تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي

الهدف العام من هذا الإجراء هو استقصاء ملفات التعبير الجيني الكامنة وراء العديد من الأنماط الظاهرية أو المسارات الأيضية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل mRNA من سلالتين متضادتين من الديدان الخيطية. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تخليق cDNA يحتوي إما على تسلسلات التقاط S SI three أو SFI وتهجينها بمصفوفة دقيقة.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تهجين المصفوفة الدقيقة مع تتابعات التقاط مضادة تحتوي على S SI three وSCIFI fluoro fours. والخطوة النهائية من الإجراء هي مسح المصفوفة الدقيقة وتحليل البيانات باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مثل برنامج magic tool. وفي النهاية، يتم تحديد الجينات المرشحة التي تتوسط الظاهرة البيولوجية قيد البحث، والتي يمكن التحقق من صحتها وتقديرها كمياً باستخدام تقنيات بديلة مثل real-time PCR.

بشكل عام، قد يواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأن النيوكليوتيدات المطبوعة لا تكون مرئية للمستخدم، لذا يصعب وضع خليط تهجين متجانس فوق أكثر من 23,000 نيوكليوتيد مطبوعة بشكل فريد. ابدأ بجمع RNA من ديدان خيطية (nematodes) سليمة ومتزامنة. أولاً، يتم غسلها وإعادة تعليقها في أنابيب سعة 15 milliliter، ثم يتم ترسيبها، وتُعاد كتل الديدان المترسبة في تعليق باستخدام 7 milliliters من 0.1 molar sodium chloride و7 milliliters من سكروز بنسبة 60% weight per volume مبرد في الثلج.

بعد تحضين الديدان على الثلج لمدة 15 دقيقة، يتم تجميعها في كرات (pellets) مرة أخرى. الآن ستسبح الديدان الخالية من البكتيريا إلى الأعلى، حيث يتم جمعها وغسلها في مياه خالية من الـ RNAs ثم تجميعها في كرات. مرة أخرى، يتم نقل الكرة النظيفة والمدمجة بشكل فضفاض إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ويتم تدويره بالسرعة القصوى لمدة 30 ثانية.

تُسحب العينات وتُحفظ في 10 أحجام من RNA later عند درجة حرارة 4 °C حتى يحين وقت البدء. ولتحضير عينات RNA الكلية، تُوضع الكريات المحضرة في جهاز الطرد المركزي وتُدور بأقصى سرعة، ثم يُتخلص من السائل الطافي ويُضاف مقدار ضئيل من راتنج الطحن الجزيئي إلى الكرية. بعد ذلك، يُجمد الخليط باستخدام النيتروجين السائل مع استخدام مدقة.

اطحن معلق الديدان المجمدة حتى تتحول إلى مسحوق ناعم، مع إضافة النيتروجين السائل حسب الحاجة للحفاظ على برودة المسحوق بعد الطحن. ضع المستخلص على الثلج لمدة خمس دقائق. وبعد مرور خمس دقائق، اخلط المستخلص مع 700 µL من R-L-T-B-M-E و 472 µL من ethanol بتركيز 100% إجمالاً.

يمكن الآن عزل RNA باستخدام طقم متاح تجاريًا للوصول إلى حجم نهائي قدره 60 µL من RNA المعزول لكل عينة بيولوجية. وقبل المتابعة، يجب إزالة التلوث المحتمل بالـ DNA الجينومي عن طريق المعالجة بـ DNAS one، يليه استخدام طقم متاح تجاريًا لتنقية RNA. يتم إكمال عمل الطقم من خلال الإشارة إلى حجم 60 µL.

وأخيرًا، يتم تحديد تركيز الـ RNA وتقييم سلامته من خلال المعالجة بصبغة تحميل العينات glyoxal وتحليل الهلام قبل تهجين المصفوفات الدقيقة. وباستخدام الطرق التقليدية، يتم تحويل الـ RNA المنقى عبر النسخ العكسي إلى DNA مكمل، والذي يتم تنقيته من القالب المتحلل باستخدام طقم تجاري متاح وتخفيفه إلى حجم 60 microliters. ابدأ عملية تهجين المصفوفات الدقيقة بحجب شرائح مصفوفات sea elegance باستخدام DNA من نطف السلمون المعالج بالموجات فوق الصوتية. وبعد مرور ساعة، تُغمر الشرائح المحجوبة في ماء مقطر مزدوج ثم يتم تدويرها.

جفف الشرائح في أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter مبطنة بـ kim wipe. الآن قم بتحضير محلول منظم للتهجين قائم على الفورماميد بتركيز 2x. أولاً، قم بتسخينه إلى 55 °C لمدة 10 دقائق لإذابة البلورات تماماً.

ثم قم بطرد المزيج مركزياً لمدة دقيقة واحدة عند 10,000 gs. بعد ذلك، اخلط 25 µL من CD NA مع 25 µL من محلول التيبيث (hybridization buffer)، وقم برج المزيج برفق. الآن، قم بإجراء عملية طرد مركزي سريعة للمزيج ثم حضنه عند 80 °C لمدة 10 دقائق.

بعد فترة الحضن، قم بنقل عينة cDNA بالكامل بعناية باستخدام الماصة إلى شريحة المصفوفة الدقيقة دون لمس الشريحة، وذلك لتوزيع العينة بشكل متسق على شريحة المصفوفة الدقيقة. قم بإنزال غطاء الشريحة برفق فوق الشريحة باستخدام إبرة حقنة، وقبل أن يستقر الغطاء تماماً، اسحبه للأعلى ثم أنزله مرة أخرى باستخدام الإبرة، مما يسمح لغطاء الشريحة بالهبوط والاستقرار في مكانه برفق.

تقلل هذه التقنية من تكوين فقاعات الهواء. الآن، ضع الشريحة أفقيًا في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter، وأضف أسفل الشريحة 50 µL من الماء المقطر مرتين، واتركها لتحضن طوال الليل عند 37 °C. وفي اليوم التالي، يتم إجراء عملية تهجين ثانية بعد غسل الشريحة لفترة وجيزة.

تُطبق المرحلة الثانية من المحلول المنظم في SSC، والتي تحتوي على كواشف التقاط حساسة للضوء وكاشف Antifa، عدة مرات باستخدام التقنية نفسها، يتبع ذلك فترة تحضين قصيرة، ومزيد من عمليات الغسل والتجفيف. بعد ذلك، يمكن مسح الشريحة ضوئياً. ويمكن تحليل الصور باستخدام البرمجيات المجانية ذات الأداة السحرية مفتوحة المصدر.

تحت علامة تبويب المشروع باختصار، قم بإنشاء وحفظ مشروع جديد تحت علامة تبويب "بناء ملف التعبير الجيني" (build expression profile)، ثم اختر "تحميل زوج الصور" (load image pair) وحدد ملف الصورة الحمراء كقناة حمراء وملف الصورة الخضراء كقناة خضراء. بعد ذلك، حدد علامة تبويب "بناء ملف التعبير الجيني". اختر "تحميل قائمة الجينات" (load gene list) لرفع ملف قائمة جينات *C. elegans* الذي تم الحصول عليه من موقع GCAT لمعالجة صورة المصفوفة الدقيقة وتقسيمها إلى شبكة.

اختر علامة تبويب "build expression profile" ثم خيار "create edit grid". الآن قم بتحرير الشبكة. قم بضبط مربع الحوار باستخدام 48 لعدد الشبكات، و22 صفاً و22 عموداً لكل شبكة، مع اختيار ترقيم البقاع من اليسار إلى اليمين ومن الأعلى إلى الأسفل.

زد نسبة تغيير التباين وقم بتكبير الشبكة حتى تصبح البقع الفردية مميزة بسهولة. قم بإنشاء الشبكات عن طريق تحديد بقعة أعلى اليسار في اللوحة اليسرى، ثم النقر على مركز بقعة أعلى اليسار، تليها بقعة أعلى اليمين والصف السفلي في الشبكة الأولى. كرر إجراء إنشاء الشبكة هذا لكل من الشبكات الـ 48، بالانتقال من اليسار إلى اليمين ومن الأعلى إلى الأسفل.

بعد ذلك، قم بالحفظ من خلال اختيار علامة تبويب الملف (file) ثم اختر حفظ الشبكة الحالية (save current grid as) بمجرد إتمام الحفظ. اختر علامة تبويب "المنتهية" (finished) لاستبعاد أي بقع غير ذات صلة من التحليل. افتح علامة تبويب بناء ملف التعبير (build expression profile)، ومن خيار تحديد الشبكة (addressing gridding)، اختر تعيين علامات البقع (spot flagging).

الآن، قم بتحديد أي بقع تتبع أو فلورة خلفية، ثم احفظ التغييرات باختيار "save current flags". وكما هو موضح تحت علامة تبويب "file"، يجب تقسيم الملفات التي تم تحديدها. وأخيراً، قم بتحليل الجينات التي تم تحفيزها أو تثبيطها بواسطة عامل محدد من خلال اختيار "explore" تحت علامة تبويب "expression".

في مربع حوار الاستكشاف، قم بتعيين معايير مطابقة الجينات الدقيقة. عدد الزيادات أو الانخفاضات بمقدار ضعفين في التعبير. تُعرف الكثافة بـ x، وقيمة X هي معيار تغير التعبير.

يتم إدخال القيمة X كقيمة قصوى أكبر من X للجينات المُحفزة، وقيمة صغرى أقل من x للجينات المثبطة. في هذه التجربة، يتم إجراء تحكم في تبديل الصبغة حيث يتم تهجين عزلين مستقلين من الحمض النووي الريبي الكلي (total RNA) من يرقات المرحلة الثالثة والرابعة إما كطفرة خضراء مقابل نوع بري أحمر، أو كطفرة حمراء مقابل نوع بري أخضر لتأكيد تغيرات التعبير الجيني. يتم إجراء ثلاثة عزلات مستقلة من الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام نفس الإجراء، ثم يتم تخليق DNA متمم (cDNA) باستخدام طقم تجاري متاح، ويُجرى لكل عينة cDNA تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) في ثلاث مكررات باستخدام ثلاثة جينات تدبير منزلية (housekeeping genes) كعناصر تحكم. وللتوضيح، تفحص النتائج التالية التعبير الجيني المُحفز في VSM one.

تتميز سلالة الديدان الخيطية الطافرة AK 1468 بتعزيز المشابك العصبية. وقبل إجراء تحليل المصفوفات الدقيقة، يتم التحقق من جودة الـ RNA المستخلص باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. ويشير وجود وحدتين ريبوسوميتين سليمتين قبل وبعد المعالجة بـ dase one إلى جودة عينة الـ RNA في المصفوفة الدقيقة. يتم وسم الـ CDNA للنوع البري باللون الأحمر، بينما يتم وسم الـ CD NA للطفرة VSM one باللون الأخضر. وفي واحدة من الشبكات الـ 48 التي تم تحليلها لكل مصفوفة دقيقة، يمثل كل مربع صغير قليلاً من الـ oligonucleotide المطبوع، حيث يتم تمثيل كل oligonucleotide فريد في كل مصفوفة.

بمجرد أن أظهر تحليل المصفوفة الدقيقة (microarray) للمنسوخات المعزولة من يرقات المرحلة الرابعة أن الجينات المشفرة لبروتينات الحيوانات المنوية الرئيسية أو MSP يتم تحفيزها في طفرات VSM one، كشف تحليل المصفوفة الدقيقة ليرقات المرحلة الثالثة أيضاً عن تغيرات في التعبير ضمن نفس العائلة الجينية في الطفرة. وبالاختبار، أظهرت التنبؤات المستمدة من المصفوفة الدقيقة عبر تحليل PCR في الوقت الحقيقي أن أحد أعضاء عائلة جينات MSP، وهو MSP 32، يتم تحفيزه في طفرات VSM one. وتمثل البيانات متوسط ثلاث مكررات من تحليل PCR في الوقت الحقيقي من نفس مجموعة RNA.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية التعامل مع أدوات المعلوماتية الحيوية لإجراء التحليلات على مستوى الجينوم بأكمله، لا سيما مع توفر العديد من برامج المعلوماتية الحيوية مفتوحة المصدر للمجتمع العلمي.