عالية الإنتاجية الكمية RT-PCR في عينات C. c.

بروتوكولنا بتحسين كل من الإنتاجية وكفاءة الوقت للحصول على بيانات RT-qPCR مباشرة من عينة واحدة أو صغيرة الحجم دون الحاجة إلى عزل الحمض النووي الريبي. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن الحصول على أكثر من 9000 نتيجة RT-qPCR في يومين فقط من العمل على مقاعد البدلاء ، وهي عملية تستغرق عادة حوالي خمسة أسابيع باستخدام qPCR القياسي 96 بئر. يوفر هذا البروتوكول اختبار RT-qPCR أسرع وقوي وعالي الحساسية في C.elegans ، وهو مثالي لمراقبة التباين بين الأفراد في التعبير الجيني بين الديدان متساوية الجين.

ابدأ بقطف الديدان من حديقة البكتيريا على صفيحة متوسطة نمو الديدان الخيطية الطازجة غير المصنفة والسماح للديدان بالتحرك حول الطبق لمدة خمس دقائق. أثناء تأقلم الديدان ، في غطاء خال من RNase ، امزج 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت للتحلل مع واحد إلى 100 Dnase I لكل عينة وضع غطاء شريط PCR رأسا على عقب على منصة نطاق التشريح. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من مزيج التحلل إلى أغطية أنابيب PCR المقببة ، واغرف الديدان من اللوحة لتجنب نقل البكتيريا إلى كل فتحة من الغطاء.

عندما يتم نقل جميع الديدان ، أغلق الأغطية وقم بتدوير الأنابيب لمدة خمس ثوان قبل وضع الأنابيب في قارورة ديوار من النيتروجين السائل. بعد الثواني الخمس الأخيرة ، قم بإذابة الأنابيب في حمام مائي 40 درجة مئوية قبل تكرار إجراء التجميد / الذوبان تسع مرات أخرى. بعد دورة التجميد / الذوبان الأخيرة ، اخلطي العينات المحللة في الخلاط الحراري لمدة 20 إلى 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية وحوالي 1800 دورة في الدقيقة.

في نهاية حضانة الخلط ، قم بتدوير العينات كما هو موضح وأضف ميكرولتر واحد من محلول التوقف المذاب حديثا إلى كل أنبوب. للنسخ العكسي للعينات الدافئة السائبة ، في غطاء خال من RNase ، قم بإعداد مزيج رئيسي من العازلة الإنزيمية وأضف 14 ميكرولترا من المزيج الرئيسي إلى 11 ميكرولترا من كل عينة. قم بتشغيل العينات من خلال جهاز تدوير حراري باستخدام برنامج النسخ العكسي المشار إليه وقم بتخفيف منتج (كدنا) الناتج بنسبة واحد إلى أربعة في الماء الخالي من النوكلياز.

للتضخيم المسبق المحدد للهدف ، أضف 3.75 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للتضخيم المسبق في بئر واحد لكل عينة في صفيحة مكونة من 96 بئرا وأضف 1.25 ميكرولتر من كل محلول (كدنا) إلى كل بئر من المزيج الرئيسي. عندما يتم تحميل جميع العينات ، قم بتغطية اللوحة بشريط مانع للتسرب وقم بتدوير العينات لفترة وجيزة قبل تدويرها عن طريق الطرد المركزي ، ثم قم بتحميل اللوحة على جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل البرنامج كما هو موضح. لإزالة البادئات غير المدمجة من التضخيم المسبق ، في نهاية الدورة الحرارية ، قم بالطرد المركزي للوحة العينة وإزالة الختم بعناية.

أضف ميكرولترين من نوكلياز خارجي أتقن المزيج إلى كل تفاعل تضخيم مسبق وأعد إغلاقه وجهاز طرد مركزي وقم بتحميل اللوحة مرة أخرى في الدراجة الحرارية. في نهاية الدورة ، قم بتخفيف العينات ب 18 ميكرولترا من المخزن المؤقت Tris-EDTA. لإعداد شريحة متعددة المصفوفات ، أضف 3.6 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لتحميل الفحص و 0.4 ميكرولتر من 50 ميكرومولار التمهيدي العكسي الأمامي في بئر واحد لكل عينة في لوحة 384 بئر.

ثم أضف 2.2 ميكرولتر من مزيج العينة الرئيسي و 1.8 ميكرولتر من كل نوكلياز خارجي مضخم مسبقا عالجت عينة إلى الآبار المناسبة للوحة. لإعداد شريحة أحادية المصفوفة ، أضف 5.4 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لتحميل الفحص و 0.6 ميكرولتر من التمهيدي العكسي الأمامي إلى بئر واحد لكل عينة من لوحة ثانية مكونة من 384 بئرا ، ثم أضف 3.3 ميكرولتر من مزيج العينة الرئيسي و 2.7 ميكرولتر من كل نوكلياز خارجي مضخم مسبقا عالجت عينة إلى الآبار المناسبة للوحة المصفوفة المفردة المعدة. لتجهيز شريحة الموائع النانوية لأول مرة ، أمسك الشريحة بزاوية 45 درجة ببطء وبعناية ، قم بحقن 150 ميكرولترا من سائل خط التحكم في مراكم الشريحة.

عندما يتم تحميل كل السائل ، قم بإزالة الفيلم الواقي الأزرق من أسفل الشريحة وضع الشريحة في آلة تحضير PCR للموائع النانوية بحيث يكون الباركود متجها للخارج. ثم قم بتشغيل البرنامج النصي Prime (153x). بعد التحضير ، ضع الشريحة على سطح مظلم وعندما يتم تحميل كل اختبار أو مزيج عينة ، قم بإزالة سدادات الحاجز المقابلة إذا لزم الأمر وأضف الحجم المناسب من الفحص أو مزيج العينة إلى المداخل المقابلة لشريحة الموائع النانوية وفقا للخطة التجريبية.

بعد التحميل ، ضع الشريحة في جهاز إعادة التدوير الحراري النانوي وقم بتشغيل البروتوكول المناسب في برنامج جمع البيانات. إذا لم يتم استخدام شريحة المصفوفات المتعددة بالكامل، فقم بإجراء تشغيل ما بعد البرنامج النصي للسماح باستخدام مصب المصفوفات المتبقية. لاختبار ما إذا كان بروتوكول الدودة إلى المعالجة المركزية للتكنولوجيا هو طريقة صالحة لاستخراج (كدنا) ، تمت مقارنة الطريقة بطرق استخراج الغوانيديوم القياسية ثيوسيانات الفينول وكلوروفورم.

على الصعيد العالمي ، كانت مستويات التعبير hsp-70 mRNA لكل 100 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي قابلة للمقارنة باستخدام كل من طرق الفينول كلوروفورم والدودة إلى CT. ومع ذلك ، في حالات أعلى تعبير hsp-70 ، كان التعبير أعلى باستخدام طريقة الدودة إلى المعالجة المركزية ، مما يشير إلى تحسن الحساسية. بالنسبة لاستخراج غوانيديوم ثيوسيانات الفينول وكلوروفورم للعينات السائبة ، انخفض hsp-70 بمقدار 82.7 في طفرات HSF-1 مقارنة بالضوابط وبنسبة 92.3٪ للدفء إلى التصوير المقطعي المحوسب ، مما يشير إلى أن الانخفاض كان قابلا للمقارنة بين الطريقتين.

باستخدام (كدنا) التي تم الحصول عليها إما من عينات سائبة من 25 دودة أو من متوسط 36 عينة من الديدان المفردة ، اكتشفت الطرق مستويات تعبير قابلة للمقارنة لجميع المرافقين الذين تم اختبارهم ، مما يشير إلى أن المعلمات التي تم الحصول عليها من الديدان المفردة موثوقة. هنا ، يتم عرض متوسط التعبير عن نصوص hsp متعددة من الديدان المفردة بعد صدمة حرارية قصيرة. كما لوحظ ، يختلف التباين في التعبير عن النصوص اختلافا كبيرا عبر الجينات المختلفة.

لكل نسخة تم اختبارها باستخدام عينات دودة مفردة ، كانت المعاملات الفنية للتباين أقل من المعاملات البيولوجية للتباين ، مما يشير إلى أن التكرارات الثلاثية التقنية لم تكن مطلوبة لتقدير المعلمات عندما تم إجراء qPCR على ديدان مفردة. عند تنفيذ هذا البروتوكول ، من الضروري سحب كميات صغيرة بدقة وعدم عكس الأنابيب في شريحة الموائع النانوية. يمكن استخدام هذا البروتوكول للحصول على مجموعات كبيرة من بيانات RT-qPCR ، والتي يمكن بعد ذلك تصديرها ومعالجتها حسب الرغبة باستخدام البرامج النصية Excel أو R.