يعيش التصوير من النتوء خلية من البشرة من اسماك الزرد النامية

تتطلب صيانة الأنسجة الظهارية الإزالة المستمرة للخلايا التالفة والمحتضرة دون تعطيل وظيفة الحاجز. لتحقيق هذا البثق الظهاري ، قم ببثق الخلايا المحتضرة عن طريق تكوين وتقلص حلقة من الأكتين والميوسين في الخلية المحيطة بالخلية المحتضرة لإخراجها مع سد أي فجوات قد تكون ناتجة عن خروجها. في مقال الفيديو هذا ، طريقة للحث على بثق الخلايا المبرمج وتصويرها من بشرة أسماك الحمار الوحشي اليرقات في الوقت الفعلي.

في الموضح ، يتم تحقيق ذلك عن طريق حقن بروتين فلوري أحمر يسمى مسبار الأكتين F في مرحلة خلية واحدة من أجنة أسماك الزرد المعدلة وراثيا تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر في البشرة لتصور الخيوط المؤثرة في الأنسجة الظهارية. في اليوم الرابع ، يتم بعد معالجة يرقات ما بعد التخصيص التي تعبر عن كل من GFP و RFP باستخدام G four 18 للحث على موت الخلايا المبرمج في البشرة. يتم تصور ديناميكيات الأكتين وتغيرات شكل الخلية الظهارية التي تحدث أثناء البثق عن طريق التصوير بفاصل زمني على مجهر ثنائي البؤر للقرص الدوار.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل القوة المناعية والتحليلات ، هي أنه يمكننا ملاحظة التغيرات السريعة وديناميكيات الأكتين التي تحدث أثناء عملية البثق إذا كانت في نسيج ظهاري حي. في هذا الفيديو ، سنعرض لك إجراء لتصوير بثق الخلايا المبرمجة من بشرة أسماك الحمار الوحشي النامية في الوقت الفعلي. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لفهم كيفية قيام الخلايا بإعادة ترتيب الهيكل الخلوي الأكتوني بشكل منسق لإزالة الخلايا المبرمجة مع الحفاظ على وظيفة الحاجز وكيف قد يؤدي تعطيل عملية البثق إلى حالات مرضية معينة.

لذلك دعونا نبدأ: لتصور ديناميكيات التمثيل أثناء بثق الخلية في بشرة أسماك الزرد النامية ، ابدأ بإذابة الحمض النووي الريبي المنسوخ مسبقا على الجليد. نقوم بنسخ Mr.mRNA لترميز البروتين الفلوري الأحمر المدمجة في مجال التماثل لليوتروفين وتعمل في بروتين ملزم. أضف الفينول الأحمر إلى الحمض النووي الريبي بنسبة واحد إلى واحد للحصول على تركيز نهائي من الحمض النووي الريبي يبلغ حوالي 30 نانوغراما لكل ميكرولتر وقم بتحميل ميكرولتر واحد من المحلول في إبرة شعرية مسحوبة عن طريق الملء الخلفي.

اجمع حوالي 75 أجنة من مرحلة 1 خلية C-K-G-F-P في E ثلاثة عازلة. قم بضرب الأجنة المجمعة في قالب الحقن المجهري باستخدام ماصة معكرونة من خمسة وثلاثة أرباع وقم بتوجيه الأجنة برفق في الحوض باستخدام FST Dumont. خامسا ، يعمل الملقط بسرعة لتجنب الاضطرار إلى حقن الحمض النووي الريبي في أجنة متعددة المراحل تحت مجهر مجسم تشريح مختبري قياسي.

استخدم حاقن دقيق يتم التحكم فيه بالضغط لحقن الحمض النووي الريبي في نير الأجنة كأحفورة من الفينول. يجب أن يكون اللون الأحمر مرئيا في الجنين بعد الحقن. تأكد من حقن ما لا يقل عن 50 جنينا لكل تجربة.

قم بفرز الأجنة لإزالة أي بويضات غير مخصبة أو تالفة واحتضان جميع الأجنة المتبقية عند 28 درجة مئوية. بعد 24 ساعة ، استخدم مجهر تشريح الفلورسنت لاختيار أجنة أسماك الزرد التي تحتوي على مستوى عال من تألق GFP في البشرة و RFP المسمى مضان التمثيل. احتضان الأجنة المختارة عند 28 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمضي قدما في العلاج الدوائي للحث على التعرض لموت الخلايا المبرمج للجليكوسيد الأميني.

يتسبب المضاد الحيوي G four 18 أو الدواء في بثق الخلايا المبرمجة من بشرة يرقات الزرد النامية. الأهم من ذلك ، أن هذا العلاج يعمل فقط على اليرقات التي بعد أربعة أيام من الإخصاب وأكبر سنا للحث على بثق الخلايا. اجمع ما يصل إلى 25 يرقات من سمك الزرد بعد 4 أيام من الإخصاب تعبر عن كل من GFP و RFP في طبق استزراع 35 × 10 ملم يحتوي على ثلاثة ملليلتر من E ثلاثة متوسطة.

استبدل الوسط بعناية بثلاثة ملليلتر من E ثلاثة تحتوي على ملليغرام واحد لكل مليلتر من G أربعة 18 واحتضان اليرقة في الدواء لمدة أربع ساعات في الظلام عند 28 درجة مئوية. ثم قم بإزالة الوسائط واستبدلها بثلاث وسائط دافئة تحتوي على 0.02٪ trica وانتقل إلى تركيب اليرقات لتركيب اليرقات للتصوير. انقل ما يصل إلى ثلاث يرقات إلى أنبوب مصفاد سعة 1.5 ملليلتر وقم بإزالة معظم وسط E الثلاثة.

باستخدام ماصة طرف ماصة مقطوعة، يدخل 120 ميكرولتر من الذوبان المنخفض بنسبة 1٪ في مزيج الأنبوب. ثم قم بتقطيع اليرقات وخليط اليرقات برفق على زجاج الغطاء في قاع طبق ثقافة matech. باستخدام حامل دبوس FST مع دبوس إدخال أو إبرة تنجستن متصلة ، قم بتوجيه اليرقات بسرعة بحيث تكون مستقيمة ومسطحة على زجاج الغطاء.

اسمح ل aose بالتصلب. ثم املأ الطبق برفق ب E ثلاثة متوسطة تحتوي على 0.02٪ trica. لقد وجدنا أن العملية الكاملة لبثق الخلايا المبرمج من بشرة يرقات الزرد النامية تستغرق حوالي 20 دقيقة.

نوضح هنا كيفية إعداد تجربة تصوير بفاصل زمني باستخدام مجهر متحد البؤر للقرص الدوار وبرنامج و / أو IQ لجمع طائرات Z من سلسلة Z من خلال طبقة واحدة من بشرة الزرد. أولا ، قم بتشغيل كاميرا مجهر ليزر الأرجون والهيليوم نيون ومصباح فلورسنت epi داخل برنامج و أو IQ. قم بإنشاء بروتوكول سلسلة زمنية يحتوي على الأطوال الموجية المراد تصويرها.

تواتر الفترات الفاصلة بين التقاط الصور وعدد مرات الالتقاط يجب تكرار الالتقاط ضع طبق الماتيك الذي يحتوي على العينة برفق على مرحلة المجهر ثم استخدم هدفا 20 مرة مع الضوء المنقول للتركيز على اليرقات. حرك هدف الغمر في الماء 40 مرة إلى الموضع الصحيح. باستخدام هذا الهدف ، يمكننا تصوير ما يقرب من 20 إلى 25 خلية لكل حقل ، مما يسمح لنا بمتابعة السلوكيات الخلوية أثناء البثق ، مع حل ديناميكيات التمثيل تحت الخلوية أيضا.

ضع قطرة ماء بحذر فوق الهدف 40 مرة وضع طبق الماتيك في الأعلى بسرعة. حدد العينة باستخدام إضاءة المجال الساطع ثم استخدم مضان epi 488 نانومتر للتركيز بشكل خاص على البشرة الإيجابية GFP. قم بالتبديل إلى وضع المسح متحد البؤر.

اضبط شدة الليزر ووقت التعرض لكل قناة وفقا لذلك. احرص على موازنة قوة الليزر ووقت التعرض للكشف الأمثل عن إشارتك ومنع أي سمية ضوئية. لتحديد الخلايا البثق ، استخدم مضان epi لتصور البشرة المسمى GFP وتحديد مجموعة من الخلايا في نمط وردة كلاسيكي يتكون من مجموعة من الخلايا المحيطة بخلية مستديرة صغيرة في المنتصف.

بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون هناك تراكم لطلب تقديم العروض المسمى الأكتين المرئي كحلقة حول الخلية المستديرة الصغيرة في المنتصف ، وهي سمة مميزة لبثق الخلية. بمجرد تحديد خلية البثق ، قم بتعيين الحدود العليا والدنيا بسرعة لسلسلة Z وحجم الخطوة. ثم ابدأ في الحصول على أربع مجموعات بيانات متحد البؤر D لعرض البيانات وتصور تقلص حلقة الأكتين والسلوكيات الظهارية التي تحدث حول الخلية المحتضرة.

بمرور الوقت ، قم بعمل إسقاطات ثلاثية الأبعاد لسلسلة Z واحفظ البيانات كملف فيلم. يمكن تنفيذ هذه الخطوة باستخدام مجموعة متنوعة من حزم البرامج. يوضح هذا الشكل التعبير عن RFP UTR CH في بشرة يرقات الزرد CK GFP بعد أربعة أيام من الإخصاب.

لا يزال هناك إطار لإسقاطات Z من فيلم بفاصل زمني تتبع ديناميكيات التمثيل المباشر. أثناء عملية بثق الخلايا الظهارية ، تظهر الأسهم إلى حلقة الأكتين التي تشكلها الخلايا المجاورة ، والتي تنقبض وتغلق على مدار دقيقتين. باتباع هذا الإجراء ، يمكننا استخدام طرق أخرى مع هذه التقنية ، مثل استخدام مثبطات كيميائية أو طفرات جينية لفهم أفضل كيف يمكن أن يؤدي تغيير البثق إلى حالات مرضية معينة.

نابعا من الفشل في إزالة الخلايا المبرمجة ، أوضحنا لك للتو كيفية إعداد تجربة تصوير بفاصل زمني لتصور عملية البثق من بشرة سمكة الزرد النامية. عند تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحد من كمية الضوء المعرضة لعينتك لمنع أي تبيض أو سمية للصور. هذا كل شيء.

شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.