البلورة البروتين لالبلورات بالأشعة السينية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج بلورات البروتين لتجارب حيود الأشعة السينية هنا. تم عرض ثلاث تقنيات مختلفة لغربلة البلورات طرق تبلور انتشار البخار بما في ذلك القطرة المعلقة وقطرة الجلوس ، بالإضافة إلى طرق بلورة الدفعات الدقيقة لبلورة انتشار البخار. تمتلئ الآبار بالروادر.

ثم يتم خلط تركيز عال من عينة البروتين المنقى مع عامل الترسيب. ثم يتم إغلاق القطرة المختلطة في بئر يحتوي على محلول الترسيب. يبدأ تبلور الدفعات الدقيقة بملء البئر بزيت البارافين.

ثم يتم تحميل البروتين في الآبار ، متبوعا بالمحلول المرسب. تتمثل الخطوة الأخيرة في جميع الطرق في السماح للنظام بالتوازن واتباع المظهر البلوري والنمو داخل القطرات. في النهاية ، يمكن الحصول على البلورات من هذه التقنية ويمكن تحديد نمط حيود البروتين باستخدام مصدر الأشعة السينية مع كاشف مناسب.

مرحبا ، أنا سال من مختبر البروفيسور يوجا موتيس في قسم الفيزياء الحيوية الجزيئية والكيمياء الحيوية في جامعة ييل. سنعرض لك اليوم إجراء لبلورة البروتين المنقى. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة الأساس الهيكلي للعدوى الفيروسية.

لذلك دعونا نبدأ ونزرع بعض البلورات. لتحديد طريقة البلورة لجزيء كبير مفضل ، يمكن إجراء الشاشات الأولية باستخدام حلول البلورة المتاحة تجاريا والتي يتم اختيارها لاستغلال طريقة العوامل غير المكتملة للمصفوفة المتناثرة لظروف التجربة. يتم اختيار هذه الشروط بناء على ظروف التبلور المعروفة والناجحة بشكل شائع للجزيئات الكبيرة.

بمجرد معرفة حالة التبلور ، يمكن تجميع شاشة ضيقة لتغيير تركيز الترسيب في الأس الهيدروجيني حول الضربة الأصلية. عادة ما تتكون ظروف التبلور المستخدمة لهذه الشاشات من هجوم عامل ترسيب ومخزن مؤقت لضبط الأس الهيدروجيني ، ويجب تصفية جميع محاليل المخزون من خلال مرشح 0.22 ميكرون لهذا العرض التوضيحي. يتم استخدام شروط التبلور المحددة مسبقا ليزوزوم الدجاج مع كلوريد الصوديوم حيث يبدأ المرسب الإجراء عن طريق تحضير محاليل مليلتر واحد بتركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم في 0.1 مولار من أسيتات الصوديوم من مختلف الأس الهيدروجيني.

بعد ذلك ، يتم تخزين عينة البروتين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر والاحتفاظ بها على الجليد. تتراوح تركيزات البروتين النموذجية بين خمسة إلى 50 ملليغرام لكل مليلتر بتركيزات أعلى ، وعادة ما تعطي نتائج أفضل. هنا ، يتم استخدام محلول 50 ملليغرام لكل مليلتر من ليزوزوم بيض الدجاجة في 0.02 مولي أسيتات الصوديوم درجة الحموضة 4.9.

قم بتدوير العينة لمدة 15 دقيقة عند 18،000 جم وأربع درجات مئوية لإزالة أي بروتينات مجمعة جزئيا أو الترسيب من خطوة الذوبان. يمكن أن تتداخل هذه الركام مع نمو البلورات وتعزز المزيد من التجميع. بعد الطرد المركزي.

حدد تركيز البروتين من امتصاصه عند 280 نانومتر باستخدام مقياس ضوئي لأطياف الأشعة فوق البنفسجية. يمكن حساب تركيز البروتين من قراءة الامتصاص ومعامل انقراض البروتين. بمجرد أن تصبح عينة البروتين جاهزة ، املأ صينية تبلور معلقة بسعة 24 بئر ب 500 ميكرولتر من محلول الترسيب وفقا لخريطة الدرج.

قم بإنشاء حلقة شحم من السيليكون حول حافة كل بئر دون إغلاق الحلقة تماما حتى يتمكن الهواء من الهروب جيدا. سقف. قم بتنظيف شريحة الغطاء برذاذ هواء مكثف أو منديل احترافي لتجنب الغبار ، مما يسهل تفسير قطرات التبلور ويزيل التلوثات. الخطوة التالية هي ماصة كميات متساوية من عينة البروتين ومحلول الخزان على شريحة الغطاء.

ومع ذلك ، يمكن تجربة كميات مختلفة من البروتين والمرسب كجزء من عملية التحسين باستخدام بروتين أكثر من الراسب ينتج عنه تركيز صافي للبروتين في القطرة المتوازنة ، والتي قد تكون مرغوبة لعينات البروتين اللطيفة أو لإبطاء التنوي البلوري أو النمو. في هذا العرض التوضيحي، لترين ميكرولترين من 50 ملليغرام لكل مليلتر من الليزوزيم في 0.02 مولي من أسيتات الصوديوم. يتم تحميل الأس الهيدروجيني الرابع في وسط شريحة الغطاء ، متبوعا بميكرولترين من محلول التبلور.

عند سحب البروتين ومحلول الخزان على شريحة الغطاء، كن حذرا للغاية لتجنب تكوين الفقاعات، والذي يحدث غالبا عند نفخ الهواء من الماصة. امزج القطرة برفق للمساعدة في منع ترسيب البروتين المبكر بسبب تركيزات الترسيب العالية محليا في خلط القطرات مهم بشكل خاص للرواسب اللزجة مثل البولي إيثيلين جلايكول باستخدام الملقط. اقلب شريحة الغطاء برفق وضعها على حلقة الشحوم الموجودة أعلى ، وقم بأداء ذلك بشكل جيد بطريقة اتجاهية حتى يتمكن الهواء من الهروب من البئر.

خلاف ذلك ، يمكن للهواء أن يرفع شريحة الغطاء مما يعرض ختم البئر للخطر. انتقل إلى البئر التالي حتى يكتمل الدرج. بمجرد إعداد الدرج ، قم بفحصه بصريا ، والقضاء على جزيئات الغبار والملوثات الأخرى التي يمكن أن تقلل من التحديد الإيجابي الخاطئ لبلورات البروتين.

استخدم ورقة درجات لتوثيق التجربة. بعد ذلك ، ضع الدرج في درجة حرارة الحضانة المطلوبة بشكل عام بين أربع درجات مئوية ودرجة حرارة الغرفة. أنجح درجة حرارة هي 20 درجة مئوية.

احرص على التعامل مع الدرج برفق وتجنب أي اهتزازات اهتزازية أو تغيرات في درجات الحرارة أثناء النقل أو الحضانة يمكن أن تمنع نمو البلورات أو تؤثر سلبا على جودة البلورة. افحص الدرج بحثا عن البلورات في اليوم التالي ثم كل بضعة أيام ، وتعامل دائما مع الصواني بعناية. قم بتوثيق أي نتائج وإسقاط الأشكال في صينية ورقة تسجيل محددة.

عادة ما تستغرق البلورات من يومين إلى خمسة أيام للظهور ، على الرغم من ظهور البلورات أحيانا على الفور تقريبا أو حتى عدة أشهر بعد ذلك. بمجرد تحديد ظروف التبلور ومعرفة معدل نمو البلورات ، من الأفضل ترك الصواني دون إزعاج حتى تظهر البلورات وتنمو إلى نصف حجمها النهائي على الأقل. يمكن أن يؤدي ترك الصواني دون إزعاج إلى تقليل عدد أحداث التنوي البلوري ، مما يؤدي إلى أعداد أقل من البلورات الأكبر لبلورة قطرة الجلوس ، اتبع نفس الإجراء المتبع في القطرة المعلقة ، باستثناء أننا سنستخدم صينية إسقاط 24 بئر لا تكون فيها شرائح الغطاء مطلوبة.

بدلا من ذلك ، يحتوي البئر على رف يتم خلط فيه ماصة البروتين والراسب ، وهو ميكرولترين من محلول الليزوزيم 50 ملليغرام لكل مليلتر في وسط الرف ، وتجنب توليد فقاعات الهواء. بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من محلول الترسيب إلى العينة بعد إعداد الدرج. أغلق الآبار بشريط بصري مع قطرة الجلوس.

لا توجد شرائح غطاء ضرورية. استمر في الحضانة وتسجيل الكريستال كما هو موضح لتعليق القطرة. لتنفيذ إجراء دفعة صغيرة.

تحضير محلول التبلور والبروتين كما هو موضح لإجراء القطرة المعلقة. احصل على صينية دفعات صغيرة جديدة ورذاذ هواء لتجنب الغبار والجزيئات الكبيرة الأخرى في صينية الدفعات الصغيرة. أضف زيت البارافين إلى كل بئر على عمق ثلاثة ملليمترات.

ثم قم بإزالة الزيت الزائد. بعد ذلك ، قم بتحميل ميكرولتر واحد من محلول البروتين في البئر المملوء مسبقا ، مع التأكد من أن القطرة تغرق في قاع البئر. ثم قم بتحميل ميكرولتر واحد من محلول الترسيب في البئر.

تأكد من أن القطرة تغرق في قاع البئر وتندمج مع قطرة البروتين. انتقل إلى البئر التالي حتى يكتمل الدرج واستمر في الحضانة والتحليل البلوري كما هو موضح هنا. النتائج النموذجية لبلورة البروتين.

يتم عرض التجارب. يحدث هطول الأمطار غير المتبلور عندما يكون البروتين و / أو المرسب في تركيز عال. على العكس من ذلك ، عادة ما تظل القطرات غير المشبعة واضحة.

يمكن أن يحدث فصل الطور إذا انفصل البروتين أو المنظف إلى مرحلة مختلفة عند مزجه مع رواسب معينة بتركيز عال. في ظل الظروف المثلى ، يجب أن تشكل بلورات البروتين نبات الأرابيدوبسيس csn. تظهر سبع بلورات بروتينية تم الحصول عليها في البولي إيثيلين جلايكول 8 ، 000 وخلات المغنيسيوم على شكل قضيب.

البلورات المعروضة أيضا هي بلورات بروتين الليزوزوم التي تم الحصول عليها في ضرس واحد ، كلوريد الصوديوم وخلات الصوديوم. الرقم الهيدروجيني 4.9. يوضح فيلم الفاصل الزمني هذا أن بلورات الليزوزوم تنمو لتصبح مناشير كبيرة في غضون ساعات قليلة من الإعداد عند استخدام طريقة الإسقاط المعلق.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية إعداد تجربة بروتين عند القيام بهذا الإجراء. من المهم العمل في بيئة تحكم ثابتة في درجة الحرارة والرطوبة حيث تساعد الرطوبة العالية على تقليل التبخر المتساقط ، حاول اعتماد تقنية تقلل من تعرض القطرة للهواء الطلق. لهذا السبب ، من الضروري العمل في بيئة عمل جيدة التنظيم.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.