الكشف عن مرحلة ما بعد التعديلات متعدية على Nucleosomes سليمة الأصلية بواسطة ELISA

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد المستويات النسبية للتعديلات اللاحقة للترجمة بدقة ضمن مستحضرات إجمالي النيوكليوسومات الخلوية التي تم الحصول عليها من مليون خلية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد ثقافات متجانسة عالية الجودة لخلايا الثدييات. ثم يتم عزل النوى من الخلايا من خلال الاضطراب الميكانيكي باستخدام الهبوط والمجانس والطرد المركزي.

الخطوة التالية هي الحصول على نيوكليوسومات سليمة عن طريق هضم الكروماتين الموجود داخل النوى وإجراء سلسلة من عمليات الاستخراج منخفضة التوتر. أخيرا ، يتم استجواب النيوكليوسومات باستخدام اختبار ELIZA مع الضوابط المناسبة لتحديد تعديلات محددة بعد الترجمة. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح المستويات النسبية للتعديلات المحددة الموجودة داخل عينات النيوكليوسوم.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل النشاف الغربي والترسيب المناعي للكروماتين هي أنه يمكن تحديد صورة عالمية لعدد من حالات تعديل النيوكليوسوم بسهولة. هذه الطريقة أكثر حساسية ودقة من النشاف الغربي ويمكن إجراؤها في معظم المختبرات المجهزة لتجارب البيولوجيا الجزيئية العامة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية وعلم التخلق ، مثل ما يحدث عند حدوث أحداث التمايز وإعادة البرمجة الرئيسية.

لبدء الإجراء ، تقوم أولا بتسريب الخلايا بثلاثة ملليلتر من التربسين لكل صفيحة 15 سم إلى الخلايا المدخلة حديثا. أضف 20 مل من الزبدات PBS المثلج. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وقم بالطرد المركزي للأنبوب لجمع الخلايا بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق ، وشفط المادة الطافية وأضف 10 مل من الزبدات PBS المثلجة لغسل جهاز الطرد المركزي معلق الخلية مرة أخرى عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت للتحلل باستخدام مثبطات الإنزيم البروتيني كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بعد ذلك ، قم بتوصيل الخلايا إلى مدقة من النوع A B أسفل الخالط على الجليد لأسفل متجانسة ب 20 ضربة. ثم انقل المتجانس إلى أنبوب طرد مركزي على الجليد.

الطرد المركزي العينة عند 2000 غرام لمدة 10 دقائق. عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة الاسم الفائق ، والذي يحتوي على مادة السيتوبلازمية وإعادة الظهر.

قم بتعليق الحبيبات في ملليلترين من محلول الغسيل البارد المثلج C باستخدام مثبطات البروتياز ، ضع طبقة من المادة المعلقة برفق على وسادة من السكروز بنسبة خمسة ملليلتر و 30٪ في أنبوب طرد مركزي بارد. لعزل جهاز الطرد المركزي للنوى عند 2 ، 400 جم لمدة خمس دقائق في دلو متأرجح ، ستنتقل نوى الدوار عبر الوسادة ويبقى الحطام الخلوي في الواجهة. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة كل حجم السائل بعناية وأعد تعليق النوى في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل البارد C مع مثبطات البروتياز ، وانقل النوى إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

لبدء عزل النيوكليوسومات ، أضف ثلاثة ميكرولترات من كلوريد الكالسيوم 0.1 مولار إلى النوى وضعها في كتلة حرارية 37 درجة مئوية حتى يتم توازن. ثم أضف وحدتين من نوكلياز الكوك الدقيق في 10 ميكرولتر من نوكلياز الكوك الصغير ، واحتضان لمدة 12 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تخلط بشكل متكرر باستخدام طرف الماصة.

بعد الحضانة ، أوقف التفاعل بستة ميكرولترات من 0.5 مولي الصوديوم E-D-T-A-P-H ثمانية ، وضعه على الثلج ليبرد. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 2000 جم لمدة أربع دقائق بعد الطرد المركزي ، وتخلص من snat وأعد تعليق الحبيبات. في 300 ميكرولتر من 0.2 ملليمول أو EDTA الصوديوم، احتضن العينة على الثلج لمدة ساعة واحدة مع سحب العينة اللطيف من حين لآخر للخلط.

بعد الطرد المركزي عند 3000 جم لمدة أربع دقائق. عند أربع درجات مئوية ، اجمع المادة الطافية ، التي تحتوي على النيوكليوسومات الحرة في أنبوب فوجي جديد وقم بتخزينها على الجليد نيوكليوسومات إضافية متعمدة. الحبيبات في 300 ميكرولتر من 0.2 ملليمول أو EDT الصوديوم كما كان من قبل واحتضانها على الثلج لمدة ساعة واحدة مع الخلط اللطيف من حين لآخر.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للعينة. مرة أخرى ، اجمع بين snat الناتج والعينة المتبقية في أنبوب fuge الصغير على الجليد. لبدء فحص إليزا للنواة ، قم بتحميل صفيحة إليزا 96 بئر بسلسلة تنازلية من خمسة تخفيفات تسلسلية مزدوجة من النيوكليوسومات ومخزن الطلاء المؤقت ، بدءا من 0.1 ميكروغرام لكل 50 ميكرولتر في البئر العلوي ، يجب تحميل جميع سلاسل التخفيف في ثلاث نسخ.

تذكر تضمين الآبار ذات المخزن المؤقت للطلاء فقط كعناصر تحكم. احتضن الطبق طوال الليل عند أربع درجات مئوية في اليوم التالي. استخدم غسالة الألواح لغسل الألواح ب 200 ميكرولتر لكل بئر بنسبة 0.5٪ بين 20 في PBS في درجة حرارة الغرفة أربع مرات لمدة 10 دقائق مجتمعة.

أضف الآن 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول الحجب واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على دوار. بعد الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت المانع عن طريق هز اللوحة المقلوبة بسرعة فوق الحوض. بعد ذلك ، أضف الجسم المضاد الأولي المخفف بحجم 50 ميكرولتر لكل بئر في محلول 5٪ PSA في 0.05٪ بين 20 في PBS احتضان المحلول لمدة ساعة واحدة على دوار في درجة حرارة الغرفة.

بعد حضانة الجسم المضاد الأولي ، اغسل الألواح كما كان من قبل باستخدام غسالة اللوحة. بمجرد اكتمال إجراء الغسيل ، أضف 50 ميكرولترا لكل بئر من الجسم المضاد الثانوي المترافق مع بيروكسيداز الفجل المخفف في PBS مع 5٪ BS و A و 0.5٪ 20 احتضان درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على دوار بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية. اغسل الأطباق كما كان من قبل.

استخدام غسالة اللوحة لتطوير اللوحة. أضف 50 ميكرولترا من ركيزة TMB Eliza إلى كل بئر واحتضن لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، ستتحول آبار صفيحة ELIZA إلى اللون الأزرق وتتناسب شدتها مع كمية تعديلات النيوكليوسوم الموجودة داخل كل منها.

حسنا ، أوقف رد الفعل. بإضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من اثنين من حامض الكبريتيك العادي. سيتغير اللون إلى جهاز طرد مركزي بني للوحة عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين لتبديد أي فقاعات هواء.

اللوحة جاهزة الآن للقياس الكمي على قارئ لوحة مترية ملونة. أخيرا ، اقرأ اللوحة عند 450 نانومتر وقم بتصدير النتائج للتحليل. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح بعد تطويرها.

فتحت هذه التقنية الباب أمام الباحثين في مجال أبحاث الخلايا الجذعية لاستكشاف الاستجابات اللاجينية لأحداث التمايز وإعادة البرمجة على مستوى بروتين epi بأكمله.