ميكروأرس] DNA : نموذج مراقبة الجودة ، وتهجين صفيف والمسح الضوئي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تجربة مصفوفة دقيقة باستخدام جهاز خلاط آلي. يتم تحقيق ذلك من خلال تحليل جودة عينات الحمض النووي الريبي أولا باستخدام المحلل الحيوي بعد تضخيم الحمض النووي الريبي ووضع العلامات. يتم تهجين عينات الحمض النووي الريبي إلى المصفوفات الدقيقة.

أخيرا ، يتم غسل المصفوفات الدقيقة المهجنة ومسحها ضوئيا. في النهاية ، يتم الحصول على النتائج التي تظهر التعبير التفاضلي لنصوص الحمض النووي الريبي من خلال تحليل صور المصفوفة الدقيقة المضان ثنائي اللون. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات تهجين المصفوفات الدقيقة بسبب المعدات المتخصصة.

يبدأ تحليل مراقبة الجودة بإعداد أداة المحلل الحيوي 2 ، 100 ومحطة تحضير الرقائق وفقا لتوجيهات الإجراء المكتوب. ثم يتم ترشيح مصفوفة الجل عن طريق سحب 550 ميكرولتر في مرشح دوران مزود بجهاز طرد مركزي RNA 6 ، 000 نانو. الفلتر عند 1 ، 500 RCF لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بتقسيم الجل المصفى إلى 65 ميكرولتر ، والتي يمكن تخزينها عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. قم بتدوير تركيز الصبغة لمدة 10 ثوان وأضف ميكرولتر واحد إلى 65 ميكرولتر. هلام مفلتر بعد دوامة جهاز الطرد المركزي للخليط عند 13 ، 000 RCF لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتشغيل العينات.

ضع أولا شريحة على محطة التحضير. في هذا العرض التوضيحي ، يتم استخدام الحمض النووي الريبي 6 ، 000 شريحة نانو. قم بتحميل تسعة ميكرولترات من مزيج صبغة الجل في البئر المميز بعلامة G بيضاء على الخلفية السوداء.

مع وضع طرف الماصة في قاع البئر. ضع مكبس المحقنة عند مليلتر واحد وأغلق محطة التحضير. اضغط على المكبس لأسفل ببطء ولكن بثبات حتى يتم تثبيته بواسطة المشبك.

بعد 30 ثانية ، حرر المشبك واترك المكبس يرتفع لبضع ثوان. بعد توقف المكبس ، اسحب المكبس مرة أخرى إلى وضع المليلتر الواحد وافتح محطة التحضير. قم بتحميل تسعة ميكرولتر من قالب الجل.

امزج في كل من البئرين. مارك جي ثم قم بتخزين خمسة ميكرولترات من العلامة في سلم البئر وفي كل من بئر العينة ال 12. التحميل التالي ، ميكرولتر واحد من السلم المشوه في بئر السلم وميكرولتر واحد من كل عينة مشوهة في آبار العينة.

أخيرا ، أضف ميكرولتر واحد من العلامة إلى كل عينة غير مستخدمة. حسنا ، بمجرد تحميلها ، قم بتدوير الشريحة لمدة دقيقة واحدة عند 2 ، 400 دورة في الدقيقة. بعد بدء تشغيل برنامج 2 ، 100 خبير ، ضع الشريحة وأغلق الغطاء.

تأكد من تحديد المنفذ الصحيح وقم بتشغيل الفحص في غضون خمس دقائق من تحميل العينات لمنع التبخر. يمكن العثور على طرق إجراء تضخيم الحمض النووي الريبي ووضع العلامات عليه في البروتوكول المكتوب. بمجرد وضع العلامات ، قم بتنقية CRNA لإزالة أي نيوكليوتيدات غير مدمجة باستخدام cogens r أعمدة صغيرة سهلة ، يمكن بعد ذلك قياس CRNA المسمى باستخدام مقياس ضوئي أطياف NanoDrop 2000.

في وضع قياس المصفوفات الدقيقة ، قم بالتسجيل وتركيز العينة والعائد والنشاط المحدد. بالنسبة لتهجين المصفوفات الدقيقة ، من الضروري تحقيق عائد لا يقل عن 825 نانوغراما ونشاطا محددا لا يقل عن ثمانية بيكومول لكل ميكروغرام قبل ساعتين على الأقل من تهجين المصفوفة الدقيقة. قم بتشغيل محطة التهجين واضبطها على 65 درجة مئوية.

يصف هذا البروتوكول استخدام Agilent أربعة × 40 4K مع نظام تهجين Roche nimble gen وأربع غرف خلاط لاحقة لتجزئة CRNA التي يتم إجراؤها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب ، قم بإعداد غرفة التهجين. ضع شريحة مصفوفة دقيقة في جانب الباركود الخاص بأداة تفكيك التجميع. افتح أولا خلاط A four وكشف المادة اللاصقة التي تحمل المصفوفة وأداة تفكيك التجميع لمنع أي حركة.

ضع الخلاط A four على الشريحة بدءا من النهاية البعيدة. تأكد من محاذاته بشكل صحيح مع الأداة وقم بلصق الخلاط على طول المصفوفة. حرك السحب من نهاية الخلاط لإزالة مجموعة خلاط الشرائح.

باستخدام أداة اللحام ، اضغط على طول الحشية اللاصقة للتأكد من لصقها بإحكام على الشريحة. يمكن رؤية فقاعات الهواء الصغيرة المحبوسة بين المادة اللاصقة والشريحة على الخلفية الداكنة. خذ وقتا إضافيا لإزالة هذه الفقاعات باستخدام أداة الصراخ.

المصفوفة جاهزة الآن للتحميل. استخدم إزاحة موجبة لتحميل 100 ميكرولتر من عينة التهجين. ادفع الطرف بإحكام داخل الكوة ووزعه ببطء وسلاسة حتى لا يعلق الهواء في منطقة المصفوفة.

عندما تغطي العينة المصفوفة بأكملها ويبدأ السائل في الخروج ، فإن منفذ التهوية ، قم بإزالة الماصة بسرعة ، وقم بتحرير المكبس فقط. بمجرد أن يبتعد الطرف عن الشريحة ، امسح السائل الزائد برفق في كلا المنفذين ، مع الحرص على عدم سحب العينة من الغرفة نفسها. ثم قم بتغطية الفتحات بالملصقات باستخدام الملقط.

ضع الشريحة على محطة التهجين وتحقق من وضع فتحات المثانة بشكل صحيح فوق حلقات O. سيضمن ذلك الخلط المناسب أثناء التهجين. أغلق غطاء المنزلق وغطاء المحطة.

اضبط المحطة على وضع الخلط B وقم بتهجين المصفوفة عند 65 درجة مئوية لمدة 17 ساعة. بمجرد الانتهاء من طبق زجاجي حشو المسمى A مع عازلة غسيل واحدة ، يجب أن يكون الطبق كبيرا بما يكفي لحمل أداة تفكيك التجميع والسماح ببعض المناورة أيضا. يجب أن تتم جميع عمليات الغسيل في الأواني الزجاجية لأن البلاستيك يميل إلى ترشيح المركبات مما يؤدي إلى خلفية عالية في المصفوفة.

ضع رف منزلق وقضيب تقليب في طبق تلطيخ. المسمى B ، املأ الطبق بمخزن مؤقت للغسيل يغطي الرف وضع الطبق على طبق تقليب في درجة حرارة الغرفة. أضف أيضا قطعة تقليب في طبق تلطيخ فارغ مكتوب عليه C وضعها على طبق تحريك.

قم بإزالة المصفوفة من محطة التهجين وضعها في أداة تفكيك التجميع. اغمر المجموعة بأكملها في الطبق أثناء الإمساك بأداة تفكيك التجميع والشريحة من الجانبين المتقابلين بيد واحدة. انزع الخلاط A four بعناية مع الحرص على عدم خدش منطقة المصفوفة.

ضع الشريحة بسرعة على الرف وطبق التلوين ب. يجب تقليل التعرض للهواء لأن صبغة SCI الخمسة حساسة للأوزون. اغسل المسح لمدة دقيقة واحدة مع التحريك بسرعة متوسطة. املأ طبق التلوين C بمحلول الغسيل الدافئ الثاني.

انقل الشرائح واغسلها لمدة دقيقة واحدة. بعد الغسيل ببطء شديد ، قم بإزالة رف الشرائح من طبق التلوين C لتقليل القطرات المتبقية على الشريحة. جفف الشريحة عن طريق الدوران لمدة دقيقتين.

ثم ضع الشريحة في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر واملأها بمسح غاز الأرجون على الفور باستخدام ماسح ضوئي جيني 4 ، 000 B من الأجهزة الجزيئية لتجنب فقدان الإشارة المعروضة. فيما يلي أمثلة على أربع عينات من الحمض النووي الريبي المعزولة من الدماغ البشري. تم تقييم جودة عينة أنسجة الورم باستخدام المحلل الحيوي 2 ، 100 على شريحة RNA 6 ، 000.

تشير رؤوس الأسهم الصلبة والمفتوحة إلى موضع 18 ثانية و 28 نوعا من S-R-R-N-A على التوالي. رقم سلامة الحمض النووي الريبي أو RIN هو قياس كمي لجودة الحمض النووي الريبي ذات النوعية الجيدة للمجموع. يجب أن تنتج عينات الحمض النووي الريبي قمتين رئيسيتين فقط عند تشغيلها في محلل حيوي لمراقبة الجودة المقابلة لنوعين رئيسيين من الحمض النووي الريبي الريبوزي.

سيظهر بعض تدهور الحمض النووي الريبي على شكل مسحة قبل ذروة الحمض النووي الريبي الريبوسومي الأولى وذروة أقل بكثير ل 28 S-R-R-N-A متدهورة بشدة. سيظهر الحمض النووي الريبي منخفض الجودة ذروة عريضة أو سلسلة من القمم في أوقات الاحتفاظ المنخفضة. في حين أن قمتين من الحمض النووي الريبي الريبوسومي سيكونان منخفضي الكثافة أو لا يمكن التعرف عليهما على الإطلاق.

يجب أن تنتج المصفوفات ذات النوعية الجيدة إشارة عالية بقيم PMT منخفضة نسبيا. من المتوقع أن تكون معظم النصوص موجودة على مستويات مماثلة في العينة التجريبية والمرجعية. من المحتمل أن تفتقر التغييرات الهائلة الواسعة النطاق في التعبير الجيني إلى أي أهمية بيولوجية.

لذلك ، يجب أن تبدو معظم المصفوفة صفراء بدلا من خضراء أو حمراء. يجب أن تكون الإشارات ذات النوعية الجيدة أيضا في نطاق ديناميكي بحيث تتداخل الرسوم البيانية للإشارة تماما كما هو موضح في المخطط المبعثر لصورة المصفوفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجربة المصفوفة الدقيقة باستخدام جهاز تهجين آلي.