تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي
يوليو 30, 2011
وقد أجري تحليل لتحديد ميكروأري ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس ، وكان يستخدم في الوقت الحقيقي PCR للتحقق من صحة البيانات وتحديد ميكروأري.
الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق في ملامح التعبير الجيني الكامنة وراء العديد من الأنماط الظاهرية أو مسارات التمثيل الغذائي. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل mRNA أولا عن سلالتين من الديدان الخيطية المتناقضة. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تجميع CD NA الذي يحتوي إما على تسلسلات التقاط S SI three أو SFI وتهجينها إلى مصفوفة دقيقة.
تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تهجين المصفوفة الدقيقة مع تسلسلات مضادة للالتقاط تحتوي على S SI three و SCIFI fluoro fours. تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في مسح المصفوفة الدقيقة وتحليل البيانات باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مثل برنامج الأداة السحرية. في النهاية ، يتم تحديد الجينات المرشحة التي تتوسط الظاهرة البيولوجية قيد التحقيق ويمكن التحقق من صحتها وقياسها كميا من خلال تقنيات بديلة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي.
بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن النيوكليوتيدات المرقطة غير مرئية للمستخدم ، لذلك من الصعب تراكب خليط تهجين متجانس على 23،000 زائد. النيوكليوتيدات المطبوعة بشكل فريد ابدأ بجمع الحمض النووي الريبي من الديدان الخيطية المتزامنة السليمة. أولا ، يتم غسلها معلقة في أنابيب سعة 15 ملليلتر ويتم تعليق كريات الديدان المحببة في سبعة ملليلتر من 0.1 مولي كلوريد الصوديوم وسبعة ملليلتر من البرد الجليدي ، 60٪ الوزن لكل حجم من السكروز.
بعد حضانة لمدة 15 دقيقة على الجليد ، يتم تكوير الديدان مرة أخرى. الآن سوف تسبح الديدان الخالية من البكتيريا ، ويتم جمعها ، وغسلها في الحمض النووي الريبي ، والماء الحر ، والحبيبات. مرة أخرى ، يتم نقل الحبيبات النظيفة المضغوطة بشكل فضفاض إلى أنبوب طرد مركزي صغير يتم تدويره بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية.
يتم استنشاقها وتخزينها في 10 أحجام من الحمض النووي الريبي لاحقا عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للمضي قدما. لتحضير عينات الحمض النووي الريبي الإجمالية ، قم بالطرد المركزي للكريات المحضرة بأقصى سرعة ، وتخلص من السوبر الخارق وأضف قليلا من راتنج الطحن الجزيئي إلى الحبيبات. ثم قم بتجميد المزيج باستخدام النيتروجين السائل باستخدام مدقة.
قم بطحن معلق الدودة المجمدة إلى مسحوق ناعم ، نيتروجين سائل حسب الحاجة للحفاظ على المسحوق باردا بعد الطحن. ضع المستخلص على الثلج لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، اخلطي المستخلص مع 700 ميكرولتر من R-L-T-B-M-E و 472 ميكرولتر من إجمالي 100٪ من الإيثانول.
يمكن الآن عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة متوفرة تجاريا إلى حجم نهائي يبلغ 60 ميكرولترا من الحمض النووي الريبي المعزول لكل عينة بيولوجية. قبل المتابعة ، قم بإزالة تلوث الحمض النووي الجيني المحتمل عن طريق المعالجة باستخدام DNAS واحد ، متبوعا باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريا. أكمل المجموعة بالإشارة إلى حجم 60 ميكرولتر.
أخيرا ، حدد تركيز الحمض النووي الريبي وقم بتقييم سلامة الحمض النووي الريبي عن طريق المعالجة بتحميل عينة الغليوكسال وتحليل الصبغة والهلام قبل تهجين المصفوفات الدقيقة باستخدام الطرق التقليدية يتم عكس الحمض النووي الريبي المنقى إلى الحمض النووي التكميلي ، والذي يتم تنقيته من القالب المتحلل بمجموعة متوفرة تجاريا والتلميح إلى حجم 60 ميكرولترا. ابدأ التهجين الدقيق عن طريق منع أناقة البحر. ينزلق المصفوفات الدقيقة مع الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون الصوتي بعد ساعة ، قم بإمالة الشرائح المحظورة في الماء المقطر المزدوج وقم بتدويرها.
جفف الشرائح في أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر مبطنة بمنديل كيم. الآن قم بإعداد مخزن مؤقت تهجين قائم على الأميد على شكل اثنين x. أولا ، قم بتسخينه إلى 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإذابة بلوراته بالكامل.
ثم قم بجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 10 ، 000 جرام. بعد ذلك ، امزج 25 ميكرولترا من CD NA مع 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتهجين ، ونفض الخليط برفق. الآن قم بإجراء دوران سريع للمزيج واحتضانه عند 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
بعد الحضانة ، قم بسحب عينة CDNA بأكملها بعناية على شريحة المصفوفة الدقيقة دون لمس الشريحة. لنشر العينة بشكل موحد على شريحة المصفوفة الدقيقة. قم بخفض زلة الغطاء برفق على الشريحة باستخدام إبرة حقنة قبل خفض زلة الغطاء تماما ، واسحب للخلف لأعلى ولأسفل باستخدام الإبرة مرة أخرى للسماح للغطاء بالانزلاق برفق في مكانه.
تقلل هذه التقنية من تكوين فقاعات الهواء. الآن ضع الشريحة أفقيا في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر أسفل الشريحة عند 50 ميكرولترا من الماء المقطر المزدوج واتركها تحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي. يتم إجراء تهجين ثان لفترة وجيزة بعد غسل الشريحة.
عدة مرات في SSC ، يتم تطبيق المخزن المؤقت الثاني ، الذي يحتوي على كواشف التقاط حساسة للضوء وكاشف Antifa باستخدام نفس التقنية متبوعة بحضانة قصيرة ، والمزيد من الغسيل والتجفيف. يمكن بعد ذلك مسح الشريحة. يمكن تحليل الصور باستخدام البرنامج المجاني باستخدام أداة سحرية مفتوحة المصدر.
باختصار ضمن علامة تبويب المشروع ، قم بإنشاء مشروع جديد وحفظه ضمن علامة التبويب ملف تعريف تعبير البناء ، وحدد تحميل زوج الصورة وحدد ملف الصورة الأحمر باللون الأحمر وملف الصورة الخضراء باللون الأخضر. ثم حدد علامة التبويب ملف تعريف تعبير الإنشاء. اختر تحميل قائمة الجينات لتحميل ملف قائمة الجينات C elegance الذي تم الحصول عليه من موقع GCAT على الويب لمعالجة صورة المصفوفة الدقيقة وشبكتها.
حدد علامة التبويب ملف تعريف تعبير الإنشاء وقم بإنشاء خيار تحرير الشبكة. الآن قم بتحرير الشبكة. قم بإعداد مربع الحوار باستخدام 48 لعدد الشبكات و 22 صفا و 22 عمودا لكل شبكة واختيار ترقيم النقاط من اليسار إلى اليمين ومن أعلى إلى أسفل.
قم بزيادة النسبة المئوية لتغيير التباين وتكبير الشبكة حتى يمكن تمييز النقاط الفردية بسهولة. قم بإنشاء الشبكات عن طريق تحديد تعيين أعلى بقعة يسرى على اللوحة اليسرى ثم النقر فوق منتصف البقعة العلوية اليسرى ، متبوعة بالجزء العلوي الأيمن والصف السفلي على الشبكة الأولى. كرر إجراء الشبكة هذا لكل شبكة من الشبكات ال 48 من اليسار إلى اليمين ومن أعلى إلى أسفل.
ثم احفظ عن طريق تحديد علامة تبويب الملف واحفظ الشبكة الحالية كما تم حفظها مرة واحدة. حدد علامة التبويب النهائية لإزالة أي نقاط غير ذات صلة من التحليل. افتح علامة التبويب ملف تعريف تعبير البنية وضمن خيار شبكة العنون، حدد وضع علامة موضعية.
الآن قم بوضع علامة على أي بقع متسلسلة أو مضان في الخلفية واحفظها عن طريق تحديد حفظ الأعلام الحالية. كما هو الحال ضمن علامة تبويب الملف ، يجب تقسيم الملفات التي تم وضع علامة عليها. أخيرا ، قم بتحليل الجينات التي يتم إحداثها أو قمعها بواسطة عامل محدد عن طريق تحديد استكشاف ضمن علامة تبويب التعبير.
في مربع حوار الاستكشاف ، قم بتعيين معايير مطابقة الجينات الدقيقة. عدد الزيادة أو النقصان في التعبير. تعرف الشدة باسم x وقيمة X هي معيار تغيير التعبير.
X هو إدخال تحت القيمة القصوى أكبر من X للجينات المستحثة والقيمة الدنيا أقل من x للجينات المكبوتة. في هذه التجربة ، يتم إجراء التحكم في مقايضة الصبغة ، حيث يتم تهجين عزلتي الحمض النووي الريبي الإجماليان المستقلتين من المرحلة الثالثة والمرحلة الرابعة إما على أنها متحولة خضراء مقابل نوع بري أحمر ، في حين أن النوع الأحمر المتحور مقابل النوع البري الأخضر لتأكيد تغييرات التعبير الجيني يجعل ثلاث عزلات إجمالية مستقلة للحمض النووي الريبي باستخدام نفس الإجراء لتجميع CDNA مع مجموعة متاحة تجاريا ، ولكل عينة CD NA ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي وثلاث نسخ باستخدام ثلاثة جينات للتدبير المنزلي كضوابط. للتوضيح ، تفحص النتائج التالية التعبير الجيني المستحث في VSM واحد.
AK 1468 طفرات سلالة الديدان الخيطية تتميز بالتشابك المشبكي المعزز قبل إجراء تحليل المصفوفات الدقيقة ، يتم فحص جودة الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. يشير وجود وحدتين فرعيتين ريبوسوميتين سليمتين قبل وبعد dase ، ويشير علاج واحد إلى وجود عينة جيدة من الحمض النووي الريبي في المصفوفة الدقيقة ، حيث يتم تصنيف CDNA باللون الأحمر و VSM ، قرص CD NA المتحور ، يتم تصنيفه باللون الأخضر. في هذه الشبكة، ال 48 التي تم تحليلها لكل مصفوفة دقيقة، يمثل كل مربع صغير قليل النوكليوتيد المطبوع في كل مصفوفة، ويتم تمثيل كل قليل النوكليوتيد فريد
.بمجرد أن يظهر تحليل المصفوفات الدقيقة للنصوص المعزولة من يرقات المرحلة الرابعة أن الجينات المشفرة لبروتينات المنوية الرئيسية أو MSP يتم إحداثها في VSM ، يكشف تحليل المصفوفة الدقيقة للطفرات في المرحلة الثالثة أيضا عن تغييرات التعبير داخل نفس عائلة الجينات في الطفرة. اختبار. تكشف التنبؤات من المصفوفة الدقيقة عن طريق تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أن عضوا واحدا من عائلة الجينات M ms P P 32 ، يتم إحداثه في طفرات VSM واحدة. تمثل البيانات متوسط ثلاث نسخ مكررة من تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي من نفس مجموعة الحمض النووي الريبي.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعامل مع أدوات المعلوماتية الحيوية لتحليل الجينوم على مستوى الجينوم ، لا سيما بالنظر إلى وجود العديد من برامج المعلوماتية الحيوية مفتوحة المصدر المتاحة للمجتمع العلمي.
نظرة عامة
تبحث هذه الدراسة في ملفات تعريف التعبير الجيني في C. elegans باستخدام تحليل المصفوفات الدقيقة وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي للتحقق. تتضمن المنهجية عزل mRNA من سلالات مختلفة من الديدان الخيطية لفهم الظواهر البيولوجية الأساسية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الوراثة
- تكنولوجيا المصفوفات الدقيقة
الخلفية
- يعمل C. elegans ككائن نموذجي لدراسة التعبير الجيني.
- يتيح تحليل المصفوفات الدقيقة فحص آلاف الجينات في وقت واحد.
- يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لتأكيد نتائج المصفوفات الدقيقة.
- يمكن أن يؤدي فهم التعبير الجيني إلى توضيح المسارات الأيضية والنمط الظاهري.
هدف الدراسة
- تحديد الجينات المرشحة المشاركة في عمليات بيولوجية محددة.
- التحقق من صحة بيانات المصفوفات الدقيقة من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي.
- تعزيز فهم التعبير الجيني في الديدان الخيطية.
الطرق المستخدمة
- عزل mRNA من سلالات الديدان الخيطية المتناقضة.
- تخليق cDNA وتهجينها مع المصفوفات الدقيقة.
- استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية لتحليل البيانات.
- التحقق من النتائج من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي.
النتائج الرئيسية
- تحديد الجينات المرشحة التي تتوسط الظواهر البيولوجية.
- التحقق الناجح من بيانات المصفوفات الدقيقة بتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي.
- رؤى حول ملفات تعريف التعبير الجيني عبر السلالات المختلفة.
- استخدام أدوات المعلوماتية الحيوية لتحليل شامل للبيانات.
الاستنتاجات
- توفر الدراسة إطارًا لتحليل التعبير الجيني في C. elegans.
- يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي كطريقة فعالة للتحقق من نتائج المصفوفات الدقيقة.
- تساهم النتائج في فهم الآليات الوراثية في الديدان الخيطية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma researchers to profile gene expression changes in model organisms, supporting target validation by identifying differentially expressed genes linked to phenotypic outcomes. By combining microarray screening with real-time PCR confirmation, it provides a scalable approach for mechanistic de-risking in early discovery, helping prioritize targets with stronger predictive confidence before lead identification efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing gene expression shifts associated with enhanced synaptic connectivity in mutant models.
- Operational Value: Enables pathway clarification through systematic screening of thousands of genes to pinpoint candidates like MSP-32 for further functional study.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by confirming gene induction via orthogonal real-time PCR validation.
- Operational Value: Supports assay standardization and reproducibility through dye-swap controls and triplicate measurements, reducing false positives in target identification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by linking synaptic phenotypes to MSP signaling pathways, which have conserved roles in neuromuscular junction regulation across species.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker exploration by identifying secreted signaling molecules like MSPs that may serve as measurable indicators of pathway activity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis-driven target validation to lead identification, where expression profiling informs target selection and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by connecting genetic perturbations to molecular phenotypes through expression profiling.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via microarray intensity measurements and real-time PCR quantification, enabling condition comparisons.
- Analytics: Highlights bioinformatic-driven readouts such as fold-change thresholds and statistical significance, aiding in hit selection and prioritization.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by identifying evolutionarily conserved signaling families (e.g., MSP/Eph) with relevance to human synaptic biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling genetic responses across diverse phenotypes, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by validating microarray hits with real-time PCR, reducing mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability through standardized RNA isolation, labeling, and hybridization protocols applicable across strains.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing multi-modal evidence (transcriptomic + qPCR) for target prioritization, lowering late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by distinguishing robust expression changes from noise, supporting data-driven resource allocation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, RNA handling, and microarray hybridization techniques to ensure sample integrity and data quality.
- Dependent on access to microarray scanners, bioinformatic software (e.g., Magic Tool), and real-time PCR instrumentation for end-to-end execution.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for RNA isolation, labeling, and data analysis to ensure reproducibility across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different model systems or tissue types due to variability in RNA yield and hybridization efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for technical skill in grid alignment and spot flagging during microarray analysis, which can affect data accuracy if not performed correctly.
