساواة مرسب والبروتينات موجودة في الانخفاض. ومنتشر خارج المياه ، وسيتم مضاعفة كل من الرواسب وتركيز البروتين حتى يتم تحقيق التوازن بين الدراسة والحل الخزان. في التبلور الدفعي (B) ومرسب وتركيز البروتين لا تتغير أثناء التجربة. بدأت بلورات البروتين التنوي يحدث ، لتشكيل وتركيز البروتين في حل قطرات من التشبع -- النقطة أ -- إقامة التشبع البروتين يمكن أن تتكون بلورات أي وباء نقطة. نقطة C -- بروتين رواسب ، ولكن قد البلورات ما زالت تنمو ، توصيل هلام (C) بلورة غسيل الكلى باستخدام الشعرية. بلورات الملح تظهر كما ينشر من العينة البروتين (و / أو ينشر مرسب في عينة بروتين) عبر المكونات هلام. <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. مخطط نموذجي التجارب بلورة البروتين. (أ) إجراءات لتعليق نشر انخفاض بخار ، ويجلس انخفاض بخار نشرها ، وتبلور microbatch البروتين. في كل حالة ، يتم خلط كمية صغيرة من البروتين عينة مركزة مع حجم مساو أو أصغر من precipitanر حل وسمح للتوازن. (B) لبلورة الليزوزيم الدجاج ، علبة 24 جيد تم إعداده مع تركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم (لمرسب) وخلات الصوديوم بنسبة 0.1 M باعتبارها منطقة عازلة في مختلف PHS (4،0-4،9). <img src="/files/ftp_upload/2285/2285fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. نتائج نموذجية من البروتين تجربة التبلور. (أ) التساقط غير متبلور. عندما البروتين أو مرسب (أو كليهما) في تركيز عال. (ب) فصل المرحلة. قد البروتين أو المنظفات منفصلة لمرحلة مختلفة عند مزجه مع precipitants معينة في تركيز عال. (C) على شكل بلورات البروتين رود AtCSN7 من الحصول عليها في 8000 والبولي ايثيلين جلايكول المغنيسيوم خلات (ديساو وآخرون ، 2006). (D) بلورات الليزوزيم في الحصول على 1،0 M كلوريد الصوديوم وخلات الصوديوم الهيدروجيني 4.9. (ه) تحت قطرات مشبعة تبقى عادة واضحة. التصوير الفوتوغرافي من قبل موشيه ديساو.

<ol><li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+TM+%22Protein+crystallization+%3A+techniques%2C+strategies%2C+and+tips+%3A+a+laboratory+manual%22">Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual</a>. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).</li>
<li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+using+incomplete+factorial+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li>
<li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li>
<li>Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification+and+crystallization+of+a+PCI+domain+from+the+COP9+signalosome+subunit+7+%28CSN7%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7).</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).</li>
<li>Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Macromolecule+Crystallization+Database%2C+Version+3.0%3A+new+features%2C+data+and+the+NASA+archive+for+protein+crystal+growth+data%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).</li>
<li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sparse+matrix+sampling%3A+a+screening+method+for+crystallization+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Cryst%22%5BJournal%5D)">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).</li>
<li>Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+study+of+the+ligand-binding+domain+of+the+bacterial+chemotaxis-mediating+aspartate+receptor+of+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium.</a> J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).</li>
<li>Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+mining+crystallization+databases%3A+knowledge-based+approaches+to+optimize+protein+crystal+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens.</a> Proteins. 51, 562-568 (2003).</li>
<li>Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+growth+of+proteins%2C+nucleic+acids%2C+and+viruses+in+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels.</a> Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcPherson%2C+A+%22Crystallization+of+biological+macromolecules%22">Crystallization of biological macromolecules</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li>
<li>Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+crystallization+strategy+for+structural+genomics%3A+an+optimized+two-tiered+crystallization+screen+against+the+Thermotoga+maritima+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نحن في هذه المقالة وصف وشرح البروتوكولات العام الجاري لبلورة البروتين. منذ أن الإجراء متعددة خطوة هناك بعض الاعتبارات يحتاج المرء أن يكون على علم. عند العمل مع كميات صغيرة جدا (0،5-2 ميكرولتر) ، والتجفيف للانخفاض بسبب التبخر هو مصدر قلق كبير. وبالتالي ، فمن المستحسن للعمل في بيئة جيدة للرقابة (مع انخفاض تدفق الهواء والرطوبة العالية وضيق تحكم بدرجة الحرارة) واعتماد الاسلوب الذي يقلل من التعرض للانخفاض في الهواء الطلق. لهذا السبب ، فمن الضروري أن تعمل في بيئة عمل جيدة التنظيم. وينبغ...

<table><tbody><tr><td>ليزوزيم (Lysozyme)</td><td></td><td>Sigma-aldrich</td><td>L6876-1G</td></tr><tr><td>لوح VDX بـ 24 بئراً</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-142</td></tr><tr><td>لوح Cryschem بـ 24 بئراً</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-158</td></tr><tr><td>شحم تفريغ Dow Corning</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-510</td></tr><tr><td>أغطية شرائح زجاجية دائرية مُسيليكونة</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td></tr><tr><td>زيت برافين 100%</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-411</td></tr><tr><td>شريط إغلاق Crystal Clear بعرض 1.88 inch</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-511</td></tr><tr><td>لوح Imp@ct بـ 96 بئراً (لوح الدفعات الصغيرة)</td><td></td><td>Hampton research</td><td>HR3-098</td></tr></tbody></table>

البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

باستخدام هيكل ثلاثى الابعاد لجزيئات بيولوجية لاستنتاج كيفية عملها هو واحد من أهم مجالات البيولوجيا الحديثة. توافر هياكل ذرية القرار يوفر فهما عميقا وفريدة من نوعها وظيفة البروتين ، ويساعد على كشف الأعمال الداخلية للخلية الحية. حتى الآن ، 86 ٪ من بنك معلومات البروتين (rcsb - PDB) الإدخالات هياكل الجزيئات التي تم تحديدها باستخدام الأشعة السينية البلورات. للحصول على بلورات المناسبة للدراسة البلورات ، ويجب أن جزيء (بروتين مثل الحمض النووي ، ومعقدة البروتين البروتين أو البروتينات والحمض النووي معقد) يمكن تنقيته لالتجانس ، أو أقرب ما يمكن إلى التجانس. تجانس إعداد يشكل عاملا رئيسيا في الحصول على البلورات التي حيد الضوء إلى ارتفاع القرار (Bergfors ، 1999 ؛ ماكفرسون ، 1999). يتطلب بلورة يصل إلى جزيء فوق التشبع. ولذلك ينبغي أن تتركز العينة إلى تركيز أعلى درجة ممكنة من دون التسبب في سقوط الأمطار أو تجميع للجزيء (عادة 20-50 ملغ / مل). ويمكن تقديم نموذج لتعزيز عامل عجل التنوي من البلورات البروتينية في الحل ، والذي يمكن أن يؤدي إلى بلورات ثلاثي الأبعاد الكبيرة المتزايدة من الحل. هناك نوعان من التقنيات الرئيسية للحصول على بلورات : بخار نشر وبلورة الدفعي. نشر في بخار ، وانخفاض تحتوي على خليط من حلول مرسب والبروتين هو في غرفة مغلقة مع مرسب النقي. ثم ينشر بخار الماء من الانخفاض حتى الأسمولية من الانخفاض ومرسب متساوون في (الشكل 1A). والجفاف من الانخفاض البطيء يؤدي إلى تركيز كل من البروتين ومرسب حتى يتحقق التوازن ، مثالي في منطقة التنوي الكريستال من المخطط المرحلة. الأسلوب يعتمد على تقديم دفعة البروتين مباشرة في منطقة التنوي بواسطة بروتين الاختلاط مع كمية مناسبة من مرسب (1B الشكل). عادة ما يتم إجراء هذه الطريقة في ظل البارافين / خليط المعادن النفطية للحيلولة دون انتشار المياه من الهبوط. هنا سوف نظهر نوعين من الإعداد لنشر بخار التجريبية ، والشنق قطرة قطرة ، والجلوس ، وبالإضافة إلى بلورة إطار الدفعة النفط.

عادةً ما يُشار إلى عملية التبلور على أنها عنق الزجاجة في علم البلورات بالأشعة السينية. وعادةً ما ينتج عن فحص مصفوفة متفرقة غير مكتملة للعوامل لظروف الترسيب أنواعاً عديدة ومختلفة من تجميع وترسيب البروتين، من بينها بلورات مفردة كبيرة. وإذا كانت تركيزات البروتين أو المادة المرسبة عالية جداً، فقد يظهر Matter بني اللون دون شكل أو حجم محدد (ترسيب غير متبلور). وعندما يكون المحلول غير مشبع، غالباً ما تكون القطرة صافية تماماً وخالية من أي نوع من الترسيب. يوضح الشكل 3 عدة أمثلة لظواهر الترسيب والبلورات (Dessau et al., 200...

هيكل 3 - D من جزيء يوفر فريدة من فهم كيفية عمل الجزيء. الأسلوب الرئيسي للتقرير في بنية شبه الذرية القرار البلورات بالأشعة السينية. هنا ، علينا أن نظهر أن الأساليب الحالية للحصول على بلورات ثلاثي الأبعاد للجزيء أي بالنظر إلى أن تكون مناسبة لتحديد الهيكل بواسطة البلورات بالأشعة السينية.

يعد استخدام البنية ثلاثية الأبعاد للجزيئات الحيوية الكبيرة لاستنتاج كيفية عملها أحد أهم المجالات في البيولوجيا الحديثة. إن...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج بلورات بروتينية لتجارب حيود الأشعة السينية. يتم استعراض ثلاث تقنيات مختلفة لفحص البلورات، حيث يتم وصف طرق تبلور الانتشار البخاري، بما في ذلك طريقة القطرة المعلقة وطريقة القطرة الجالسة، بالإضافة إلى طرق تبلور الدفعات الدقيقة للتبلور عن طريق الانتشار البخاري. تملأ الآبار بمادة مرسبة.بعد ذلك، يتم خلط عينة من البروتين المنقى بتركيز عالٍ مع عامل الترسيب. ثم تُختم القطرة المخلوطة في بئر يحتوي على محلول المُرسب. وتبدأ عملية البلورة بالدفعة الصغيرة (Micro batch crystallization) بملء البئر بزيت البارافين.يتم بعد ذلك تحميل البروتين في الآبار، يليه محلول المرسب. وتتمثل الخطوة النهائية في جميع الطرق في ترك النظام حتى يصل إلى حالة التوازن ومتابعة ظهور البلورات ونموها داخل القطرات. وفي النهاية، يمكن الحصول على بلورات من هذه التقنية وتحديد نمط حيود البروتين باستخدام مصدر للأشعة السينية مع كاشف مناسب.مرحباً، أنا سال من مختبر البروفيسور يوجا موتيس في قسم الفيزياء الحيوية الجزيئية والكيمياء الحيوية بجامعة ييل. سنعرض لكم اليوم إجراءً لبلورة بروتين منقى. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الأساس البنيوي للعدوى الفيروسية.لذا، دعونا نبدأ في تنمية بعض البلورات. ولتحديد طريقة تبلور لجزيء ضخم مختار، يمكن إجراء عمليات فحص أولية باستخدام محاليل تبلور متاحة تجارياً، والتي يتم اختيارها للاستفادة من طريقة المصفوفة المتفرقة ذات العوامل غير المكتملة لظروف التجربة. ويتم اختيار هذه الظروف بناءً على ظروف تبلور معروفة وناجحة عادةً للجزيئات الضخمة.بمجرد معرفة ظروف البلورة، يمكن إعداد مسح ضيق يتم فيه تغيير تركيز المادة المرسبة في الرقم الهيدروجيني (pH) حول النتيجة الأصلية. عادةً ما تتكون ظروف البلورة المستخدمة في عمليات المسح هذه من مجموعة من المواد المرسبة ومحلول منظم لضبط الـ pH؛ ويجب ترشيح جميع المحاليل المخزنة عبر مرشح 0.22 micron لهذا العرض التوضيحي. تُستخدم ظروف البلورة المحددة مسبقاً لليسوسوم الدجاجي مع كلوريد الصوديوم كمادة مرسبة؛ ابدأ الإجراء بتحضير محاليل بحجم 1 mL من تراكيز مختلفة من كلوريد الصوديوم في أسيتات الصوديوم بتركيز 0.1 molar وبقيم pH مختلفة.بعد ذلك، يتم إذابة عينة البروتين المخزنة عند -80 °C مع إبقائها على الثلج. تتراوح تركيزات البروتين النموذجية عادةً بين 5 إلى 50 mg/mL، علماً بأن التركيزات الأعلى تعطي عادةً نتائج أفضل. في هذه التجربة، يتم استخدام محلول من ليزوزيم بيض الدجاج بتركيز 50 mg/mL في خلات الصوديوم بتركيز 0.02 M وpH 4.9.قم بطرد العينة مركزياً لمدة 15 minutes عند 18,000 G ودرجة حرارة 4 °C لإزالة أي بروتينات متجمعة جزئياً أو رواسب ناتجة عن خطوة الإذابة. يمكن لهذه التجمعات أن تعيق نمو البلورات وتحفز المزيد من التجمع. بعد عملية الطرد المركزي.حدد تركيز البروتين من خلال قياس امتصاصه عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية. يمكن حساب تركيز البروتين من قراءة الامتصاص ومعامل الانقراض الخاص بالبروتين. بمجرد تجهيز عينة البروتين، املأ صينية بلورة بنظام القطرة المعلقة ذات 24 بئرًا بـ 500 ميكرولتر من محلول المرسب وفقًا لمخطط الصينية.قم بتكوين حلقة من الشحم السيليكوني حول حافة كل بئر دون إغلاق الحلقة تماماً للسماح للهواء بالهروب من سقف البئر. نظف شريحة الغطاء باستخدام بخاخ الهواء المضغوط أو ممسحة احترافية لتجنب الغبار، مما سيسهل تفسير قطرات البلورة ويقضي على الملوثات. الخطوة التالية هي نقل أحجام متساوية من عينة البروتين ومحلول الخزان باستخدام الماصة إلى شريحة الغطاء.ومع ذلك، يمكن تجربة أحجام مختلفة من البروتين والمادة المرسبة كجزء من عملية التحسين؛ حيث يؤدي استخدام كمية من البروتين تزيد عن المادة المرسبة إلى تركيز صافٍ للبروتين في القطرة المتوازنة، وهو أمر قد يكون مرغوباً في حالة عينات البروتين المخففة أو لإبطاء عملية تنوي البلورات أو نموها. وفي هذا العرض التوضيحي، يتم وضع 2 µL من الليزوزيم بتركيز 50 mg/mL في 0.02 M خلات الصوديوم عند pH 4 في مركز شريحة التغطية، يليه إضافة 2 µL من محلول البلورة.عند سحب البروتين ومحلول الخزان بالماصة ووضعهما على الشريحة الغطاء، يجب توخي الحذر الشديد لتجنب تكون الفقاعات، والتي غالباً ما تحدث عند نفخ الهواء من الماصة. اخلط القطرة برفق للمساعدة في منع ترسيب البروتين المبكر الناتج عن التركيزات العالية للمرسب موضعياً في القطرة؛ ويعد الخلط مهماً بشكل خاص للمرسبات اللزجة مثل polyethylene glycol باستخدام الملقط. اقلب الشريحة الغطاء برفق وضعها فوق حلقة الشحم الموجودة أعلى البئر؛ قم بذلك بطريقة توجيهية بحيث يمكن للهواء الهروب من البئر.وإلا، فقد يؤدي الهواء إلى رفع شريحة الغطاء، مما يؤدي إلى إضعاف إغلاق البئر. انتقل إلى البئر التالي حتى يتم تجهيز الصينية بالكامل. وبمجرد إعداد الصينية، افحصها بصرياً لإزالة جزيئات الغبار والملوثات الأخرى التي قد تزيد من احتمالية التعرف الخاطئ على بلورات البروتين كإيجابيات كاذبة.استخدم ورقة تسجيل لتوثيق التجربة. بعد ذلك، ضع الصينية في درجة حرارة الحضانة المطلوبة، والتي تكون عموماً بين 4 °C ودرجة حرارة الغرفة. وتعد درجة حرارة 20 °C هي الأكثر نجاحاً.احرص على التعامل مع الصينية برفق وتجنب أي اهتزازات أو تغيرات في درجة الحرارة أثناء النقل أو الحضن، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى منع نمو البلورات أو التأثير سلباً على جودتها. افحص الصينية بحثاً عن البلورات في اليوم التالي ثم كل بضعة أيام، مع التعامل دائماً مع الصواني بعناية. قم بتوثيق أي نتائج وأشكال مورفولوجية للقطرات في ورقة تسجيل مخصصة لكل صينية.تظهر البلورات عادةً خلال يومين إلى خمسة أيام، على الرغم من ظهورها أحياناً بشكل فوري تقريباً أو بعد عدة أشهر. وبمجرد تحديد ظروف التبلور ومعرفة معدل نمو البلورات، يفضل ترك الصواني دون تحريك حتى تظهر البلورات وتنمو إلى نصف حجمها النهائي على الأقل. ومن شأن ترك الصواني دون تحريك أن يقلل من عدد أحداث تنوي البلورات، مما يؤدي إلى تكوين أعداد أقل من البلورات الأكبر حجماً. تتبع طريقة التبلور بالقطرة الساكنة (sitting drop crystallization) نفس إجراءات طريقة القطرة المعلقة (hanging drop)، باستثناء أننا سنستخدم صينية قطرة ساكنة تحتوي على 24 بئراً ولا تتطلب شرائح غطاء.وبدلاً من ذلك، تحتوي البئر على رف يتم فوقه خلط البروتين والمادة المرسبة؛ وباستخدام الماصة، يتم وضع 2 µL من محلول الليزوزيم بتركيز 50 mg/mL في مركز الرف، مع تجنب تكوين فقاعات هوائية. بعد ذلك، تُضاف 2 µL من محلول المادة المرسبة إلى العينة بعد إعداد الصينية. تُغلق الآبار باستخدام شريط لاصق بصري بطريقة القطرة الجالسة.لا توجد حاجة لاستخدام شرائح غطاء. استمر في عملية الحضن وتقييم البلورات كما هو موضح في طريقة القطرة المعلقة. لإجراء عملية الدفعة الصغيرة (micro batch).قم بتحضير محلول البلورة والبروتين كما هو موضح في إجراء القطرة المعلقة. أحضر صينية دفعات صغيرة (micro batch tray) جديدة وقم برشها بالهواء لتجنب وجود الغبار والجزيئات الكبيرة الأخرى في صينية الدفعات الصغيرة. أضف زيت البرافين إلى كل بئر حتى يصل العمق إلى ثلاثة مليمترات.ثم قم بإزالة الزيت الزائد. بعد ذلك، قم بتحميل 1 µL من محلول البروتين في الفجوة المعبأة مسبقاً، مع التأكد من غوص القطرة إلى قاع الفجوة. ثم قم بتحميل 1 µL من محلول المُرسب في الفجوة.تأكد من وصول القطرة إلى قاع البئر واندماجها مع قطيرة البروتين. انتقل إلى البئر التالي حتى يكتمل ملء الصينية، ثم تابع عملية الحضن وتحليل البلورات كما هو موضح هنا. النتائج النموذجية لبلورة البروتين.تظهر التجارب أن الترسيب غير المتبلور يحدث عندما يكون البروتين و/أو العامل المرسّب بتركيز عالٍ. وعلى العكس من ذلك، تظل القطرات غير المشبعة عادةً صافية.يمكن أن يحدث فصل طوري إذا انفصل البروتين أو المنظف إلى طور مختلف عند خلطه مع مرسبات معينة بتركيز عالٍ. في ظل الظروف المثلى، ينبغي أن تتشكل بلورات بروتين Arabidopsis csn. وتظهر سبع بلورات بروتينية تم الحصول عليها في polyethylene glycol 8,000 وخلات المغنيسيوم على شكل قضبان.تظهر البلورات الموضحة أيضاً بلورات بروتين الليسوسوم التي تم الحصول عليها في محلول مولاري واحد من كلوريد الصوديوم وخلات الصوديوم عند pH 4.9. يوضح هذا المقطع المرئي بفاصل زمني أن بلورات الليسوسوم تنمو لتصبح مواشور كبيرة خلال بضع ساعات من التحضير عند استخدام طريقة القطرة المعلقة.لقد عرضنا لكم للتو كيفية إعداد تجربة بروتينية عند تنفيذ هذا الإجراء. من المهم العمل في بيئة تخضع لرقابة مستقرة من حيث درجة الحرارة والرطوبة، حيث تساعد الرطوبة العالية على تقليل تبخر القطرة؛ لذا حاول اعتماد تقنية تقلل من تعرض القطرة للهواء الطلق. ولهذا السبب، من الضروري العمل في بيئة عمل منظمة جيداً.هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.

protein-crystallization-for-x-ray-crystallography

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نظم التشغيل الآلي والبروتوكولات لإعداد عدد كبير من الشاشات الاعتيادية ونانولتر بلورة قطرات البخار نشر التجارب موصوفة ومناقشتها.

الآلي البروتوكولات لبلورة الجزيئات في لجنة نهر الميكونج مختبر البيولوجيا الجزيئية

يتم تقديم بروتوكول لعلم البلورات بالأشعة السينية باستخدام الجريزوفريستالز البروتين. يتم مقارنة مثالين تحليل في الجريزوفريستالز الجسم الحي -grown بعد تنقية أو في السليلو .

الجريزوفولفوغرافيا من بلورات البروتين و<em&gt; في سيليولو</em&gt; الانعراج

هذه الورقة تفاصيل بروتوكول تصنيع رقائق microfluidic وضعت لبلورة البروتين على رقاقة مع طريقة غسيل الكلى والتجارب في الموقع حيود الأشعة السينية. عملية microfabrication يجعل من الممكن لدمج غشاء غسيل الكلى السليلوز التجديدي شبه قابل للنفاذ مع أي قطع الوزن الجزيئية، بين طبقتين من الرقاقة.

تبلور البروتينات على رقاقة عن طريق المجهر دراسات الحيود في الموقع بالأشعة السينية

تتطلب الدراسات الهيكلية للجزيئات الحيوية بواسطة البلورات بلورات عالية الجودة. هنا نبرهن على بروتوكول يمكن استخدامه من قبل OptiCrys (أداة مؤتمتة بالكامل تم تطويرها في مختبرنا) و / أو أزرار التحليل الدقيق لزراعة بلورات كبيرة عالية الجودة استنادًا إلى معرفة الرسم التخطيطي لمرحلة التبلور.

تحسين النمو البلوري للبلورات النيوترونية الجزيئية

تصف هذه المساهمة كيفية إعداد بلورة البروتين على أجهزة الكريستال على الكريستال وكيفية إجراء جمع البيانات التسلسلية الآلية في درجة حرارة الغرفة باستخدام منصة التبلور على الرقاقة.

التبلور على الرقاقة والحيود التسلسلي واسع النطاق في درجة حرارة الغرفة

يصف البروتوكول المقدم نهجا مباشرا لفحص ظروف تبلور البروتين ونمو البلورات باستخدام لوحة غسيل الكلى عالية الإنتاجية المكونة من 96 بئرا. كما تم إثبات استخدام أنابيب غسيل الكلى للنمو على نطاق واسع للبلورات الدقيقة لعلم البلورات التسلسلي وتطبيقات MicroED.

تبلور البروتين عالي الإنتاجية عن طريق غسيل الكلى

يفصل هذا البروتوكول فحص التبلور عالي الإنتاجية ، بدءا من إعداد لوحة المقايسة الدقيقة 1,536 إلى نهاية نافذة زمنية تجريبية مدتها 6 أسابيع. يتم تضمين تفاصيل حول إعداد العينة ، والتصوير الذي تم الحصول عليه ، وكيف يمكن للمستخدمين إجراء التحليلات باستخدام واجهة مستخدم رسومية مدعومة بالذكاء الاصطناعي لتحديد ظروف التبلور الجزيئي بسرعة وكفاءة.

فحص عالي الإنتاجية للحصول على نتائج بلورية لعلم بلورات البروتين

يصف هذا البروتوكول إعدادا لتبلور ناقل الستيرول ABCG5 / G8. يتم إعادة تشكيل ABCG5 / G8 إلى ثنائيات للتبلور المعلق والقطرة. لا يتطلب البروتوكول مواد أو ركائز متخصصة ، مما يجعله متاحا وسهل التكيف في أي مختبر لتحديد بنية البروتين من خلال علم البلورات بالأشعة السينية.

ABCG5 / G8 التبلور في بيئة ثنائية الخلية الدهنية لعلم البلورات بالأشعة السينية

نقدم بروتوكولا لتبلور البروتينات باستخدام مرفق التبلور في مجمع الأبحاث في هارويل وما بعده من جمع بيانات البلورات بالأشعة السينية في الموقع من البلورات داخل الألواح في خط شعاع دايموند متعدد الاستخدامات للجزيئات الكبيرة في الموقع (VMXi). نحن نصف متطلبات العينة وبروتوكولات التبلور وإرشادات جمع البيانات.

التبلور وجمع بيانات درجة حرارة الغرفة في الموقع باستخدام مرفق التبلور في Harwell و Beamline VMXi ، مصدر ضوء الماس

استخدمنا السنكروترون التصوير المقطعي بالأشعة السينية في الإشعاع السنكروترون مرفق الأوروبي (ESRF) لغير جراحية إنتاج مجموعات بيانات 3D تصوير الشعاعي الطبقي مع دقة بكسل من 0.7μm. حجم باستخدام تقديم البرامج ، وهذا يسمح للتعمير الهياكل الداخلية في حالتها الطبيعية ، دون القطع الأثرية التي تنتجها sectioning النسيجية.

غير الغازية مع التصور 3D - الفرعية ميكرون القرار باستخدام السنكروترون - X - أشعة التصوير المقطعي

تعلم تقنيات بلورة البروتينات لدراسة البنية الجزيئية باستخدام حيود الأشعة السينية. يوضح هذا الفيديو طرق التبلور بالانتشار البخاري والدفعات الدقيقة لتحليل البروتينات.

البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية

استكشف المزيد من الفيديوهات